基因组脱氧核糖核酸扩增 与iolG基因及ioll基因相对应的基因，并将扩增的iolG基因及ioll基因的基因对及组 合插入于pCOLADuet-1表达载体（Novagen),来制备了6种重组质粒。下列表4示出上述所 列的iolG及ioll的同源基因的f目息。
[0104] 表 4
[0105]
[0107] 3-1.重组载体pCOLAD-sAtiep-sAti巧f的制备
[010引 从AgrobacteriumSP.AB10121 菌株（WO02/055715A)制备包含iolG基因及ioll 基因的重组载体pCOLAD-sAtiep-sAti巧f的方法已经在上述实施例1中进行了说明。
[0109] 3-2.重组载体PC0LAD-AGRL628-AGRL627 的制备
[0110] 通过W下方法制备了包含源自根癌农杆菌（A.tumefaciens)的iolG基因及ioll 基因的重组载体。利用引物AGI?L628-F和AGI?L628-R来从Agrobacteriumtumefaciens Str.C58(taxid:176299;GenBankNID:NC_003062，ATCC33970)的基因组脱氧核糖核 酸扩增相当于iolG基因的AG化628基因，并将其用限制酶化il和SacI裂解，来向 pCOLADuet-1 (Novagen)的化〇1和SacI部位导入，从而制备了pCOLAD-AG化628。并且， 利用AG化627-F引物和AG化627-R引物，来扩增相当于io11基因的AGRL_627，并将其用 限制酶NdeI和Sail裂解，来插入于pCOLAD-AG化628的NdeI和化Ol部位，从而制备了pCOLAD-AG化628-AG化627重组载体。
[01 川3-3.重组载体pCOLAD-BsiolG-BsiolI的制备
[0112] 通过W下方法制备了包含源自枯草芽抱杆菌度.SUbtiliS)的iolG基因及ioll 基因的重组载体。利用BsiolG-F引物及BsiolG-R引物来从Bacillussubtilissubsp.subtilisStr. 168(taxid:224308;GenBankNID:NC_000964，ATCC23857)的基因组脱氧核 糖核酸扩增相当于iolG的BsiolG之后，用限制酶化il和NotI裂解，并插入于pCOLADuet-1 的化〇1和NotI部位，来制备了pCOLAD-BsiolG。并且，利用BsiolI-F引物和BsiolI-R引 物，来扩增相当于ioll的BsiolI,并将其用限制酶NdeI和化Cl处理，插入于在上述构建的 质粒pCOLAD-BsiolG的相同的限制酶的部位，从而制备了pCOLAD-BsiolG-BsiolI。
[011引 3-4.重组载体pC0LAD-CgiolG-CgiolI0169 的制备
[0114] 通过W下方法制备了包含源自谷氨酸棒状杆菌杞glutamicum)的iolG基因 及ioll基因的重组载体。利用CgiolG-F引物和CgiolG-R引物，来从Coirnebacterium glutamicumATCC13032(taxid:196627;GenBankNID:NC_00：M50，ATCC13032)的基 因组脱氧核糖核酸扩增相当于iolG的CgiolG之后，用限制酶BspHI和NotI裂解，并 插入于pCOLADuet-1的化〇1和NotI部位，从而制备了pCOLAD-CgiolG。并且，利用 CgiolI0169-F引物和CgiolI0169-R引物来扩增相当于ioll的CgiolI0169,并用NdeI 和化Cl处理，来插入于在上述构建的pCOLAD-CgiolG的相同的限制酶部位，从而制备了 pC0LAD-CgiolG-CgiolI0169 载体。
[0115] 3-5.重组载体pCOLAD-Pai化-PaiolI的制备
