本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及与甲状腺结节相关的基因体细胞特异性突变位点及其应用。
背景技术：
：甲状腺结节是临床最常见的一种甲状腺疾病，触诊可以的发现的甲状腺结节的患病率在美国成年人群中约为4-7％。而应用敏感的甲状腺b检查，在65岁以上人群中，甲状腺结节的患病率高达50％以上。我国2010年由中华医学会内分泌协会滕卫平教授牵头进行的全国十城市15,181居民的甲状腺疾病流行病学调查的研究结果发现，我国人群中甲状腺结节的患病率高达18.6％，因此推测我们国家的甲状腺结节的患者高达2亿人。大多数甲状腺结节是良性的，可以采取保守治疗，但有5-10％的甲状腺结节是恶性的，需要早期手术治疗，才能获得良好的预后。因此，一个甲状腺专科的医生，面对的巨大挑战就是如何鉴别病人的甲状腺结节的良性和恶性，只有这样，才能使病人获得及时合理的治疗。如果大量的不需要手术的甲状腺良性结节，不适当地给予手术治疗，这样大的人群患病率，将会产生巨大的医保负担；反之，如果不能从大量的良性结节中识别鉴定真正的恶性肿瘤，将延缓对这些病人的治疗，危及患者的生命健康。目前临床上常用的甲状腺结节良恶性鉴别的手段主要有甲状腺b超、核素扫描及甲状腺结节细针穿刺病理活检(fine-needleaspirationbiopsy，fnab)。其中，甲状腺细针穿刺细胞学活检是目前甲状腺结节良恶性鉴别诊断的金标准。根据美国国家癌症研究所2008年的甲状腺细针穿刺病理学的专题会议的指南，目前将甲状腺结节穿刺细胞学诊断分成以下几类：1.因穿刺甲状腺细胞数量不足，无法诊断；2.良性结节；3.病理细胞学无法确诊的结节；4.恶性甲状腺结节四类。近年来，随着b超引导下进行细针穿刺的广泛应用，那种因穿刺获得的细胞数量不足，无法诊断的病人的比例明显减少，从以前的高达15％，降到目前的7％以下。在细针穿刺获得足够的甲状腺滤泡细胞后，大多数的甲状腺结节的良恶性均能通过细胞病理学的诊断方法获得正确的诊断。但即使目前国际上最好的甲状腺细胞病理诊断的实验室，也有20-40％穿刺成功的甲状腺结节不能确定其良恶性，即病理学无法确诊的结节。因此，在病人进行甲状腺穿刺病理活检时，因穿刺失败和病理不能判断良恶性从而无法给患者进行正确诊断的比例高达30-50％，受各中心的甲状腺病理诊断医师和穿刺医师的技术水平影响较大。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种甲状腺癌发病的致病基因突变位点及其应用。本发明的第一方面，提供了选自下组(i)中的一个或多个基因突变位点和/或其检测试剂的用途，用于制备试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒用于鉴别甲状腺结节的良恶性，所述组(i)包括以下基因突变位点：gnas基因：nm_001077490:exon1:c.t1019c；nras基因：nm_002524:exon3:c.t284c；tshr基因：nm_000369:exon10:c.a2098g。在另一优选例中，所述组(i)还包括以下基因突变位点：chek2基因：nm_145862:exon11:c.a1250g。在另一优选例中，所述组(i)还包括以下基因突变位点：pik3ca基因：nm_006218:exon12:c.1818位缺失c。在另一优选例中，所述组(i)还包括以下基因突变位点：gnas基因：nm_016592:exon1:c.c205a、nm_016592:exon1:c.c216t。在另一优选例中，所述组(i)还包括以下基因突变位点：tshr基因：nm_000369:exon10:c.a2252g。在另一优选例中，所述组(i)还包括以下基因突变位点：braf基因：nm_004333:exon15:c.t1799a。在另一优选例中，被检测对象包括：人或非人哺乳动物(如家畜、家禽、实验动物等)。在另一优选例中，所述的试剂包括引物、探针、芯片、或抗体。在另一优选例中，所述的试剂盒含有一种或多种选自下组的试剂：(a)用于基因检测的特异性引物；(b)用于基因检测的特异性探针；(c)用于基因检测的芯片；(d)用于检测突变的基因所对应的氨基酸突变的特异性抗体。在另一优选例中，所述试剂或试剂盒用于实时荧光定量pcr检测。在另一优选例中，所述实时荧光定量pcr中，退火温度为60-67℃之间，pcr扩增产物长度为80-300bp。在另一优选例中，所述实时荧光定量pcr中，荧光探针退火温度为60-70℃之间。在另一优选例中，所述探针的双末端进行化学基团的修饰，5'端修饰有荧光激发基团，3端修饰有荧光淬灭基团。在另一优选例中，所述检测为辅助性检测。本发明的第二方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括选自下组的一个或多个基因突变位点的检测试剂：gnas基因：nm_001077490:exon1:c.t1019c；nras基因：nm_002524:exon3:c.t284c；tshr基因：nm_000369:exon10:c.a2098g。