I的条件下，培养 所述重组宿主细胞，优选W分泌形式或其他胞内产品的形式表达POI。然后，可通过本领域 熟练技术人员公知的技术从细胞培养基分离重组生产的POI或宿主细胞代谢物并进一步 纯化。
[020引根据本发明，典型地，可采用现有技术包括提高需要的POI的浓度和/或降低至少 一种杂质的浓度分离和纯化所述产生的POI。
[0209]如果所述POI是从细胞分泌的，可采用现有技术从细胞培养中分离和纯化所述P0I。因为所述产品是从培样悬浮液中回收而不是从蛋白质复合混合物（破坏酵母细胞释 放胞内蛋白时获得）中回收，从宿主细胞中分泌重组子表达产物对于促进纯化过程通常是 有益的。
[0210] 也可通过超声或机械地，酶学的或化学的方法破碎培养的转化子细胞，从而获得 包含需要的POI的细胞分离物，从中分离和纯化所述POI。
[0211] 作为获得重组多肤或蛋白产品的分离和纯化方法，可采用的方法包括例如采用溶 解度差异的方法，例如盐析和溶剂沉淀方法，采用分子量差异的方法，例如超滤和凝胶层析 法，采用电荷差异的方法，例如离子交换层析法，采用特异亲和性的方法，例如亲和层析法， 采用疏水性差异的方法，例如反相高效液相层析法，和采用等电点差异的方法，例如等电聚 焦法。
[0212] 高度纯化的产品基本上是无污染的蛋白质，优选纯度为至少90%，更优选至少 95%，或甚至至少为98%，直到100%。可通过从细胞碎片中纯化细胞培养悬浮物或其他获 得纯化的产品。
[0213] 下列标准方法可优选作为分离和纯化方法：细胞破碎（如果所述POI是从胞内获 得），通过微滤或切向流过滤灯FF)或离屯、分离和洗涂细胞（碎片），通过沉淀或热处理来 纯化P0I，通过酶解激活P0I，通过层析例如离子交换（IEX)，疏水作用色谱化1C)，亲和层 析，分子筛（SEC)，或高效液相色谱层析OPLC)纯化POI，通过超滤步骤来浓缩和洗涂POI 沉淀。
[0214]可通过传统方法例如免疫印迹法、HPLC、酶活力测定法或化ISA分离和纯化所述POI。
[0215] 所述POI可W是任何真核、原核或合成多肤。它可W是分泌蛋白或胞内蛋白。本 发明还提供了天然存在蛋白的功能同源物，功能等同变种、衍生物和生物学活性片段的重 组产物。优选地，功能同源物优选和某序列一致的或与其对应，并具有其功能上的特征。
[0216] 本发明中，POI可W示与真核宿主细胞同源的或异源的的产品，优选用于治疗、预 防、诊断、分析或工业用途。
[0217] 优选地，所述POI是一种异源重组多肤或蛋白，在真核细胞中产生，优选在酵母细 胞，优选为分泌蛋白。优选的产生蛋白的实施例是免疫球蛋白，免疫球蛋白片段，抑肤酶、 组织因子途径抑制剂或其他蛋白酶抑制剂，和膜岛素或膜岛素前体，膜岛素类似物、生长 激素、白细胞介素、组织纤溶酶原激活物，转化生长因子a或b，膜高糖素，膜高血糖素样 肤-I(GLP-I)膜高血糖素样肤-2 (GLP-2)、GRPP、第V II因子、第V III因子、第X III因 子、血小板源生长因子1、血清白蛋白、酶，例如脂酶或蛋白酶等，或功能相同，功能等价的 变种，与天然蛋白质具有类似功能的生物活性片段。所述POI可W是与天然蛋白结构上相 似，并且通过添加一个或多个氨基酸到天然蛋白的C端和N端或侧链，在天然氨基酸序列的 一个或多个位点替换一个或多个氨基，在天然蛋白的一端或两端或氨基酸序列的一个或多 个位点删除一个或多个氨基酸，或在天然氨基酸序列的一个或多个位点插入一个或多个氨 基酸，从而源自天然蛋白。运样的修饰对上述的若干蛋白质是众所周知的。
[021引一种POI也可选自在宿主细胞中提供生物学反应底物、酶、抑制剂或辅因子，目的 是获得所述生物化学反应或多个反应的级联的产物，例如获得宿主细胞的代谢物。根据本 发明，范例产品可W是维生素，例如核黄素，有机酸和醇类，可在重组蛋白或POI的表达后 获得提高的产量。
[0219] 总而言之，表达重组产物的宿主细胞，可W是任何适合表达POI的真核细胞。
[0220] 优选的哺乳动物细胞的实施例是幼仓鼠肾细胞度HK)，CHO(CH0-DG44， CH0-DUXB11，CH0-DUKX，CHO-Kl，CH0K1SV，CH0-S)，HeLa,人胚肾（肥K293)，狗肾传代细胞 (MDCK)，NI册T3,NS0,P邸.C6,SP2/0 和VERO细胞。
