为0.6时添加0.1% 的乳糖。除此之外的培养条件与上述项目4-1中所说明的内容相同，图8示出其结果。在 异丙基-0-D-硫代半乳糖巧的情况下，与上述项目4-2的结果相同，确认到初期生长被抑 审IJ，在添加乳糖的组中，未确认到运种形态。在初期添加0.5%的乳糖的情况下，D-手性肌 醇的生产速度最快，在光密度为7时添加乳糖的情况下，确认到D-手性肌醇的生产也相应 地变晚的形态。乳糖借助菌体生长并表达的IacZ基因，来形成异乳糖（allolactose)，运会 启动本发明的表达载体的T7启动子。目P，只有菌体适应高浓度的肌醇，即适应高渗透压环 境并开始生长，启动子才会启动，因而基于运种乳糖的表达可被视为减少菌体的毒性。
[0143] 通过W上实施例4确认的最佳培养条件为使用TB培养基来将乳糖预先添加于培 养基中，并在37°C的溫度下进行培养，利用该条件来执行了之后的实验。
[0144] 实施例5 :D-手性肌醇转换基因活性的比较
[0145] 将在上述实施例3中构建的作为表达肌醇脱氨酶及肌糖异构酶的表达载 体的pCOLAD-sAtiep-sAtiepf、PC0LAD-AGRL628-AGRL627、pCOLAD-BsiolG-BsiolI、 pC0LAD-CgiolG-CgiolI0169、pCOLAD-Pai化-Paioll、pCOLAD-Cgi巧-PaiolI的各载体与作 为在实施例2中确认转运体活性的肌醇转运体的pACYCD-StiolTl-StiolT2重组质粒载体 一同导入于大肠杆菌巧.COli)化21 0E3)，来制备了6种重组菌株。利用在实施例4中经实 验的最佳发酵条件来培养了所制备的重组菌株。图9示出对培养的测定结果。
[0146] 从D-手性肌醇的对数生产时期（约8小时至24小时）的生产速度（图 9的似部分）来看，重组质粒pCOLAD-AG化628-AG化627呈现最低，即0. 09， 口〇)1^\0-34^巧-34116口^胖0 02/055715)也^0.14呈现出低水平。在本发明中选择的基 因中，肌醇脱氨酶与〔旨16口、肌糖异构酶与化1〇11的组合，即，在口〇)1^\0-〔旨1巧斗曰1〇11中， W0. 48的梯度呈现出最快转换为D-手性肌醇，运个值比最低的pCOLAD-AG化628-AG化627 的情况快约5. 3倍，比表示第二次速度的pC0LAD-CgiolG-CgiolI0169(0. 26)的情况高1.8 倍。在培养40小时之后生产的D-手性肌醇的浓度也在pCOLAD-Cgi巧-PaiolI中最高。最 终菌体生长速度总体上在约12小时W内进入停止期，菌体浓度也与W上的D-手性肌醇的 生产速度成正比，在pCOLAD-sAtiep-sAtiepf中最低，在pCOLAD-Cgiep-PaiolI中最高。最 终，在导入9〇)1^\0-〔旨1巧斗曰1〇11的情况下，从150旨/1的肌醇转换出22.7旨/1的0-手性肌 醇，转换率为约15. 1%。在转换率最低的pCOLAD-sAti巧-sAtiepf中，转换出约12. 5g/L的 D-手性肌醇，转换率停留在约8. 3%。基于上述结果，将导入pCOLAD-Cgi巧-PaiolI的重组 大肠杆菌菌株作为生产菌株来进行了发酵实验。
[0147] 实施例6:通过重组菌株的发酵的生产量的增大
[0148] 利用在W上执行的培养最佳化结果和从优秀基因的选择结果中得到的最佳重组 菌株来执行了IL的发酵。在MRADO-PDA(韩国大田CNS公司）化的发酵槽中WIL的容 量执行发酵。种子培养（seedculture)使用2YT培养基，在本培养中，向TB培养基中添 加15%的肌醇、0. 5%的乳糖。在使溫度、pH、DO稳定的发酵槽中接种培养到光密度为3的 50mL的种子培养液之后，培养了约20小时。将发酵溫度调节为37。利用氨水来将抑调 节为7. 0,并在将DO减少为40%W下之后，增加转速来维持在40%W上。图10示出发酵结 果。菌体在18小时时最多达到光密度为18,D-手性肌醇在约12个小时时达到作为平衡浓 度的约20g/L之后，不再增加。