在另一优选例中，所述试剂盒还包括以下基因突变位点的检测试剂：chek2基因：nm_145862:exon11:c.a1250g。在另一优选例中，所述试剂盒还包括以下基因突变位点的检测试剂：pik3ca基因：nm_006218:exon12:c.1818位缺失c。在另一优选例中，所述试剂盒还包括选自下组的一个或多个基因突变位点的检测试剂：gnas基因：nm_016592:exon1:c.c205a、nm_016592:exon1:c.c216t。在另一优选例中，所述试剂盒还包括以下基因突变位点的检测试剂：tshr基因：nm_000369:exon10:c.a2252g。在另一优选例中，所述试剂盒还包括选自下组的一个或多个基因突变位点的检测试剂：braf基因：nm_004333:exon15:c.t1799a、nm_004333:exon11:c.g1338a、nm_004333:exon15:c.a1801g；chek2基因：nm_145862:exon10:c.c1024t；nras基因：nm_002524:exon3:c.c181a、nm_002524:exon3:c.a182g；akt1基因：nm_001014431:exon3:c.g49a；ppm1d基因：nm_003620:exon1:c.c262t；pten基因：nm_000314:exon5:c.c328t；ret基因：nm_020630:exon11:c.t1888c、nm_020630:exon16:c.t2753c；tp53基因：nm_001126115:exon3:c.c265t、nm_000546:exon8:c.g814t。在另一优选例中，所述试剂盒还包括选自下组的一个或多个融合基因的检测试剂：etv6-ntrk3融合基因：etv6{enst00000396373}:r.1_737_ntrk3{enst00000394480}:r.1719_19984；ncoa4-ret融合基因：ncoa4{enst00000452682}:r.1_1014_ret{enst00000355710}:r.2369_5659；ccdc6-ret融合基因：ccdc6{enst00000263102}:r.1_535_ret{enst00000355710}:r.2369_5659。在另一优选例中，所述的检测试剂为：(a)用于基因检测的特异性引物；(b)用于基因检测的特异性探针；(c)用于基因检测的芯片；(d)用于检测突变的基因所对应的氨基酸突变的特异性抗体。本发明的第三方面，提供了一种体外检测样品是否存在基因突变的方法，包括步骤：(a)用特异性引物扩增样品的多核苷酸，得到扩增产物；和(b)检测扩增产物中是否存在以下一个或多个基因突变：gnas基因：nm_001077490:exon1:c.t1019c、nm_016592:exon1:c.c205a、nm_016592:exon1:c.c216t；nras基因：nm_002524:exon3:c.t284c；tshr基因：nm_000369:exon10:c.a2098g、nm_000369:exon10:c.a2252g。在另一优选例中，所述检测为非诊断性的。在另一优选例中，所述步骤(b)中还包括检测扩增产物中是否存在以下基因突变：chek2基因：nm_145862:exon11:c.a1250g。在另一优选例中，所述步骤(b)中还包括检测扩增产物中是否存在以下基因突变：pik3ca基因：nm_006218:exon12:c.1818位缺失c。如果具有一个或多个基因位点，则说明该甲状腺结节为恶性。在另一优选例中，所述样本来自于人。本发明的第五方面，提供了一种分离的基因多核苷酸序列，所述的多核苷酸序列为衍生自选自下组的基因的片段：nras基因、gnas基因、pik3ca基因、chek2基因、和tshr基因，且所述的核苷酸序列分别具有选自下组的基因突变位点：nras基因：nm_002524:exon3:c.t284c；gnas基因：nm_001077490:exon1:c.t1019c、nm_016592:exon1:c.c205a、nm_016592:exon1:c.c216t；pik3ca基因：nm_006218:exon12:c.1818位缺失c；chek2基因：nm_145862:exon11:c.a1250g；tshr基因：nm_000369:exon10:c.a2098g、nm_000369:exon10:c.a2252g。在另一优选例中，所述多核苷酸序列长度为30-1000bp；优选为50-500bp。本发明还提供了多核苷酸序列的用途，所述的序列可用作阳性对照(标准品)。本发明的第六方面，提供了选自下组的一个或多个或全部基因和/或其检测试剂的用途，用于制备试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒用于鉴别甲状腺结节的良恶性：akt1基因、braf基因、chek2基因、gnas基因、nras基因、pik3ca基因、ppm1d基因、pten基因、ret基因、tp53基因、tshr基因、etv6-ntrk3融合基因、ncoa4-ret融合基因、和ccdc6-ret融合基因。