[0221] 根据本发明，用于作为宿主细胞的优选的酵母细胞的实施例包括但不限于酵母 属（例如毕赤酵母或甲醇毕赤酵母），毕赤酵母属（毕赤酵母化pastoris)、毕赤酵母化 pseudopastoris)或毕赤酵母(X地affii))，多形汉逊酵母（Hansenulapolymo巧ha)或克 鲁维酵母化iuyveromycesIactis)。
[0222] 更新的文献将毕赤酵母（Pichiapastoris)分类和重命名为毕赤酵母 (Komagataellapastoris)、毕赤酵母化omagataella地affii)和毕赤酵母化oma阱taella pseudopastoris)。本发明的毕赤酵母（Pichiapastoris)用于作为全部毕赤酵母 (Komagataellapastoris)、毕赤酵母化omagataella地affii)和毕赤酵母化oma阱taella pseudopastoris)的同义。
[0223] 优选的酵母细胞源自甲醇营养型酵母，比如来自毕赤酵母（Pichiapastoris) 或毕赤酵母化omagataellapastoris)，例如毕赤酵母（Pichiapastoris)或毕赤 酵母化.pastoris)或毕赤酵母化.phaffii)或毕赤酵母化.pseudopastoris)宿 主的实施例包括酵母例如毕赤酵母。毕赤酵母菌株的实施例包括CBS704( =NRRL Y-1603 =DSMZ70382)，CBS2612( =NRRLY-7556)，CBS7435( =NRRLY-11430)， CBS9173-9189(CBS菌株：CBS-KNAW真菌生物多样性中屯、（Centraalbureauvoor Schimmel-cultures,Utrecht,TheNetheds)， 和DSMZ70877(GermanCollection ofMicro-organismsandCellQiltures)，也包括源自Invitrogen的菌株，如X-33,GS115,KM71和SMD1168。酿酒酵母菌株的实施例包括W303,CEN.PK和BY-系列 (抓ROSCARF采集）上述所有菌株已经成功用于产生转化子和表达异源基因。
[0224] 根据本发明，首选的酵母宿主细胞，例如毕赤酵母或酿酒酵母宿主细胞，包含异源 或重组启动子序列，该序列源自不同于生产宿主的P.pastoris或酿酒酵母菌株。根据本 发明，在其他特别实施方式中，宿主细胞包含重组构建物，该构建物包含源自和宿主细胞同 属、种或菌株的启动子。
[0225] 本发明的启动子优选源自编码与宿主细胞同源的蛋白的基因。
[0226] 例如，本发明的一种启动子可源自酵母，例如酿酒酵母菌株和用于表达P0I。根 据本发明，一个特别优选的实施方式设及源自用于在毕赤酵母生产宿主细胞系中生产重组 POI的方法的毕赤酵母的启动子。所述核巧酸序列的同源起源有助于其整合到同属或同种 的宿主细胞，因此，实现了稳定生产POI同时可能提高工业生产过程中的产量。也可使用源 自其他合适的酵母或其他真菌或源自其他生物例如脊椎动物或植物的启动子的有功能活 性的变种。
[0227] 如果所述POI是宿主细胞的一种同源蛋白，即一种天然存在于宿主细胞的蛋白， 所述POI在所述宿主细胞中的表达可通过其天然启动子序列与本发明启动子序列的交换 进行调节。
[0228] 例如，通过用包含祀基因的同源序列的重组DNA分子转化宿主细胞来允许位点特 异性重组，从而实现该目标，该启动子序列和选择性标记适合宿主细胞。为了将启动子序列 与编码POI的核巧酸序列可操作的连接，可进行位点特异性重组。W上引起从本发明的启 动子序列而不是从天然启动子序列表达POI。
[0229] 在本发明的特别优选的实施方式中，启动子序列相对于天然POI启动子序列具有 提高的启动子活性。
[0230] 根据本发明，优选提供一种包含本发明启动子序列的毕赤酵母宿主细胞，该启动 子序列与编码POI的核巧酸序列操作性连接。
