重组质粒载体pACYCD-StiolTl-StiolT2来执行了实验。各符号的实验组如下。: pCOLAD-Cgi巧-PaiolI,O:pCOLAD-sAtiep-sAti巧f，▲:pC0LAD-AG化628-AG化627，▽: pCOLAD-BsiolG-BsiolI，^ :pC0LAD-CgiolG-Cgioll0169,长：pCOLAD-Pai化-Paioll。
[0068]图10示出利用在本发明中选择的转化的大肠杆菌来在最佳的培养条件下执行IL 的发酵，从而确认从肌醇生产D-手性肌醇的实验结果。
[0069] 图11为借助本发明的菌株生产的D-手性肌醇分馈物的气相色谱-质谱（GC-M巧 分析结果。
【具体实施方式】
[0070]W下，通过实施例对本发明进行更详细的说明。运些实施例仅用于更加具体地说 明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围并不受运些实施例的限制，运对于本发明所属
技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。
[00川实施例
[0072] 实施例1:肌醇转运体基因的克隆及包含转运体的重组载体的制备
[0073]从有报告指出将肌醇用作碳源的枯草芽抱杆菌度acillusSUbtiliS)、鼠伤寒沙 口氏菌（Salmonellatyphimurium)、根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens)分别克隆 了肌醇转运体（my〇-inositoltransporter)的主（major)基因及副（minor)基因。
[0074] 在枯草芽抱杆菌度.subtilis)中，肌醇转运体基因为iolT基因和iolF基因，在 鼠伤寒沙口氏菌（S.typhimurium)中，肌醇转运体基因为iolTl基因和iolT2基因，在根癌 农杆菌（A.tumefaciens)中，肌醇转运体基因为Atu5935基因和AU12525基因。W上基因 的信息如表1。
[00巧]表1[0076]
[0077] 1-1.重组载体pACYCD-BsiolT(F2)及pACYCD-BsiolT-BsiolF(F2)的制备
[0078] 在枯草芽抱杆菌度.subtilis)菌株的情况下，从Bacillussubtilissubsp. subtilisStr. 168(taxid:224308;GenBankNID:NC_000964，ATCC23857)的基因组脱 氧核糖核酸将主转运体io口及副转运体iolF导入pACYCDuet-1表达载体，来构建 pACYCD-BsiolT(F2)和pACYCD-BsiolT-BsiolF(F2)。若具体说明，则利用引物BsiolT-F2 和Bsio口-R来从枯草芽抱杆菌度.subtilis)的基因组脱氧核糖核酸扩增io口之后，用 限制酶SacI和BamHI裂解，并插入于载体pACYCDuet-1 (Novagen)的相同部位来制备了 pACYCD-BsiolT(F2)。并且，利用引物BsiolF-F和BsiolF-R来扩增iolF之后，用限制酶 NdeI和Sail裂解，并插入于所制备的上述pACYCD-BsiolT(F2)的NdeI和化〇1部位，从而 制备了pACYCD-BsiolT-BsiolF(F2)。
[0079] 1-2.重组载体pACYCD-StiolTl(F2)及pACYCD-StiolTl-StiolT2 (F2)的制备
[0080] 在鼠伤寒沙口氏菌仅typhimurium)菌株的情况下，从Salmonella entericasubsp.entericaserovarTyphimuriumstr.LT2ATCC700720(taxid:99287 ； GenBankNID:NC_006511,ATCC700720)扩增作为主转运体的iolTl及作为副转运 体的io口2,来向pACYCDuet-1表达载体导入，从而构建了pACYCD-StiolTl(F2)和 pACYCD-StiolTl-StiolT2(F2)。若具体说明，则利用引物StiolTl-F2 及StiolTl-R来从 鼠伤寒沙口氏菌（S.typhimurium)的基因组脱氧核糖核酸扩增iolTl之后，用限制酶化Ol 和BamHI裂解，并插入于pACYCDuet-1载体的相同部位，来制备了pACYCD-StiolTl(F2)。 并且，利用引物StiolT2-F和StiolT2-R来扩增iolT2之后，用限制酶NdeI和Sail裂 解，并插入于所制备的上述载体pACYCD-Sti01T1 (F2)的NdeI和化〇I部位，从而制备了 pACYCD-StiolTl-StiolT2(F2)。
[0081] 1-3.重组载体94〔￥〔0-4化5935(。2)及94〔￥〔0-4化5935-4化2525(。2)的制备 [008引在根癌农杆菌（A.tumefaciens)的情况下，利用引物Al:u5935-F2和 Atu5935-R来从Agrobacteriumtumefaciensstr.C58(taxid:176299；GenBank NID:NC_003062，ATCC33970)的基因组脱氧核糖核酸扩增A化5935 之后，用限制酶化oI 和BamHI裂解，并插入于pACYCDuet-1载体的相同部位，来制备了pACYCD-AUi5935(F2)。 并且，利用引物AU12525-F和AU12525-R来扩增AU12525之后，用限制酶NdeI和Sail 裂解，并插入于所制备的上述pACYCD-A化2525 (F2)的NdeI和化01部位，从而制备了 pACYCD-A化5935-A化2525(F2)。