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。具体实施方式本发明人通过广泛而深入的研究，意外地获得一组与甲状腺癌致病基因的突变位点，实验结果表明，本发明提供的基因突变位点能够作为鉴别甲状腺结节良恶性的标志物。在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。在本领域中，如何在术前对这些甲状腺结节进行正确的诊断，从而给病人一个合理及时的治疗，一直是甲状腺研究领域的热点。随着分子生物学技术的进展，分子诊断在甲状腺结节良恶性的鉴别诊断中，逐渐受到人们的关注。结节良恶性分子鉴别诊断的理论基础是基于有些甲状腺癌的致病基因，只在癌症病人的癌组织中发生特异性的体细胞突变或融合基因的出现，这种突变或新融合基因在患者的正常细胞及非甲状腺癌患者的甲状腺组织中是不存在的。因此，这些分子标志，在甲状腺癌的良恶性鉴别鉴别诊断中，具有非常特异的。如人们发现在带有braf基因上第600位氨基酸的val600glu突变的甲状腺结节100％的病人是恶性结节。虽然这些基因突变在甲状腺结节良恶性鉴别诊断中有非常好的特异性，但每一致病基因在甲状腺癌病人中的突变频率是不高的，因此，单靠这样对单个基因的分子突变进行检测，阳性病人有重要的诊断意义，但阴性病人会漏诊许多真正的甲状腺癌患者，耽误病人的治疗。因此要解决甲状腺癌分子诊断这一困境，需要对导致甲状腺癌的多个基因同时进行突变检测，才能够提高甲状腺结节良恶性鉴别诊断的特异性，降低假阴性率。但是，要想在甲状腺结节样本中，同时进行多个甲状腺癌特异性致病基因的体细胞突变和新的融合基因的检测，需要突破以下几个方面的科学和技术难点，才能达到临床应用的目的：第一：虽然文献报道大量的甲状腺癌的致病基因突变，但在这些报道的突变基因中，哪些是真正的致病基因，哪些不是甲状腺癌的致病，这些问题是不清楚的。其次，在目前报道的甲状腺癌致病基因中，哪些基因的组合在甲状腺结节鉴别诊断中阳性率高，而阴性漏诊的可能性小，是目前不知道。找到这样的一群甲状腺癌致病基因的组合，将在甲状腺结节良恶性鉴别中非常重要的。第二：由于甲状腺癌的致病基因的变异(突变和融合基因)均是在甲状腺癌细胞内的体细胞突变，因此必须通过细针穿刺获取甲状腺结节细胞才能进行诊断，而细针穿刺的细胞数量很少(一般细胞数在10-200个)，要想在如此少的细胞中，进行大量基因突变和融合基因的检测，用传统的一代测序是不可能的。须采用的新的检测技术才能，完成组合型标志的分子诊断方法的建立。第三：由于甲状腺癌中基因变异主要包括两大类，一类是基因体细胞突变；另一类是肿瘤细胞中出现新的融合基因。传统的检测这两类变异方法，分别依赖样本的dna和mrna。需要采集两次最够量的甲状腺结节组织。这在临床常规诊断中执行困难，因此，如何能利用同一次少量的活检样本，进行大量这些基因变异的检测，是组合型分子标志走向实际应用的瓶颈。因此，本发明主要是针对上述3个甲状腺结节分子诊断的瓶颈来进行的,主要具有以下的独创性:首先，选择目前发现的19个甲状腺乳头状癌的致病基因、8个不同的融合基因，以及未分化癌和差分化癌中常见tp53、ctnnb1基因和甲状腺髓样癌中的ret基因，作为分子标志，通过对这些变异区段的cdna的靶向扩增，结合二代测序技术，在甲状腺癌和甲状腺瘤或正常甲状腺组织中，进行基因突变和融合基因检测，发现这一群组合型分子标志，在中国甲状腺癌人群中总的阳性率高达81％，是一群具有很好诊断价值的分子标志物。其中最常见突变的11个核心基因和8个不同的融合基因的组合，可以使诊断的阳性率高达93％以上。其次,基于fludigam公司的靶基因多重pcr扩增芯片技术，开发了一套特异性的组合的多重靶基因扩增的技术，解决了在微量样本中，同时进行多个基因的靶向扩增的方法；同时对多重pcr引物，通过二代测序技术，从而明确每一个样本中，每一个基因特定基因的突变或新的融合基因是否存在。解决在微量样本中，同时对多个基因变异的检测的技术瓶颈。另外，本发明选择mrna作为进行靶基因扩增的对象进行组合型分子标志的基因变异检测的样本，实现了在同一个样本即对基因突变进行检测，又对融合基因进行检测的目的，是该发明在临床应用成为可能。同时，以mrna为模板进行基因变异的检测，有可以评价穿刺样本的质量，对诊断的可靠性进行客观的评价。可以应用多种分子标志物的组合对甲状腺结节良恶性进行鉴别，如应用brafv600e,ras和ret/ptc1,ret/ptc3,以及pax8/ppar融合基因等作为分子标志，可以明显增加甲状腺结节良恶性鉴别诊断的能力。这种组合性分子标志用于甲状腺结节良恶性鉴别诊断的敏感性可以达到62％，特异性可以达到99.7％；如与病理细胞学诊断联合应用，可以使甲状腺结节良恶性鉴别的敏感性，从单用病理细胞学诊断的44％提高到80％。