利用微生物的d-手性肌醇的生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及利用微生物的D-手性肌醇的生产方法。更详细地，设及基于转化的微 生物宿主细胞从肌醇生产D-手性肌醇的方法。
【背景技术】
[0002] D-手性肌醇值-chiro-inositol，cis_l, 2, 4-trans_3, 5,6_巧clohexol)作为肌 醇（myo-inositol，cis-1, 2, 3, 5-trans-4,6-巧clohexanehexol)的立体异构体，是 3 号美圣 基被差向异构化的形态（图1)。据报告，D-手性肌醇为肌醇憐酸聚糖（IPG)的主要组成成 分，是膜岛素信号传输的重要介质，众所周知，上述D-手性肌醇对二型糖尿病具有治疗效 果。D-手性肌醇主要在真核生物中被发现，借助肌醇的差向异构化来实现生物合成。
[0003] D-手性肌醇主要通过D-松醇值-pinitol)或春雷霉素化asugamycin)的盐酸 水解来生产扣.S.PatNo. 5827896，U.S.PatNo. 5091596，U.S.PatNo. 5463142，U.S.Pat No. 5714643)。但是，虽然作为原料的D-松醇或春雷霉素的价格高昂，并且，众所周知的还 有有机合成法扣.S.PatNo. 5406005,W096/25381)，由于难W分离副产物，因而经济性差。
[0004]山本（Yamamoto)等提出了利用表达农杆菌AB10121(Agrobacterium sp.AB10121)的MI差向异构酶（epimerase)的细菌来从肌醇转换为手性肌醇的方法 (JP2001-006878、W02002/055715)。山本等提出的方法能够W约15%的收率从肌醇生产 D-手性肌醇。
[0005] 本说明书全文中，参照了多篇论文及专利文献，并表示了其引用。所引用的论文及 专利文献的公开内容全部插入于本说明书作为参照，从而更加明确说明本发明所属的技术 领域的水平及本发明的内容。
【发明内容】
[0006] 本发巧要解决的巧术间颗
[0007] 本发明人为了利用微生物来从肌醇生产手性肌醇而努力研究，其结果，确认如下 情况来完成了本发明，即，若利用由包含肌醇转运体（myo-inositoltransporter)、肌醇脱 氨酶（inositoldehy化ogenase)及肌醇异构酶（inositolisomerase)编码基因的重组表 达载体转化的宿主细胞，则能够W高收率从肌醇生产D-手性肌醇。
[0008]因此，本发明的目的在于，提供利用转化的宿主细胞来从肌醇生产D-手性肌醇的 方法。
[0009] 本发明的再一目的在于，提供表达肌醇转运体、肌醇脱氨酶及肌糖异构酶的转化 的宿主细胞。
[0010] 本发明的另一目的在于，提供用于生产包含上述转化的宿主细胞的D-手性肌醇 的组合物。
[0011] 本发明的还一目的在于，提供包含具有将肌醇转运体、肌醇脱氨酶及肌糖异构酶 编码的脱氧核糖核酸值NA)序列的重组载体的、生产D-手性肌醇的试剂盒。
[0012] W下发明的详细说明、发明要求保护范围及附图，将更加明确本发明的目的及优 点。
[0013] 巧术方案
[0014] 根据本发明的一实施方式，本发明提供从肌醇（myo-inositol)生产D-手性肌醇 值-chiro-inositol)的方法，其特征在于，包括：步骤（曰)，使用（i)包含操作性地与启动子 相结合的肌醇转运体（myo-inositoltransporter)编码脱氧核糖核酸序列的重组载体W 及（ii)包含操作性地与启动子相结合的肌醇脱氨酶（inositoldehy化Ogenase)编码脱氧 核糖核酸序列及肌糖异构酶（inososeisomerase)编码脱氧核糖核酸序列的重组载体来转 化宿主细胞，从而得到转化的宿主细胞；W及步骤化），在包含肌醇的培养基中培养上述转 化的宿主细胞。
[0015]W下，按照各步骤对本发明进行更详细的说明。
[0016] 步骤（a)为使用包含肌醇转运体编码脱氧核糖核酸序列、肌醇脱氨酶编码脱氧核 糖核酸序列及肌糖异构酶编码脱氧核糖核酸序列的重组载体来转化宿主细胞，从而得到转 化的宿主细胞的步骤。
[0017] 在本说明书中，术语"肌醇转运体（myo-inositoltransporter)"意味着 使肌醇向细胞内移动的运输酶。大部分细胞具有向细胞内吸收培养基内的肌醇的肌 醇运输系统，从哺乳动物的细胞到细菌的多种细胞中确认了肌醇转运体。据报告，在 产 气杆菌(Aerobacteraero邑enes)扣eshusses,J.,andReber,G.,1972,Biochim. Bio地ys.Acta274,Bacteriol. 126, 243-250]、恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida) [Rebe;r,G. ,Belet,M.,andDeshusses,J. ,1977,J.Bacterol. 131,872-875]、假单胞菌 (Pseudomonas)属[Gauchat-Feiss,D. ,Frey,J. ,Belet,M. ,andDeshusses,J. , 1985,J. Bacteriol. 162,324-327]等的细菌中分离了肌醇转运体基因，在酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae) (Nikawa,J. ,Nagumo,T. ,andYamashita,S. (1982) J.Bacteriol. 150, 441-446)等的酵母中也分离了肌醇转运体基因。并且，众所周知，肌醇转 运体存在主型（major)和副型（minor)。
