特异性抑制hb-egf促肿瘤细胞迁移浸润的多肽的制作方法
【专利摘要】本发明公开了特异性抑制HB?EGF促肿瘤细胞迁移浸润的多肽，属于生物医药技术领域；本发明以肝素结合表皮生长因子(HB?EGF)为靶分子，经三轮噬菌体展示技术的淘选，以HB?EGF为有效成分特异性洗脱结合靶分子的噬菌体得到生物活性多肽TUZG7；该生物活性多肽TUZG7显著抑制了HB?EGF的促进卵巢癌细胞迁移和侵润等过程；本发明多肽序列较短，易于合成和实现规模化生产，能抑制HB?EGF的促癌作用，有用于制备抗癌药物的潜力，在抗癌药物研发方面具有重要应用价值。
【专利说明】
特异性抑制HB-EGF促肿瘤细胞迁移浸润的多肽
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，涉及一种由噬菌体展示技术筛选得到的能特异性 抑制HB-EGF促肿瘤细胞迀移浸润的活性多肽的发明。
[0002]
【背景技术】
[0003] 肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)是表皮生长因子(EGF)超家族成员之一，是一种I 型跨膜蛋白，可由巨噬细胞、平滑肌细胞及内皮细胞产生。编码HB-EGF基因位于人类5号染 色体上，该基因长度为14 kb，含有6个外显子和5个内显子。
[0004] HB-EGF与细胞表面的表皮生长因子受体(EGFR)相结合而发挥重要作用，参与胚胎 着床、创伤愈合、平滑肌增生、动脉粥样硬化和肿瘤发生等病理生理过程。作为EGFR的配体， HB-EGF可以促进包括肿瘤细胞在内的多种细胞增殖。HB-EGF基因是许多致癌基因如肉瘤病 毒癌基因（v-jun)、逆病毒癌基因（Raf)等的目的基因，临床数据证明HB-EGF在卵巢癌中过 量表达，特异性抑制HB-EGF及其下游信号通路后，肿瘤细胞的凋亡数增加，生长速度变慢， 血管生成受到抑制，迀移侵润速率变慢;且拮抗HB-EGF和抗癌药物联合用药时，肿瘤的抗药 性大大降低，说明HB-EGF与卵巢癌的发生、转移和抗药性有密切的关系。
[0005] 卵巢癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，在所有妇科肿瘤当中其发病率仅 次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第三位。卵巢癌的高发病率和高死亡率的主要源于恶性肿 瘤的侵润和转移。目前，已有文献报道：与正常组织相比，HB-EGF、EFGR在卵巢癌中大量表 达。HB-EGF与EGFR结合后激活下游信号转导通路，如：Ras-Raf-MAPK通路、磷脂酰三磷酸肌 醇(P13K)和丝苏氨酸激酶(AKT)通路。这些信号转导通路最终介导癌细胞的增殖、分化和迀 移。在HB-EGF高表达的情况下，卵巢癌细胞在腹水中粘附、迀移、诱导血管生成的能力均明 显提高，加入HB-EGF特异性抑制剂白喉毒素突变体CRM197可以完全抑制肿瘤的转移。Wei等 利用小干扰RNA降低HB-EGF的表达，显著地抑制了卵巢癌细胞系SK0V3的迀移和侵润。综上 所述，HB-EGF对卵巢癌细胞的增殖、迀移、侵润具有促进作用。
[0006] 近年来，多肽药物已成为药物研发的热点，其分子小、质量控制水平接近于传统的 小分子化学药物，而活性接近于蛋白质药物，结合了传统化学和蛋白质药物的优势，且生产 过程中排放的废物少，属于绿色制药，具有广阔的开发前景。目前多肽药物的筛选方法主要 包括生化分离天然产物，在现有天然多肽上进行结构修饰等，往往工作量大、筛选效率低。 噬菌体展示技术通过将编码外源多肽链的基因与噬菌体外壳蛋白基因融合表达，使表达的 多肽以融合蛋白形式呈现在噬菌体表面，并保持相对独立的空间结构和生物活性，从而使 多肽与其脱氧核糖核酸(DNA)编码序列之间建立了直接联系;利用各种靶分子(抗体、酶、细 胞表面受体等）与多肽配体的特异性结合，淘选得到相应噬菌体，并以DNA测序获得多肽序 列。目前此技术已被广泛应用于生物医药研究的不同领域，尤其在人工抗体和疫苗的研制、 多肽药物的开发等方面，具有广阔应用前景。