而造成这种分子标志物诊断敏感性不高的主要原因，是目前还没有发现所有的甲状腺的致病基因，上述常见甲状腺癌的致病基因，在甲状腺癌患者中，不同基因间互相排斥的突变频率大多在70％左右，因此，用目前常见的致病基因的热点位点的组合，作为分子标志，进行甲状腺结节良恶性的鉴别诊断具有较大的局限性。要想提高分子标志物诊断的敏感性，首先要找到甲状腺癌致病的基因或分子标志。按照2008年美国癌症研究所甲状腺细胞学诊断标准，目前将甲状腺癌分为乳头状癌(目前将滤泡状癌分在这类病理类型中，归为变异性乳头状癌的一种)、差分化癌、未分化癌和甲状腺髓样癌四种，其中最常见的是甲状腺乳头状细胞癌，约占所有甲状腺癌的95％以上。不同的甲状腺癌中，致病的基因可能不同，且同一个致病基因在不同类型的甲状腺癌中的突变频率也不同。如甲状腺乳头状癌中常见的突变基因是braf基因，而差分化和未分化癌中，tp53基因是高频的突变基因，在未分化癌中50％以上的病人携带tp53基因突变，但在甲状腺乳头状癌中，很少发现有p53基因的突变。而甲状腺髓样癌患者中ret基因的突变是非常常见的，如在家族性髓样癌中，该基因的突变率高达95％，在散发性甲状腺髓样癌中，ret基因的突变率也有40-50％。2014年发表在cell上的一篇大样本甲状腺乳头状癌的全基因组外显子测序的研究，为应用组合性分子标志进行甲状腺结节良恶性的鉴别诊断提供了令人兴奋的前景。他们通过对496例甲状腺乳头状癌的全基因组外显子测序，发现5个甲状腺癌的致病基因，其中包括3个可能新的甲状腺癌致病基因；并发现了8个基因与其它不同基因形成的各种类型的融合基因变异。在这些甲状腺癌中，至少带有这5个致病基因中一个以上基因突变的样本占73.6％，发现带有致病基因突变或融合基因变异中一个以上变异的样本占89.8％。还有10％左右的甲状腺癌中，既没有这5个致病基因的点突变，也没有发现的融合基因变异。他们随后通过snp芯片等技术，对这些肿瘤样本中染色体的扩增缺失变异进行分析，发现染色体区段的大片段扩增和缺失(arm-level的染色体变异)在甲状腺癌样本中非常常见，其中22q的染色体缺失约在14.4％甲状腺癌病人发生，而1q染色体的大片段扩增占14.8％。如果将这些染色体arm-level水平的扩增和缺失变异，作为分子标志，将使带有致病基因突变、融合基因变异或arm-level的染色体扩增缺失三类变异中至少一种变异的病人增加到96.6％。这表明，如果我们能够用这三类不同的变异，对甲状腺结节进行分子诊断的话，将可能是诊断的敏感性达到95％以上，这将是目前甲状腺结节良恶性鉴别诊断的所有手段中最可靠的诊断方法。新的分子生物学技术靶基因的多重pcr扩增结合二代测序的出现，使得利用甲状腺穿刺细胞中提取的少量rna为模板，同时检测多种基因变异成为可能，从而使组合性分子标志的检测变得简单、容易操作，同时又不至于漏检可能存在的基因突变。fluidigm公司的靶向扩增芯片可对多种突变基因靶向扩增并进行二代测序建库，一块芯片可同时对48个样本的450到1500对引物进行pcr扩增，满足甲状腺癌这些分子标志诊断的需求。因此，本发明采用fluidigm公司的靶基因多重pcr扩增芯片技术，选择目前发现19个甲状腺乳头状癌的致病基因、8个不同的融合基因，以及未分化癌和差分化癌中常见tp53、ctnnb1基因和甲状腺髓样癌中的ret基因，作为分子标志，通过对这些变异区段的cdna的靶向扩增，结合二代测序技术，识别甲状腺结节中是否存在这些分子标志的变异，从而进行甲状腺结节良恶性的鉴别诊断。最终发现了一批新的恶性甲状腺结节相关的基因多态性位点，具体信息如表1所示。表1基因名称突变位点brafnm_004333:exon15:c.t1799achek2nm_145862:exon11:c.a1250g:p.n417sgnasnm_001077490:exon1:c.t1019c:p.l340pgnasnm_016592:exon1:c.c205a:p.h69ngnasnm_016592:exon1:c.c216t:p.g72gnrasnm_002524:exon3:c.t284c:p.l95ppik3canm_006218:exon12:c.1818delc:p.y606fstshrnm_000369:exon10:c.a2098g:p.k700etshrnm_000369:exon10:c.a2252g:p.k751r表1中基因序列编号参照grch37/hg19版本。braf基因braf基因编码的蛋白属于丝氨酸/苏氨酸激酶raf家族。在mapk/erks通路中发挥调节作用，参与细胞分裂、分化及分泌等。braf基因突变被认为与多种癌症的发生有关，包括非霍奇金淋巴瘤、结直肠癌、恶性黑色素瘤、甲状腺癌及非小细胞肺癌。另外，研究表明braf基因突变与心脸皮肤综合征有关。第1799位发生突变的braf基因(nm_004333)的序列片段如下：cctcacagtaaaaataggtgattttggtctagctacag[t/a]gaaatctcgatggagtgggtcccatcagtttgaacagttgt(seqidno.1)在本发明的一个优选地实施方式中用于检测braf基因1799位突变位点的引物对如下：braf-e15-fggagccttgtatatagacggseqidno.2braf-e15-rtgtatgttctaacaggcaccseqidno.3nras基因nras基因为致癌基因，其编码的膜蛋白可穿梭于高尔基体与细胞膜之间。