[0018] 本发明中所使用的肌醇转运体可使用源自哺乳动物细胞、酵母细胞或细菌的转 运体，优选地，可使用源自细菌的转运体。更优选地，可使用从枯草芽抱杆菌度acillus subtilis)、鼠伤寒沙 口氏菌（Salmonellatyphimurium)或根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)分离的转运体，最优选地，使用源自鼠伤寒沙口氏菌（Salmonella typhimurium)的转运体。
[0019] 优选地，本发明的肌醇转运体可使用选自由具有在沈QIDNO. 1至沈QIDNO.6 中公开的氨基酸序列的蛋白质组成的组中的一种W上的转运体。
[0020] 在本说明书中，如W下反应式1所示，术语"肌醇脱氨酶"为具有催化借 助烟酷胺腺嚷岭二核巧酸（NAD)依赖性氧化作用来将肌醇转换为2-酬基-肌醇 (2-keto-myo-inositol)的化学反应或其逆向反应的活性的酶。在本说明书中，"肌醇脱氨 酶"还被记载为对其进行编码的基因名称"iolG"。
[0021] [反应式^
[0022]肌醇+烟酷胺腺嚷岭二核巧酸（氧化态）（NAD+) < --- > 2-酬基-肌醇+烟酷 胺腺嚷岭二核巧酸（还原态）（NADH)+H+
[0023] 据报告，肌醇脱氨酶从产气杆菌（Aerobacteraerogenes)[Berman T'MagasanikB(1966).J.Biol.Chem. 241 (4):800-806;LARNERJ,JACKSONWT,GRAVES DJ,STAMERJR(1956).Arch.Biochem.Bio地ys. 60 (2) : 352-363]和酵母隐球菌蜜二糖 (Cryptococcusmelibiosum)[Vidal-LeiriaM,vanUdenN(1973).Biochim.Biophys. Acta. 293(2) :295-303]分离。
[0024] 优选地，在本发明中可使用的肌醇脱氨酶从根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)、枯草芽抱杆菌度acillussubtilis)、谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum)或渡萝泛菌（Pantoeaananantis)分离。更优选地，本发明的肌醇脱氨酶可使 用选自由具有在沈QIDNO. 21、沈QIDNO. 23、沈QIDNO. 25、沈QIDNO. 27、沈QIDNO. 29 及SEQIDNO. 31中公开的氨基酸序列的蛋白质组成的组中的一种。
[00巧]在本说明书中，如W下反应式2所示，术语"肌糖异构酶"为具有催化将2-酬 基-肌醇转换为1-酬基-D-手性肌醇（l-keto-D-chiro-inositol)的异构化反应或其逆 向反应的活性的酶。在本说明书中，"肌糖异构酶"还被记载为对其进行编码的基因名称 "ioll"。
[002引[反应式引
[0027] 2-酬基-肌醇< > 1-酬基-D-手性肌醇
[0028] 优选地，在本发明中可使用的肌糖异构酶从根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)、枯草芽抱杆菌度acillussubtilis)、谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum)或渡萝泛菌（Pantoeaananantis)分离。更优选地，本发明的肌糖异构酶可 使用选自由具有在沈QIDNO. 22、沈QIDNO. 24、沈QIDNO. 26、沈QIDNO. 28及沈QID NO. 30中公开的氨基酸序列的蛋白质组成的组中的一种。
[0029] 借助上述反应式2生成的1-酬基-D-手性肌醇借助W下反应式3来生成作为本 发明中的最终产物的D-手性肌醇。由前述的"肌醇脱氨酶"催化W下反应式3的反应。
[0030][反应式引
[0031] 1-酬基-D-手性肌醇+烟酷胺腺嚷岭二核巧酸（还原态）（NADH) +H+< - >D-手 性肌醇+烟酷胺腺嚷岭二核巧酸（氧化态）（NAD+)
[0032] 在本发明中，肌醇在宿主细胞内借助反应式1至反应式3的连续反应来转换为 D-手性肌醇，如上所述，由"肌醇脱氨酶"催化反应式1及反应式3的反应，由"肌糖异构酶" 催化反应式2的反应。
[0033] 在本发明中，肌醇转运体编码脱氧核糖核酸序列、肌醇脱氨酶编码脱氧核糖核酸 序列、肌糖异构酶编码脱氧核糖核酸序列在重组载体内操作性地与启动子相结合。
[0034] 在本说明书中，术语"操作性地相结合（operativelylinked)"意味着功能性地与 脱氧核糖核酸序列的表达调节序列相结合，借助功能性结合，由表达调节序列调节脱氧核 糖核酸序列的表达。
[0035] 在本说明书中，术语"启动子"意味着可调苄基因编码序列或功能性核糖核酸 (RNA)的表达的脱氧核糖核酸序列。
[0036] 本发明中的载体可通过本领域公知的多种方法构建，其相关具体方法公开于 山姆布鲁克等（Sambrooketal.)的"分子克隆，实验室手册（Mole州IarCloning,A L油oratoryManual)"(冷泉港实验室出版社，2001)中，该文献插入于本说明书作为参照。
[0037] 本发明的重组载体可由用于克隆或表达的载体构建，并且可将原核细胞或真核细 胞作为宿主来构建。
[0038] 例如，在本发明的载体为表达载体，并W原核细胞作为宿主的情况下，通常，载体 包含可进行转录的强力启动子（例如，PLA启动子、trp启动子、Iac启动子、T7启动子、 tac启动子等）、用于开始翻译的核糖体结合部位及转录/翻译终止序列。在利用大肠杆 菌巧.COli)作为宿主细胞的情况下，大肠杆菌色氨酸生物