[0007] 我们以HB-EGF为靶分子，以噬菌体展示淘选得到一个多肽并命名为TUZG7,并且通 过实验证明TUZG7能显著抑制HB-EGF的促进卵巢癌细胞株SK0V3迀移和侵润的作用。
[0008]
【发明内容】
[0009]将HB-EGF作为靶分子包被于六孔板(NEST科学公司）上，使噬菌体（随机十二肽噬 菌体文库，NEB(北京)有限公司）与之结合；用HB-EGF蛋白溶液竞争性洗脱特异性结合的噬 菌体，经过三轮淘选，富集得到高亲和力的噬菌体。将淘选到的单克隆噬菌体扩增后提取 DNA，对其进行测序，并合成了出现频率较高的多肽TUZG7。经细胞划痕实验和细胞侵润实验 验证，多肽TUZG7能显著抑制HB-EGF促进卵巢癌细胞系SK0V3迀移和侵润的作用。
[0010]能显著抑制HB-EGF的促进卵巢癌细胞株SK0V3迀移和侵润的的多肽，其氨基酸序 列如SEQ ID N0.1所示。
[0011] 其氨基酸序列为:His Pro Ser Ala Leu Met Lys Pro Thr Ser His Ala。
[0012] 本发明的有益效果： 多肽TUZG7能显著抑制HB-EGF促进卵巢癌细胞迀移和侵润的作用，对于HB-EGF高表达， 且特别容易发生迀移侵润的卵巢癌，具有较高临床价值。发明的多肽序列较短，易于实现规 模化生产，具有广阔的市场和前景。
【附图说明】
[0013] 图1.各组SK0V3细胞经过划痕实验的处理后，分别在0小时、24小时、30小时、36小 时、48小时采集图片，对比分析TUZG7对HB-EGF促卵巢癌细胞迀移作用的影响。
[0014] 图2.各组SK0V3细胞经过划痕实验的处理后，分别在0小时、24小时、30小时、36小 时、48小时采集图片，将各组的迀移距离进行统计，经过三次独立的试验后统计汇总分析得 到迀移速率折线图（#，ρ〈0·01; *#，ρ〈0·001)。
[0015]图3 ·用SK0V3细胞进行小室（Transwe 11)侵润实验，将小室的下室进行拍照，经过 三次独立实验后，选取典型的实验结果进行对比。
[0016] 图4.小室(Transwell)侵润实验的数据统计(林，Ρ〈0·01; *#，Ρ〈0·001; #，P >0.05)〇
[0017]
【具体实施方式】
[0018]实施例1.噬菌体展示淘选特异性结合HB-EGF的多肽 靶分子固定化:将600 μι浓度为17 μg/ml的靶分子HB-EGF(Pepro Tech生物公司，美 国）溶液(溶于0.1 Μ的NaHC03 pH 8.6)加入六孔板(NEST科学）中，置于摇床上轻微振荡，4 °(：孵育过夜。除去靶分子溶液并用TBST(50 mM Tris-HCl pH 7.5，150 mM NaCl，0.1%[v/v] Tween-20 )清洗6次。最后用封阻液(0.1 M NaHC03 pH 8·6,5 mg/ml BSA，0.02% NaN3)封闭 1 h〇
[0019] 噬菌体随机肽库与靶分子结合：除去封阻液，并用TBST(0. l%[v/v] Tween-20)清 洗10次。噬菌体库或扩增后的噬菌体经TBST(0.1%[v/v] Tween-20)稀释后，噬菌体的滴度 在109~1011之间，将稀释好的噬菌体加入到六孔板上使之与靶分子结合，室温孵育10~60 min〇