nras蛋白具有内在的gtp酶活性，可分别被鸟嘌呤核苷酸交换因子激活及被gtp酶活化蛋白所抑制。位于nras上的点突变被认为与体细胞直肠癌、滤泡型甲状腺癌、自身免疫性淋巴增生综合征、noonan综合征以及白血病的发生有关.第284位发生突变的nras基因(nm_002524)的序列片段如下：atagcaagtcatttgcggatattaacctc[t/c]acagggagcagattaagcgagtaaaagact(seqidno.4)在本发明的一个优选地实施方式中用于检测nras基因284位突变位点的引物对如下：nras-e3-fcaagaaaccatatgctcaccseqidno.5nras-e3-rttggattgtgtccgttgagcseqidno.6gnas基因gnas是一个蛋白编码基因，相关的信号通路为g蛋白偶联受体(gpcr)信号通路及多肽配体结合受体信号通路，参与腺苷酸环化酶的激活及多种细胞反应。该基因有多种转录版本。gnas基因突变与假性甲状旁腺功能减退症、遗传性骨营养不良症、mccune-albright综合征、进展性骨发育异常、多骨性纤维性结构不良以及一些垂体肿瘤相关。第1019位发生突变的gnas基因(nm_001077490)的序列如下：gcccaacagcgccggagcttccttaacgcccac[c/a]accgctccggcgcccaggtattccctgagtcccccg(seqidno.7)在本发明的一个优选地实施方式中用于检测gnas基因1019位突变位点的引物对如下：gnas-e1-1-fagaggccgccaccgtgttatseqidno.8gnas-e1-1-raggcctcgccatcattctcseqidno.9tshr基因tshr基因编码的蛋白为膜蛋白，主要参与甲状腺细胞的代谢，是促甲状腺素的受体，可被腺苷酸环化酶激活。与tshr相关的疾病有先天性甲状腺功能减退症及非自身免疫性甲状腺功能亢进症。第2252位发生突变的tshr基因(nm_000369)的序列片段如下：tgaactgattgaaaactcccatctaaccccaaaga[a/g]gcaaggccaaatctcagaagagtatatgcaaacggttttgtaag(seqidno.10)在本发明的一个优选地实施方式中用于检测tshr基因2252位突变位点的引物对如下：tshr-e10-faggcaactatgttgagcgtcseqidno.11tshr-e10-rtatgccatcaccttcgccatseqidno.12chek2基因在细胞周期中调控细胞周期进程对dna损伤与复制中发挥至关重要的作用。chek2基因编码的蛋白为细胞周期检查调节器，被认为是抑癌基因。此基因突变与li-fraumeni综合征,一种携带tp53突变的家族性的高聚集性的癌症表型。另外，携带此基因突变有发生肉瘤、乳腺癌及脑肿瘤倾向。第1250位发生突变的chek2基因(nm_145862)的序列片段如下：gaaggatcagatcaccagtggaaaataca[a/g]cttcattcctgaagtctgggcagaagtctcagagaaag(seqidno.13)在本发明的一个优选地实施方式中用于检测chek2基因1250位突变位点的引物对如下：chek2-e11-ftcccaccacagcacatacacseqidno.14chek2-e11-rcttttcctttctctctctaccseqidno.15pik3ca基因pik3ca基因为致癌基因，属于pi3ks家族，负责协调各种不同的细胞功能包括生存及增殖，其基因突变与宫颈癌等肿瘤的发病有关。第1818位发生突变的pik3ca基因(nm_006218)的序列如下：ctgaacaggctatggaacttctggactgtaatta[c/-]ccagatcctatggttcgaggttttgctgttcggtg(seqidno.16)在本发明的一个优选地实施方式中用于检测pik3ca基因1818位突变位点的引物对如下：pik3ca-e12-fcacaaactagagtcacacacseqidno.17pik3ca-e12-rgcacgattcttttagatctgseqidno.18本发明的主要优点在于：(1)首次揭示一组能够作为鉴别甲状腺结节良恶性的标志物的基因多态性位点，特异性高；(2)根据本发明的分子标志(突变的基因位点)组合，针对中国甲状腺癌人群具有很好诊断价值，可以使诊断的阳性率高达90％以上。(3)在收集临床病人样本时，只需收集甲状腺结节穿刺细胞，抽提rna作为模板，可同时检测基因突变及融合基因，临床可行性较好。下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国sambrook.j等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。