[0231] 本发明，还可能提供一种根据本发明的通配载体或宿主细胞，它包含根据本发 明的启动子，并且，可即时整合编码POI的感兴趣的基因。因此，该通配细胞系，是一种 形成的宿主细胞系，其特征是其表达能力。运遵循了一种产生用于POI生产的细胞系的 创新的"通配的"平台方案，例如用位点特异性的重组酶调节盒交换法（site-specific recombinase-mediatedcassetteexchange)。运样的新宿主细胞有利于在数天内将感兴 趣的基因（GOI)克隆进入预先确定的基因组表达热点W便获得可复制的、高效生产的细胞 系。
[0232] 根据优选实施方式，本发明的方法采用了编码POI的重组核巧酸序列，该序列是 提供在适合W每个细胞单拷贝或多拷贝整合进宿主细胞系的质粒上。所述编码POI的重组 核巧酸序列也可W每个细胞单拷贝或多拷贝提供于自主复制的质粒上。
[0233] 本发明的优选的方法采用一种质粒，它是一种真核表达载体，优选一种酵母表达 载体。表达载体可包含但不限于克隆载体，经修饰的克隆载体和特别设计的质粒。本发明 所用的优选的表达载体可W是任何适合于在宿主细胞表达重组基因的表达载体，并且可根 据宿主生物选择。所述重组表达载体可W是能够在宿主生物基因组中复制或整合到其中的 任何载体，也称为宿主载体，例如酵母载体，其携带根据本发明的DM构建物。一种优选的 酵母表达载体是用于在选自由汉逊酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属和球拟酵母属组成的 组的酵母中表达。
[0234]在本发明中，优选使用源自pPICZ、pGAPZ、pPIC9、pPICZalfa、pGAPZalfa、PPIC9K、 pGAPHis或pPUZZLE的质粒为载体。
[0235] 根据本发明的一优选实施方式，一种重组构建物是通过连接相关基因进入载体获 得的。运些基因可通过采用运种载体转化宿主细胞稳定整合进入所述宿主细胞。可采用重 组宿主细胞系通过培养转化子，在合适的培养基上获得，从培养中分离表达的P0I，然后通 过适于表达产物的方法纯化，特别是从污染蛋白中分离P0I，W生产运些基因编码的多肤。
[0236] 表达载体可包含一个或多个可选择的表型标记，例如，一种编码提供抗生素抗性 或提供自养需求的蛋白的基因。酵母载体通常包含一个来自酵母染色体的复制起点，一个 自主复制序列（ARS)，或可选择地，一个用于整合进入宿主基因组的序列，一个启动子区，用 于聚腺巧酸化的序列，用于转录终止的序列，和选择性标记。
[0237] 用于连接DNA序列例如，编码前体序列和/或P0I，启动子和终止子，然后将它们插 入包含整合或宿主复制必须的信息的合适载体的程序，是本领域熟练技术人员公知的，例 如，Sambrook等人所述（AL油oratoryManual,ColdSpring化rbor, 1989)。
[023引可W理解的是，使用根据本发明的调节元件和/或POI作为整合祀标的载体，其构 建方法既可W是通过制备一种包含编码调节元件和/或POI的整个DNA序列的DNA构建物， 随后将该片段插入一种合适的表达载体，也可W是通过连续插入包含适于单个元件的遗传 信息的DNA片段，随后连接。
[0239] 根据本发明可使用多克隆载体，它具有多克隆位点，其中，需要的异源基因可结合 在多克隆位点W便提供一种表达载体。在表达载体，启动子是位于POI基因的上游，并调节 该基因的表达。就多克隆载体的情况来说，因为所述POI基因是在多克隆位点引入，该启动 子是位于多克隆位点的上游。
[0240] 本发明用于获得重组宿主细胞的DNA构建物可通过建立的标准方法，例如憐酷胺 酸法合成制备。所述DNA构建物也可W是基因组或CDNA起源，例如，通过制备一种基因 组或CDNA库和通过使用符合标准技术的合成的寡核巧酸探针并通过杂交筛选编码全部 或部分本发明多肤的DNA序列获得（Sambrook等人，MolecularCloning=AL油oratory Manual,ColdSpringHarbor, 1989)。ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor, 1989)。 按照标准技术，最后，所述DM构建物可W是合成的和基因组来源的混合，合成的和cDNA来 源的混合或基因组和CDNA来源的混合，其是通过将合成的、基因组或CDNA来源的片段进 行退火而制备，如适用，该片段和整个基因组构建物的各个部分对应。