[0149] 实施例7:所生产的D-手性肌醇的分馈及气相色谱-质谱分析
[0150] 从微生物生产的D-手性肌醇的分馈利用高效液相色谱法（Shima化ULClOAvp)来 执行。分析条件如下：采用KromasU-SN肥制备柱（IOmmX250mm)，流动相为75%的乙腊 (acetonitrile),柱溫度为40°C，并利用示差折射率巧I)检测器，注入IOOiil的试样，并 W4mL/分钟的流速流出，来取得相应峰值（peak)的溶出液。利用真空浓缩机（日本东京 理化公司，EYELA)来对所收集的溶出液进行浓缩及干燥，之后溶解于5mL的蒸馈水，来实施 了气相色谱-质谱分析。
[015。 气相色谱-质谱分析使用了化ima化UGCMS-QP2010。分析之前的处理如下：在W 1:1混合1-S甲基娃烷基咪挫（l-t;rimeth5dsyly]_-imidazole)和[I比晚（pyridine)而成的ImL的溶液中溶解Img的试样，之后在70°C的溫度下反应30分钟来用于分析。分析条件如 下：使用HP-I毛细管柱（capillarycolumn)(长度（Xength)为 30m，内径（ID)为 0. 25mm， 薄度（Film)为 0. 25Jim)，向分割模式注射器（Splitmodeinjector) (1:50)注入 1Ji1 的 试样，并WImL/分钟的流速进行了分析。试样的注入溫度为280°C，烘箱的溫度在150°C 下维持2分钟后，W20°C/分钟的速度上升至300°C后维持了 2分钟。将分析结果的质谱 (M巧文件与标准试样D-手性肌醇（Sigma468045,美国西格玛公司）的文件进行了比较， 并将其结果示于图11。与标准试样进行比较，其结果，确认到准确一致。
[0152] W上，对本发明的特定部分进行了详细记述，对于本发明所属技术领域的普通技 术人员来说，运种具体记述仅仅是优选实施例，很显然，本发明的范围并不限定于此。因此， 本发明的实质性的范围应根据所附的发明要求保护范围和其等同技术方案来定义。
【主权项】
1. 一种从肌醇生产D-手性肌醇的方法，其特征在于，包括： 步骤（a)，使用（i)包含操作性地与启动子相结合的肌醇转运体编码脱氧核糖核酸序 列的重组载体以及（ii)包含操作性地与启动子相结合的肌醇脱氢酶编码脱氧核糖核酸序 列及肌糖异构酶编码脱氧核糖核酸序列的重组载体来转化宿主细胞，从而得到转化的宿主 细胞；以及 步骤（b)，在包含肌醇的培养基中培养所述转化的宿主细胞。2. 根据权利要求1所述的从肌醇生产D-手性肌醇的方法，其特征在于，所述肌醇转运 体为选自由具有在SEQ ID NO. 1至SEQ ID NO. 6中公开的氨基酸序列的蛋白质组成的组中 的一种以上。3. 根据权利要求1所述的从肌醇生产D-手性肌醇的方法，其特征在于，所述肌醇脱 氢酶为选自由具有在 SEQ ID NO. 21、SEQ ID NO. 23、SEQ ID NO. 25、SEQ ID NO. 27、SEQ ID NO. 29及SEQ ID NO. 31中公开的氨基酸序列的蛋白质组成的组中的一种。4. 根据权利要求1所述的从肌醇生产D-手性肌醇的方法，其特征在于，所述肌糖异构 酶为选自由具有在 SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO. 28 及 SEQ ID NO. 30中公开的氨基酸序列的蛋白质组成的组中的一种。5. 根据权利要求1所述的从肌醇生产D-手性肌醇的方法，其特征在于，所述宿主细胞 为动物细胞、昆虫细胞、酵母或原核细胞。6. 根据权利要求5所述的从肌醇生产D-手性肌醇的方法，其特征在于，所述宿主细胞 为原核细胞。7. 根据权利要求1所述的从肌醇生产D-手性肌醇的方法，其特征在于，在所述步骤 (b)之后，还包括从培养了所述转化的宿主细胞的培养物分离D-手性肌醇的步骤（c)。