方法本发明提供一种鉴别甲状腺结节良恶性的靶向基因二代测序的检测方法，并根据甲状腺结节的分子诊断结果确定患者合适的术式及术后管理。具体地，本发明提供了一种针对甲状腺结节鉴别诊断的靶向基因二代测序的检测方法，包括以下步骤：步骤(1)：获得已知可能导致甲状腺癌的相关基因信息；步骤(2)：通过ucsc和ncbi数据库导出基因序列以及编码信息；步骤(3)：使用massarrayassaydesign软件对这些基因进行aa芯片引物设计；步骤(4)：aa芯片实验大致步骤(可分为5步)；①上样：用排枪将96孔板里引物和模板吸到48.48accessarrayifc芯片上。②装载：将芯片放进pre-pcrifccontrollerax仪器里，引物和模板自动混合。③热循环：利用fc1cycler仪器进行pcr扩增反应。④收获：利用post-pcrifccontrollerax仪器进行pcr产物汇集和收获。⑤恢复：用排枪将芯片模板上样处pcr产物吸出。步骤(5)：利用bwa,samtools和gatk软件对测序结果进行分析。步骤(6)：所有测得的snv以及indel经过annovar(http://annovar.openbioinformatics.org/)功能注释和公共数据库(exac,1000genomes,dbsnpandclinvar)过滤。步骤(7)：符合①双复孔snv,alldepth>20,vaf>0.3；②单孔snv,alldepth>1000,vaf>0.4；③双复孔snv,单孔测的不好，复孔测的好的(alldepth>1000)标准的snv经sanger测序进行证实。步骤(8)：符合①双复孔indel,除去snp；②单孔indel,alldepth>25,vaf≥0.4,除去snp标准的indel经sanger测序进行证实。较佳地，panel中包含与甲状腺癌发病有关的19个基因、8个融合基因及相关内参基因，具体如下：检测19个基因的snv:braf,hras,nras,kras,eif1ax,ppm1d,chek2,ret,ctnnb1,tp53,akt1,gnas,pik3ca,pten,tshr,cdkn2a,axin1,idh1,vhl检测8个融合基因：ccdc6/ret,ncoa4/ret,etv6/ntrk3,strn/alk,pax8/pparg,tpm3/ntrk3,eml4/alk,prkar1a/ret甲状腺特异基因及内参基因：tg,tpo,gapdh,β-actin，18srrna,28srrna，tublin,rplpo(人类大核糖体蛋白),tfrc(转铁蛋白受体)较佳地，所述的用于accessarraytmsystem扩增的引物设计软件为massarrayassaydesign。较佳地，所述的靶向测序后的数据分析软件为bwa,samtools和gatk.。较佳地，筛选snv的标准为①双复孔snv,alldepth>20,vaf>0.3；②单孔snv,alldepth>1000,vaf>0.4；③双复孔snv,单孔测的不好，复孔测的好的(alldepth>1000)。较佳地，筛选indel的标准为①双复孔indel,除去snp；②单孔indel,alldepth>25,vaf≥0.4,除去snp。本发明适用于甲状腺结节良恶性鉴别诊断的明确，弥补了该领域的不足与缺失，根据可能导致甲状腺癌发病的突变基因及融合基因，通过accessarraytmsystem建立组合性panel进行靶向基因的二代测序。通过初步对123个甲状腺癌患者的二代测序、数据分析以及sanger测序验证，19个基因中有11个基因测到突变，包括热点突变brafv600e，nras:q61r,q61k,retm918t,pten,tshr,tp53及akt1,融合基因检测到etv6-ntrk3,ncoa4-ret和ccdc6-ret。此次组合性分子标志物应用在123例甲状腺癌患者中的诊断率极高。而且发现在多例患者中出现多个致病基因出现突变或同时存在驱动基因突变及融合基因的情况，说明甲状腺癌的发病是多种基因改变累积造成的，且具有肿瘤异质性，进一步证实对于此类疾病进行精准医学诊断的必要性。本发明适用于临床甲状腺结节的良恶性鉴别诊断，可以进行高通量检测，并进行临床推广，有助于全面选择患者的治疗方案，充分弥补弥补该领域的不足与缺失，十分具有实用价值。综上所述，本项目的结果证实基于二代测序技术基础上的组合性分子标志物在甲状腺结节的良恶性诊断中发挥重要作用。包涵大多数甲状腺癌致病基因的组合性分子标志物的靶向二代测序可提高甲状腺恶性肿瘤的诊断率，成功的弥补了目前甲状腺细胞学诊断的不足，并指导甲状腺结节患者的诊疗得以完善，避免了非必须的诊断性手术对社会的医疗资源的浪费及病患手术的潜在风险。同时，本研究的结果为基因诊断在临床实践中发挥作用提供了新的思路。实施例1甲状腺结节良恶性相关的基因多态性位点的筛选和鉴定样本说明：甲状腺细针穿刺细胞，抽提rna,反转录得到cdna文库。