[0241] 在另一优选实施方式中，例如所述酵母的表达载体能够通过同源重组稳定整合到 宿主基因组。
[0242] 根据本发明通过采用调节元件和/或POI基因转化宿主细胞获得的本发明的转化 株宿主细胞可优选地首先在可有效生长到大量细胞的条件下培养。当所述细胞系是制备用 于表达POI时，选择培养技术用于产生表达产品。
[0243] 特别的实施例设及分批补料发酵重组的生产产生报告蛋白的毕赤酵母细胞系，其 采用甘油分批培养基和葡萄糖分批补料培养基。比较性启动子活性研究已经证明，本发明 的启动子可W成功用于重组蛋白生产。
[0244] 根据进一步的实施例，人血清白蛋白化SA)是作为一种POI在葡萄糖限制条件下 生产，并且，HSA产量和基因拷贝数确定
[0245] 根据另一实施例，在本发明的启动子控制条件下分批补料培养了表达HSA的毕赤 酵母菌株。
[0246] 进一步的实施例设及在PCSl启动子的转录控制下表达作为模式蛋白的猪的簇肤 酶B。
[0247] 再者，一个进一步的实施例设及在pCSl的转录控制下表达一种抗体片段。
[0248] 一个进一步的实施例设及根据本发明启动子的大小或长度变种，例如延长的pCSl 序列pCSla(沈QID2)，它包含pCSl序列和在5'端的延长，或长度在SObp~SOObp范围内 的pCSl片段。
[0249] 参考下列实施例可完全理解前述说明。但是，运些实施例仅仅是代表本发明的一 种或多种实施方式，并非是限制本发明的范围。
[0巧0] 实施例
[0251] 下述实施例说明了用于确定新启动子和分析其在毕赤酵母中的表达特性的材料 和方法。
[0巧2] 实施例1:识别毕赤酵母中的强表达启动子
[0巧引为了识别毕赤酵母中的强基因和具体启动子，采用DNA忍片分析了其基因表达 谱。分析了毕赤酵母（P.pastoris)细胞在甘油分批和在葡萄糖限制（恒化器）中的生长。 [0巧4] a)菌株
[0巧5] 采用了能够在不添加补充物的基本培养基上生长的野生型毕赤酵母菌 株（CBS2612,CBS-KNAWFungalBiodiversityCentre,Centraalbureauvoor Schimmelcultures,Utrecht,TheNetherlands)
[0巧6] b)毕赤酵母培养
[0巧7] 用实验室小型发酵罐（In化rs-HT,Switzerland)实施了发酵，最终有效容积是 2. 5L.
[0巧引使用下列培养基：
[0巧9] 每升PTMl微量盐母液，包含：
[0260]6. Og OiS〇4?5&0,0.0 SgNaI, 3. 36g MnS〇4?&0,0. 2g NazMoO*?2&0,0. 02g H3BO3， 0. 82g CoCl2,20. Og aiCl2,65. Og FeS〇4. 7&0,0. 2g生物素和5. Oml &5〇4(95% -98% )
[0261]每升甘油分批培养基包含：2g-水巧樣酸似&〇7?H2O)，39. 2g甘油，20. Sg 畑化口〇4,〇. 5邑MgS〇4. 7&0,1.6邑KC1，0. 022邑CaClz . 2&0,0.8m邑生物素和4.6ml PTMl微 量元素盐母液。添加肥1，将抑调为5。
[0262] 每升甘油分批培养基包含：
[026引632g甘油，8gM拆04? 7&0, 22gKC1,和 0. 058gCaClz? 2&0。
[0264] 每升恒化器培养基包含：
[02财2邑一水巧樣酸（(：品07.&0)，99.42邑一水葡萄糖，22邑畑品?04，1.3邑 M拆04? 7&0, 3. 4gKC1，0. 02gCaClz? 2&0,0. 4mg生物素和 3. 2mlPTMl微量元素盐母液。 添加肥I，将抑调为5。
[0266] 采用揽拌速度巧00~1250巧m)将溶解氧控制在DO= 20%。通气速率是60L/h 空气，溫度控制在25°C，添加畑40H(25% )将抑控制在5。