[0020] 洗掉未结合噬菌体:TBST(第一轮用0.1%，之后都用0.5%[v/v] Tween-20)清洗10 次，每次清洗后用力在灭菌滤纸上拍，去除残留液。
[0021] 洗脱特异性结合噬菌体:将200μ1 HB-EGF(100 μg/ml)溶液加入六孔板中，室温轻 微摇动10~60 min。收集洗脱液，即得到被竞争性洗脱下来的特异性结合靶分子的噬菌 体。
[0022]噬菌体扩增：将洗脱下来的噬菌体加入20 ml处于对数前期的ER2738宿主菌(NEB (北京)有限公司）中，37 °C剧烈摇晃4.5 h。将培养物转入离心管中，4 °C 12000 g离心10 min，上清液转入另一离心管中，重复离心。将上清的上部80%转入新离心管中，加入1/6体积 的PEG/NaCl(20% [w/v] PEG-8000, 2.5 M NaCl)，4 °C沉淀过夜。再次离心、1 ml TBS重 悬、PEG/NaCl沉淀60 min之后，12000 g离心 10 min，将沉淀溶于200 μL TBS，14000 rpm，离 心1 min，将上清转移至另一微量离心管中，即为扩增后的洗脱物。取出1 μL用于滴度测定， 其他用来进行下一轮淘选或保存。
[0023]单克隆噬菌体信息的提取:3轮淘选后，将最后一轮洗脱下来的噬菌体感染宿主菌 ER2378后铺在LB/IPTG/Xgal板上。13 h后，噬菌体蓝斑长成，挑取蓝斑并进行单克隆噬菌体 扩增。4 h后将培养物14000 rpm离心30 s，取上清，如此重复2次，最后取80%的上清即为扩 增后的单克隆噬菌体。以单克隆噬菌体为模板，设计PCR引物上游引物：5'_ TTATTCGCAATTCCTTTAG-3' 和下游引物：5'-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3'（生工生物工程（上 海）股份有限公司）扩增序列，对扩增产物进行测序（华大基因），得到占优势的多肽序列 TUZG7,然后将多肽序列送公司（南京金斯瑞生物科技有限公司）合成。
[0024] 多肽TUZG7序列如表1.所示： 表1多肽的序列_
实施例2.细胞的培养和传代及细胞划痕实验 SK0V3细胞(American Type Culture Collection，美国）培养于含10%胎牛血清及青 霉素-链霉素的RMPI-1640(Life Technologies公司，美国）培养基中，需要每天定期观察细 胞生长状态，及时传代。
[0025]第一天:种板。
[0026]从⑶2培养箱（赛默飞有限公司）取出传代培养的SK0V3细胞，弃原培养基，加入2 ml PBS(国药集团化学试剂有限公司）清洗，用巴氏管吸去上清液。加入0.5 ml胰蛋白酶(西 格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司）消化，转移至微量离心管（海门市磊敏实验器材经营 部）中，200 g离心5 min，巴氏管吸去上清液。吸取1 ml含10%胎牛血清及青霉素-链霉素的 RMPI-1640培养基吹打混匀（英潍捷基(上海)贸易有限公司），用移液枪取10 μL细胞悬液于 细胞计数板(海门科诺实验耗材)计数。根据每孔种1.5Χ105个细胞，用培养基对细胞悬液 进行稀释。用移液枪取500μ1细胞悬液加入24孔板(NEST科学）的3个孔中。
[0027] 第二天:划痕。