8. -种宿主细胞，其特征在于，使用（i)包含操作性地与启动子相结合的肌醇转运体 编码脱氧核糖核酸序列的重组载体以及（ii)包含操作性地与启动子相结合的肌醇脱氢酶 编码脱氧核糖核酸序列及肌糖异构酶编码脱氧核糖核酸序列的重组载体来转化所述宿主 细胞。9. 根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述肌醇转运体为选自由具有在SEQ ID NO. 1至SEQ ID NO. 6中公开的氨基酸序列的蛋白质组成的组中的一种以上。10. 根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述肌醇脱氢酶为选自由具有在 SEQIDN0.21、SEQIDNa23、SEQIDNa25、SEQIDN0.27、SEQIDNa29&SEQIDNa31 中公开的氨基酸序列的蛋白质组成的组中的一种。11. 根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述肌糖异构酶为选自由具有在 SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO. 28 及 SEQ ID NO. 30 中公开的氨 基酸序列的蛋白质组成的组中的一种。12. 根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为动物细胞、昆虫细 胞、酵母或原核细胞。13. -种用于从肌醇生产D-手性肌醇的用途的组合物，其特征在于，所述用于从肌醇 生产D-手性肌醇的用途的组合物包含所述权利要求8至12中任一项所述的宿主细胞。14. 一种用于从肌醇生产D-手性肌醇的重组载体试剂盒，其特征在于，包含如下重组 载体作为有效成分，所述重组载体分别为（i)包含操作性地与启动子相结合的肌醇转运体 编码脱氧核糖核酸序列的重组载体以及（ii)包含操作性地与启动子相结合的肌醇脱氢酶 编码脱氧核糖核酸序列及肌糖异构酶编码脱氧核糖核酸序列的重组载体。15. 根据权利要求14所述的用于从肌醇生产D-手性肌醇的重组载体试剂盒，其特征在 于，所述肌醇转运体为选自由具有在SEQ ID NO. 1至SEQ ID NO. 6中公开的氨基酸序列的 蛋白质组成的组中的一种以上。16. 根据权利要求14所述的用于从肌醇生产D-手性肌醇的重组载体试剂盒，其特征在 于，所述肌醇脱氢酶为选自由具有在SEQ ID NO. 21、SEQ ID NO. 23、SEQ ID NO. 25、SEQ ID NO. 27、SEQ ID NO. 29及SEQ ID NO. 31中公开的氨基酸序列的蛋白质组成的组中的一种。17. 根据权利要求14所述的用于从肌醇生产D-手性肌醇的重组载体试剂盒，其特征在 于，所述肌糖异构酶为选自由具有在SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO. 28及SEQ ID NO. 30中公开的氨基酸序列的蛋白质组成的组中的一种。
【专利摘要】本发明涉及利用表达酶肌醇转运体、肌醇脱氢酶及肌糖异构酶的转化的宿主细胞来从肌醇生产D-手性肌醇的方法。根据本发明的方法，能够以高收率将肌醇转换为D-手性肌醇。
【IPC分类】C12N15/63, C12N15/52, C12P7/18, C12N1/21
【公开号】CN105229152
【申请号】CN201380061680
【发明人】明贤君, 尹相活, 李炫抒
【申请人】(株)韩国迪外天然健康
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2013年9月26日
【公告号】EP2902492A1, EP2902492A4, US20160017376, WO2014051358A1