[0267] 将1.化分批培养基灭菌过滤进入发酵罐，从在YPG，18化pm，28°C过夜预培养接种 起始IL光密度（0D600) = 1的毕赤酵母启动发酵。大约经过25h的分批培养期，到达大约 20g/L的干物质量浓度，接着进行IOh的葡萄糖培养基指数分批补料培养，产生大约50g/L 的干物质量浓度。然后，培养体积降到1.化，并从0. 15L/h的补料/收获比开始恒化器培 养，产生y=0.1的恒定生长率。恒化器培养开始5化后发酵终止。
[026引本次发酵实施=次，W获得进行可重复的忍片分析必须的生物学样品。
[0269] 可通过培养悬浮液的HPLC分析验证恒化器期间的碳源限制性条件（不是可测定 的残余葡萄糖）。
[0270]C)取样
[0271] 在甘油分批期的末期并在葡糖恒化器稳定状态条件下取样。每次发酵在发酵罐边 进行常规取样W确定OD或酵母干物质量，定性显微镜检和细胞活力分析。按照如下方法取 样和处理W进行忍片分析：为了进行光巧灭，直接将9ml细胞培养液与4. 5ml冰冷的5%石 炭酸（Sigma)溶液（乙醇溶解，绝对值）混合，并分装成多个小份。将2mL每份在预冷的收 集管（GE医疗保健，NJ)中离屯、（1320化pm离屯、Imin)，完全移除悬浮液，将收集管在-80°C 储存，直到进行RNA纯化。
[0272]d)RNA纯化和忍片杂交的样品制备
[027引按照供应商（Ambion，U巧说明书，采用TRl试剂分离RNA.将细胞小球重悬于TRl试剂，并且用玻璃珠化StPr巧24 (MP.Biomedicals,CA)在5mS1处理40秒将细胞小球进 行均质。添加氯仿后，将样品离屯、，通过添加异丙醇从水相沉淀总RNA。用70%乙醇洗涂细 胞小球，干燥，重悬于无RNA酶的水中。通过用Nano化op1000分光光度计（Nano化op产 品，呢）测定002(3。确定RNA浓度。用无DNA试剂盒（Ambion,CA)移除样品中的残余DNA。在无 RNA酶的水中将相当于IOgRNA的样品量稀释到50yL然后添加DNA酶缓冲液I和rDNA酶 I，在37 °C解育30分钟。在添加DNA酶失活剂后，将样品离屯、，将悬浮物转移到新管。再次如 上所述确定RNA浓度。此外，用RNA纳米忍片（Agilent)分析RNA完整性。为了监控来自样 品的扩增和杂交标记流程，可用Sp;LkeInKit(Agilent,Product化.：5188-5279)为阳性 对照。该对照包含来自腺病毒的10个不同的多聚腺巧酸化的转录本，可与自身的RNA样品 一同扩增、标记和共杂交。义用如ickAmpL油ellingKit(Agilent,Prod.化.：5190-0444) 将样品用切3和切5标记。因此，在8.SyL无RNA酶水中稀释500ng纯化的样品RNA，添 加2yLSp化eA或B，和1.2yLT7启动子引物。将混合物在65°C变性10分钟，并在冰上 保持5分钟。然后，添加8. 5yLCDNA系列（每份样品添加：4yL5x第一链缓冲液，2yL 0.IM二硫苏糖醇值TT)，1yLIOmMdNTP混合物，1yLMMLV-RT, 0. 5yL_RNAseout)，于 40°C解育2小时，然后转移到65°C保持15分钟并置于冰上5分钟。审I恪转录系列（每份 样品加入：15.SiiL无核酸酶水，20yL转录缓冲液，6yL0.IMDTT，6.4iiL50%聚乙二醇 (阳G)，0. 5yLRNA酶抑制剂，0.6yL无机憐.憐酸酶，0.8yLT7RNA聚合酶，2. 4yL花青 素3或花青素5)，并将其添加到每个管中，在40°C解育2小时。为了纯化获得的标记cDNA, 采用RNeasyMiniKiUQiagen,Cat.No. 74104)。将样品储存在-80°C。
[0274]在Nano化OP分光光度计中进行cRNA浓度和标记效率的定量。
[0275]e)微阵列忍片分析
[0276] 基因表达杂交试剂盒（Agilent,Cat.No. 5188-5242)用于标记样品cRNA的杂 交。为了制备杂交样品，用无核酸酶的水将每份3(K)ngCRNA(切3和切5)和6yLlO倍 封闭剂稀释为最终24yL的体积。添加IiiL25倍片段化缓冲液后，将混合物在60°C 解育30分钟。然后，添加25yLGEx杂交缓冲液HI-RPM终止反应。在13, 200巧m离屯、 后，将样品在冰上冷却，并立即用于杂交。使用内部设计的特异于毕赤酵母的寡核巧酸忍 片（AMAD-ID:026594,8xl5K州Sto