[0028] 等细胞面积生长为90%时，用10μ1白色枪头尽量垂直于孔表面划直线。将细胞分为 三组处理，分别为不加任何物质的纯对照组（Contro 1)，HB-EGF组、HB-EGF+TUZG7组(HB-EGF 的终浓度为0.125以8/1111，1'1]267终浓度为25以111〇1/1111)。分别在011、24 11、30 11、36 11、48 11拍 照，统计分析。实验结果表明HB-EGF对卵巢癌SK0V3迀移有促进作用，而TUZG7能显著抑制 HB-EGF促进卵巢癌细胞SK0V3迀移的作用。结果如图1和图2所示。
[0029]实施例3.细胞侵润实验 第一天:将-20 °C冰箱中的ECM基质胶(西格玛公司，美国）移至4°C冰箱，过夜解冻。 [0030] 第二天:预冷待用24孔板、?ομL枪头及Transwell小室(康宁生命科学，美国），用预 冷过的无胎牛血清及含青霉素-链霉素的培养基与ECM基质胶1:8稀释(在预冷过的微量离 心管中），稀释好后在Transwel 1小室中各加入40μ1的ECM稀释液，过后放入5% C02、37 °C细 胞培养箱过夜。
[0031 ]第三天：Transwell 实验。
[0032] 从⑶2培养箱取出传代培养的SK0V3细胞，加入1 miroS，用巴氏管吸去上清液。加 入0.5 ml胰蛋白酶消化，转移至微量离心管中，200 g离心5 min，巴氏管吸去上清液，加入 无血清培养基重悬细胞。用血球计数板计数，调整细胞的密度至1 X 1〇5个/ml。分别取200μ1 细胞悬液加入到小室中，混匀，在小室下面即24孔板里加500 μL含有血清的DMEM培养基，放 入5 % C 0 2、3 7 °C细胞培养箱。将细胞分为三组处理，分别为不加任何物质的纯对照组 (Control)，HB-EGF组、HB-EGF+TUZG7组（HB-EGF的终浓度为0.125 g/ml，TUZG7终浓度为25 mol/ml)。最后放入5%C02、37 °C细胞培养箱培养36 h。用镊子夹出小室，用棉签擦掉小室内 部残留的细胞，风干小室底部的膜，再用0.1%结晶紫染色15-20 min，用PBS洗3遍。然后取 一干净载玻片，表面滴一滴清水，将Transwel 1小室放在清水上，用显微镜观察和拍照，并分 析。实验结果表明HB-EGF对卵巢癌细胞SK0V3有促进侵润的作用，而TUZG7能显著抑制HB- EGF促进卵巢癌细胞侵润的作用。结果如图3和图4所示。
【主权项】
1. 能显著抑制HB-EGF的促进卵巢癌细胞株SK0V3迀移和侵润的的多肽，其氨基酸序列 如SEQ ID N0.1 所示。2. 根据权利要求1所述能显著抑制HB-EGF的促进卵巢癌细胞株SK0V3迀移和侵润的的 多肽，其特征是以肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)为靶向，经噬菌体展示技术，从随机十二 肽噬菌体文库中淘选出来的随机多肽序列。3. 根据权利要求1所述能显著抑制HB-EGF的促进卵巢癌细胞株SK0V3迀移和侵润的的 多肽，其特征是在淘选过程中，使用的竞争性洗脱特异性结合靶蛋白的分子是HB-EGF。4. 根据权利要求2-3任一项所述能显著抑制HB-EGF的促进卵巢癌细胞株SK0V3迀移和 侵润的的多肽的制备的方法。5. 根据权利要求1所述能显著抑制HB-EGF的促进卵巢癌细胞株SK0V3迀移和侵润的的 多肽在制备用于治疗卵巢癌药物中的应用。
【文档编号】C07K7/08GK105837665SQ201610324409
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月16日
【发明人】刘晗青, 张雅菲, 阮玲玲, 屠志刚, 赵志聪, 尚东胜, 吴燕芳, 沈艳婷, 廉彩霞, 卢子文, 鲁永金, 张佩珊, 梁智全
【申请人】江苏大学