[0083] 1-4.重组载体pCOLAD-sAti巧-sAtiepf的制备
[0084] 为了评价克隆的上述肌醇转运体的活性，从根癌农杆菌（A.tumefaciens)克隆将 肌醇转换为D-手性肌醇的肌醇脱氨酶（inositoldehy化Ogenase)基因（iolG)及肌糖 异构酶（inososeisomerase)基因（ioll)，并将它们导入载体pCOLADuet-1 (Novagen), 来制备了重组质粒载体pCOLAD-sAtiep-sAtiepf。若更详细地说明，则WAgrobacterium sp.AB10121(W0 02/055715A)的抓171257_CDS1和CDS2的氨基酸序列为基础，执行脱氧 核糖核酸合成[GenScriptInc. , 860CentennialAve. ,Piscataway,NJ08854,USA]，来 分别制备了合成的脱氧核糖核酸分子sAtiep(SEQIDNO. 50)和合成的脱氧核糖核酸分 子sAti巧f(SEQIDNO. 51)。W上述合成的脱氧核糖核酸分子sAti巧为模板，使用引物 sAtiep-TF和sAti巧-TR来进行多聚酶链式反应（PCR)扩增之后，用限制酶BspHI和SacI裂 解，并将其插入于pCOLADuet-1的相同限制酶部位，来制备了pCOLAD-sAtiep。接着，将上述 合成的脱氧核糖核酸分子sAtiepf用NdeI和Sail裂解，并将其插入于上述所制备的载体 pCOLAD-sAtiep的NdeI部位和)(hoI部位，最终制备了重组载体pCOLAD-sAtiep-sAti巧f。
[0085] 表2整理了用于上述重组载体的制备的引物，表3整理了所制备的重组载体及与 此相关的序列信息。
[0086]表2
[0087]
[00川实施例2:肌醇转运体的活性的评价
[0092] 将作为在上述实施例1中制备的，包含源自枯草芽抱杆菌化subtilis)、鼠 伤寒沙口氏菌（S.typhimurium)、根癌农杆菌（A.tumefaciens)的肌醇转运体的各 重组质粒、pACYCD-BsiolT(F2)、pACYCD-BsiolT-BsiolF(F2)、pACYCD-StiolTl(F2)、 pACYCD-StiolTl-StiolT2 巧2)、pACYCD-Atu5935 巧2)、pACYCD-Atu5935-Atu2525 巧2) 与包含将肌醇转换为D-手性肌醇的肌醇脱氨酶及肌糖异构酶编码基因的重组质粒 pCOLAD-sAtiep-sAtiepf一同转化于大肠杆菌巧.coli)I3L21值E3)，从而制备了转化菌株。
[0093] 在直径为25mm、高度为150mm的玻璃试验管培养了 5血的所制备的重组转化菌株。 培养条件如下：利用含有1% (w/v)的肌醇、50mg/L的氯霉素、50mg/L的卡那霉素的M9最 小培养基，来在30°C溫度及25化pm的条件下，当菌体达到光密度为0.6时，添加ImM的异丙 基-0-D-硫代半乳糖巧来进行诱导（imluction)后，培养了 48小时。为了分析肌醇及D-手 性肌醇，对培养液进行离屯、分离，来取ImL的培养上清液，并煮10分钟之后，重新进行离屯、 分离，从而取SOOiiL的上清液。对经预处理的培养上清液进行高效液相色谱法（Shima化U LClOAvp)分析，分析条件如下：采用KromasU-SN肥柱（4.6mmX250mm)，流动相为75 %的 乙腊（acetonitrile),柱溫度为40°C，并利用示差折射率巧I)检测器。图2示出肌醇及 D-手性肌醇及它们的异构体的高效液相色谱法色谱图。
[0094] 图3示出测定各肌醇转运体的活性的结果。根据图3的结果，在pACYCDuet-1均 含有源自鼠伤寒沙口氏菌（S.typhimurium)的主转运体和副转运体的StiolTl和Stio口2 的pACYCD-StiolTl-StiolT2的情况下，D-手性肌醇的转换率最优秀，在源自枯草芽抱杆菌 度.subtilis)和根癌农杆菌（A.tumefaciens)的肌醇转运体中，D-手性肌醇的转换率非常 低。在转换率最优秀的鼠伤寒沙口氏菌的转运体的情况下，在24小时内，从lOg/L的肌醇 转换为约1. 2g/L的D-手性肌醇，在48小时内，转换出约1.Ig的D-手性肌醇，呈现出在24 小时之后，转换率并不上升。在菌体生长方面，在导入基因的情况下，呈现出稍微被抑制的 形态，由于转运体蛋白质的特性，转运体位于细胞膜，因而当过度表达时，呈现出毒性。
[0095] 实施例3:肌醇脱氨酶及肌糖异构酶基因的克隆W及包含其的重组载体的制备
[0096] 通过W下反应式1至反应式3的连续反应，从肌醇转换为D-手性肌醇。由肌醇脱 氨酶（inositoldehy化Ogenase)催化反应式1及反应式3的反应，由肌糖异构酶（inosose isomerase)催化反应式2的反应。
[0097][反应式1]
[009引肌醇+烟酷胺腺嚷岭二核巧酸（氧化态）（NAD+) < --- > 2-酬基-肌醇+烟酷 胺腺嚷岭二核巧酸（还原态）（NADH)+H+
[009引[反应式引
[0100] 2-酬基-肌醇< ->1-酬基-D手性肌醇
[0101] [反应式3]
[0102] 1-酬基-D-手性肌醇+烟酷胺腺嚷岭二核巧酸（还原态）（NADH) +H+< - >D-手 性肌醇+烟酷胺腺嚷岭二核巧酸（氧化态）（NAD+)
[0103] 从根癌农杆菌（A.tumefaciens)、枯草芽抱杆菌化subtilis)、谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacteriumglutami州m)、渡萝泛菌（Pantoeaananantis)克隆具有与肌醇脱氨酶 (iolG)及肌糖异构酶（ioll)相同的功能的基因。从上述菌株的