具体实施步骤：步骤(1)：根据可能的甲状腺癌致病基因，包括突变基因及融合基因，根据ucscgenomebrowser中grch37/hg19中的基因序列，明确基因在染色体位置、编码、基因大小以及假基因情况等。步骤(2)：根据accessarraytmsystem扩增的要求(目标序列大小240bp,存在重叠)，设计引物，并加入标签序列。步骤(3)：引物合成后，进行稀释，按accessarraytmsystem扩增要求，配制引物混合物，分于96孔板。步骤(4)：扩增模板的制备,定量到50ng/ul(不足50ng/ul以50ng/ul记)，配制模板混合物，分于96孔板。步骤(5)：用排枪将96孔板里引物和模板吸到48.48accessarrayifc芯片上。步骤(6)：将芯片放进pre-pcrifccontrollerax仪器里，引物和模板自动混合，并利用fc1cycler仪器进行pcr扩增反应。步骤(7)：利用post-pcrifccontrollerax仪器进行pcr产物汇集和收获(注意收获时需要更换房间操作，以防污染)步骤(8)：准备barcode混合物加入1：100稀释产物，进行pcr反应。步骤(9)：磁珠纯化产物，跑胶确认barcode加上后，准备上机测序。步骤(10)：nextseq500上机测序，利用bwa,samtools和gatk软件对下机数据进行分析。步骤(11)：所测得的snv以及indel经过annovar(http://annovar.openbioinformatics.org/)功能注释和公共数据库(exac,1000genomes,dbsnpandclinvar)过滤。步骤(12)：符合①双复孔snv,alldepth>20,vaf>0.3；②单孔snv,alldepth>1000,vaf>0.4；③双复孔snv,单孔测的不好，复孔测的好的(alldepth>1000)标准的snv经sanger测序进行证实。步骤(13)：符合①双复孔indel,除去snp；②单孔indel,alldepth>25,vaf≥0.4,除去snp标准的indel经sanger测序进行证实。本发明适用于甲状腺结节良恶性鉴别诊断的分子检测，弥补了该领域的不足与缺失，其原理为本发明在目前已报道的甲状腺癌发病相关致病基因中，通过massarrayassaydesign软件设计引物，在48.48accessarrayifc上，进行靶向基因多重pcr扩增后，进行二代测序分析，使针对该疾病的高通量更大覆盖面的基因诊断成为可能。通过对123例患者的研究，发现19个基因中有11个基因测到突变(表2)，检测到3种融合基因(表3)，包含了115种突变，诊断率高于93％。进一步可将更多的中国人群中甲状腺癌的驱动基因及融合基因汇聚在一个诊断panel中，可以更高效、快速地进行大量样本的基因检测。本发明十分适用于中国人群甲状腺结节患者，可弥补该领域的不足与缺失，十分具有实用价值。表2表3融合基因名称序列信息突变患者数etv6-ntrk3etv6{enst00000396373}:r.1_737_ntrk3{enst00000394480}:r.1719_1998410ncoa4-retncoa4{enst00000452682}:r.1_1014_ret{enst00000355710}:r.2369_56593ccdc6-retccdc6{enst00000263102}:r.1_535_ret{enst00000355710}:r.2369_56592对本发明的基因突变的组织特异性进行了分析，结果表明，本发明的各突变位点具有优异的组织特异性，突变特异性的在甲状腺癌组织中有检出，在正常体细胞中很少有检出，仅在1例甲状腺腺瘤中检测到有nras基因上的q61k的突变。值得注意的是，虽然甲状腺腺瘤是良性疾病，但腺瘤的病理形态有时和甲状腺乳头状癌很相似，因此单靠病理有时可能发生诊断误差，具体结果如下表4所示：表4ta,甲状腺腺瘤(thyroidadenoma)ng,结节性甲状腺肿(nodulargoiter)ptc,甲状腺乳头状癌(papillarythyroidcarcinoma)ftc,甲状腺滤泡癌(follicularthyroidcarcinoma,包含在ptc中)mtc,甲状腺髓样癌(medullarythyroidcarcinoma)pdtc,低分化甲状腺癌(poorlydifferentiatedthyroidcancer)atc,未分化甲状腺癌(anaplasticthyroidcarcinoma)实施例2试剂盒的制备和效果验证本实施例提供了一种检测甲状腺结节良恶性的试剂盒。本试剂盒可对上表2中的突变位点和上表3中的融合基因进行基因突变检测：试剂盒主要试剂：(1)多态位点扩增引物上游引物(f)和下游引物(r)(massarrayassaydesign软件设计)；(2)多态位点测序引物测序引物(s)(根据本领域常规方法设计)；(3)pcr主要试剂：pfu高保真酶，10×pcrbuffer，dntpmixtur，ddh2o；(4)焦磷酸测序主要试剂：70％乙醇溶液，磁珠，变性缓冲液，退火缓冲液，结合缓冲液，洗涤缓冲液，底物(asp,荧光素)，酶混合溶液(dna聚合酶、荧光素酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、三磷酸腺苷双磷酸酶)，a/t/c/g碱基。