专利名称：一种诱导水稻系统防御反应产生的方法
技术领域：
本发明涉及一种稻瘟病菌基因的原核表达产物处理水稻根尖诱导水稻系统防御反应的方法，属于植物保护和生物技术领域。
背景技术：
植物与其病原菌共同进化了上百万年，自然选择促使植物产生了各种各样的识别和抗性机制来防止和限制病原菌侵染。植物进化的同时也促使病原菌基因进化以适应或抵抗植物防御反应使其侵染寄主达到致病的最终目的。系统防御反应是指防御反应的激活不只局限于病原菌侵植物的侵染点，而且植物自身未被病原菌侵染的部分也产生了防御反应。系统防御反应在增强植物抵抗病原菌方面具有很重要的作用。因此，研究植物系统防御反应可为进一步研究植物与病原菌互作机制提供理论依据，同时可为今后植物病害有效防治提供重要的参考依据。
发明内容
本发明的主要目的是为鉴定植物系统防御反应产生提供一种快速、简便和准确的方法。本发明实施例是这样实现的，一种稻瘟病菌基因的原核表达产物处理水稻根尖诱导水稻系统防御反应的方法，利用一定浓度的融合蛋白处理水稻根尖0.5cm处24h,苯胺蓝和DAB染色后观察除去0.5cm根尖以外的根组织的其他部位的胼胝质形成及活性氧产生情况。进一步，该基因的原核表达产物按照5.0mg/ml浓度处理黑谷根组织24h后进行苯胺蓝和DAB染色，荧光显微镜直接观察胼胝质和活性氧产生，根据胼胝质和活性氧产生确定水稻系统防御反应产生。进一步，将稻瘟病菌效应蛋白基因表达产物于4°C离心机离心收集菌体，用新鲜配制的缓冲液悬浮菌体；在冰水浴上进行超生破碎细胞后离心收集上清；处理是将该基因的原核表达产物纯化后按照5.0mg/ml的浓度处理抗病水稻品种丽江新团黑谷根尖0.5cm处24h，苯胺蓝和DAB直接染色进行胼胝质和活性氧观察。进一步，新鲜配制的缓冲液为20mM Tris-HCl, pH7.4 ；200mM NaCl ；lmM EDTA ；IOmM β-巯基乙醇。本发明的有益效果是利用稻瘟病菌基因的原核表达产物处理水稻根尖0.5cm处，通过观察根尖0.5cm以外根组织其他部分胼胝质和活性氧产生，可明确水稻系统防御反应产生的情况，克服了直接利用病原菌接种水稻叶片观察胼胝质和活性氧产生周期长且易受到叶片组织大量自发荧光干扰等弊端，最终达到为今后鉴定病原菌效应蛋白诱导植物系统防御反应产生提供简便有效的方法的目的。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明实施例是保持目前原核表达产物表达纯化、胼胝质及活性氧观察方法不变，包括原核表达技术、蛋白纯化技术、DAB染色、苯胺蓝染色方法均与常规相同，其特征是利用一定浓度的融合蛋白处理水稻根尖0.5cm处24h，苯胺蓝和DAB染色后观察除去0.5cm根尖以外的根组织的其他部位的胼胝质形成及活性氧产生情况。该基因的原核表达产物按照5.0mg/ml浓度处理水稻品种丽江新团黑谷根组织24h后进行苯胺蓝和DAB染色，荧光显微镜直接观察胼胝质和活性氧产生，根据胼胝质和活性氧产生确定水稻系统防御反应产生，这种通过观察未经蛋白处理的根尖以外的根组织其他部分根组织胼胝质和活性氧产生确定病原菌蛋白诱导植物系统防御反应产生的方法较为简便、准确、快速。实施例:5.0mg/ml的融合蛋白处理水稻根尖0.5cm处24h，苯胺蓝和DAB染色后直接观察根尖0.5cm以外的根组织的其他部分的胼胝质和活性氧产生情况。将稻瘟病菌效应蛋白基因表达产物于4°C离心机离心收集菌体，用新鲜配制的缓冲液(20mM Tris-HCl, pH7.4 ；200mM NaCl ；lmM EDTAlOmMβ -巯基乙醇)悬浮菌体。在冰水浴上进行超生破碎细胞后离心收集上清。处理是将该基因的原核表达产物纯化后按照
5.0mg/ml的浓度处理抗病水稻品种丽江新团黑谷根尖0.5cm处24h，苯胺蓝和DAB直接染色进行胼胝质和活性氧观察。对照是用PBS处理丽江新团黑谷根尖0.5cm处24h，苯胺蓝和DAB直接染色进行胼胝质和活性氧观察。结果发现丽江新团黑谷根尖0.5cm以外的根组织的其他部分均观察到了胼胝质和活性氧产生。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种稻瘟病菌基因的原核表达产物处理水稻根尖诱导水稻系统防御反应的方法，其特征在于，利用一定浓度的融合蛋白处理水稻根尖0.5cm处24h，苯胺蓝和DAB染色后观察除去0.5cm根尖以外的根组织的其他部位的胼胝质形成及活性氧产生情况。
2.如权利要求1所述的诱导水稻系统防御反应的方法，其特征在于，该基因的原核表达产物按照5.0mg/ml浓度处理黑谷根组织24h后进行苯胺蓝和DAB染色，荧光显微镜直接观察胼胝质和活性氧产生，根据胼胝质和活性氧产生确定水稻系统防御反应产生。
3.如权利要求2所述的诱导水稻系统防御反应的方法，其特征在于，将稻瘟病菌效应蛋白基因表达产物于4°C离心机离心收集菌体，用新鲜配制的缓冲液悬浮菌体；在冰水浴上进行超生破碎细胞后离心收集上清；处理是将该基因的原核表达产物纯化后按照5.0mg/ml的浓度处理抗病水稻品种丽江新团黑谷根尖0.5cm处24h，苯胺蓝和DAB直接染色进行胼胝质和活性氧观察。
4.如权利要求3所述的诱导水稻系统防御反应的方法，其特征在于，新鲜配制的缓冲液为 20mM Tris-HCl，ρΗ7.4 ；200mM NaCl ；lmM EDTA ；10mM β -巯基乙醇。
全文摘要
本发明公开了一种稻瘟病菌基因的原核表达产物处理水稻根尖诱导水稻系统防御反应的方法，利用一定浓度的融合蛋白处理水稻根尖0.5cm处24h，苯胺蓝和DAB染色后观察除去0.5cm根尖以外的根组织的其他部位的胼胝质形成及活性氧产生情况。本发明的有益效果是利用稻瘟病菌基因的原核表达产物处理水稻根尖0.5cm处，通过观察根尖0.5cm以外根组织其他部分胼胝质和活性氧产生，可明确水稻系统防御反应产生的情况，克服了直接利用病原菌接种水稻叶片观察胼胝质和活性氧产生周期长且易受到叶片组织大量自发荧光干扰等弊端，最终达到为今后鉴定病原菌效应蛋白诱导植物系统防御反应产生提供简便有效的方法的目的。
文档编号G01N21/64GK103175809SQ201210554679
公开日2013年6月26日 申请日期2012年12月5日 优先权日2012年12月5日
发明者杨静, 李成云, 刘林, 朱有勇, 赵婧, 徐畅, 施竹凤 申请人:云南农业大学