使用本实施例提供的试剂盒，对300例甲状腺结节患者进行检测，具体方法参考实施例1，共检出了176例患者携带本发明的基因突变，最后通过临床常规方法确认甲状腺癌患者为184例，检出率高达95％以上，具体检测结果见表5。表5300例甲状腺癌患者靶向基因二代测序的结果在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>上海安甲生物科技有限公司<120>与甲状腺癌相关的基因多态性位点及其应用<130>p2017-0424<160>18<170>patentinversion3.5<210>1<211>80<212>dna<213>人<220><221>misc_feature<222>(39)..(39)<223>n=t,或a<400>1cctcacagtaaaaataggtgattttggtctagctacagngaaatctcgatggagtgggtc60ccatcagtttgaacagttgt80<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2ggagccttgtatatagacgg20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3tgtatgttctaacaggcacc20<210>4<211>60<212>dna<213>人<220><221>misc_feature<222>(30)..(30)<223>n=t，或c<400>4atagcaagtcatttgcggatattaacctcnacagggagcagattaagcgagtaaaagact60<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5caagaaaccatatgctcacc20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6ttggattgtgtccgttgagc20<210>7<211>69<212>dna<213>人<220><221>misc_feature<222>(34)..(34)<223>n=c，或a<400>7gcccaacagcgccggagcttccttaacgcccacaccgctccggcgcccaggtattccctg60agtcccccg69<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<400>8agaggccgccaccgtgttat20<210>9<211>19<212>dna<213>人工序列<400>9aggcctcgccatcattctc19<210>10<211>80<212>dna<213>人<220><221>misc_feature<222>(36)..(36)<223>n=a，或g<400>10tgaactgattgaaaactcccatctaaccccaaagangcaaggccaaatctcagaagagta60tatgcaaacggttttgtaag80<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列<400>11aggcaactatgttgagcgtc20<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列<400>12tatgccatcaccttcgccat20<210>13<211>68<212>dna<213>人<220><221>misc_feature<222>(30)..(30)<223>n=a,，或g<400>13gaaggatcagatcaccagtggaaaatacancttcattcctgaagtctgggcagaagtctc60agagaaag68<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列<400>14tcccaccacagcacatacac20<210>15<211>21<212>dna<213>人工序列<400>15cttttcctttctctctctacc21<210>16<211>70<212>dna<213>人<220><221>misc_feature<222>(35)..(35)<223>n=c,或无<400>16ctgaacaggctatggaacttctggactgtaattanccagatcctatggttcgaggttttg60ctgttcggtg70<210>17<211>20<212>dna<213>人工序列<400>17cacaaactagagtcacacac20<210>18<211>20<212>dna<213>人工序列<400>18gcacgattcttttagatctg20当前第1页12