[0116] 通过W下方法制备了包含源自渡萝泛菌（Pantoeaananantis)的iolG基因 及ioll基因的重组载体。利用Pai化-F引物和化i化-R引物，来从Pantoeaananatis LMG20103(taxid:706191，GenBankNID:NC_013956,KCCM40419)的基因组脱氧核糖核酸扩 增相当于iolG的化i化之后，用限制酶化il和NotI裂解，并插入于pCOLADuet-1的化Ol 和NotI部位，来制备了pCOLAD-Pai化。并且，利用化ioll-F引物和化ioll-R引物，来 扩增相当于ioll的化ioll，并将其用NdeI和化Cl处理之后，插入于所制备的上述载体 pCOLAD-Pai化的相同的限制酶部位，从而制备了pCOLAD-Pai化-Paioll。
[0117] 3-6.重组载体pCOLAD-Cgi巧-PaiolI的制备
[0118] 为了制备组合源自不同的菌株的iolG基因及ioll基因的重组载体，首先， 在谷氨酸棒状杆菌杞glutamicum)基因组上，克隆了作为iolG基因的抓171257_ CDSl(GI: 27877069)的同源性低且未被报告功能的iolG同源基因Cgiep(NCgl2957 或GI: 19554252)。并且，在相当于ioll的基因的情况下，同样将与作为ioll基因 的抓171257_CDS2(GI:27877069)的同源性低且未被报告功能的作为源自渡萝泛菌 (P.ananatis)的ioll的化ioll用于组合中。若更详细地说明，则利用引物Cgi巧-F 和Cgi巧-R来从Corynebacteriumglutami州mATCC13032(taxid:196627;GenBank NID:NC_003450,ATCC13032)的基因组脱氧核糖核酸扩增Cgi巧之后，用限制酶BspHI和 NotI处理并裂解，并插入于pCOLADuet-1的化〇1和NotI部位，来制备了pCOLAD-Cgi巧。 之后，用NdeI和化Cl将pCOLAD-Cgi巧处理并裂解，并在其中插入W相同的限制酶裂解的 PaiolI,从而最终制备了pCOLAD-Cgiep-PaiolI载体。
[0119] 下列表5示出在上述实施例3中用于制备重组载体的引物，下列表6对上述所制 备的重组载体进行了整理。
[0120] 表 5
[012引表6[0123]
[0124] 3-7.克隆的基因的同源性
[01巧]图4及图5示出克隆的iolG基因及ioll基因的系统树，下列表7及表8示出运 些基因的同源性分析结果。
[012引表7
[012引 表8
[0129]
[0131] 实施例4 :D-手性肌醇生产菌株的最佳培养条件的确定
[0132] 在实施例3中制备的重组质粒中，将pC0LAD-Cgi巧-PaiolI与 pACYCD-StiolTl-StiolT2 (F2) -同导入大肠杆菌化21值E3)菌株，来试图实现重组菌株培 养的最佳化。
[0133] 4-1.基于培养溫度的D-手性肌醇的生产率的调查
[0134] 在300血的具有凹槽化affled)的S角瓶中培养了 50血。培养条件如下：利用包 含15% (w/v)的肌醇、50mg/L的氯霉素、50mg/L的卡那霉素的TB培养基（terrificbroth) 来在30°C和37°C的溫度及18化pm的条件下培养了约40小时。在光密度为0.6时，添加浓 度为ImM的异丙基-0-D-硫代半乳糖巧，来进行了诱导（imluction)。在培养条件中，所添 加的肌醇的浓度W相应溫度下的溶解度（约16~17% (w/v))为基准来定。
[0135] 为了分析肌醇及D-手性肌醇，对培养液进行离屯、分离，取ImL的培养上清液， 并煮10分钟后重新进行离屯、分离，来取500yL的上清液。对于经预处理的培养上清液 进行高效液相色谱法（Shima化ULClOAvp)分析，分析条件如下：采用KromasU-SN肥柱 (4.6mmX250mm)，流动相为75 %的乙腊（acetonitrile)，柱溫度为40°C，并利用示差折射 率巧I)检测器。图6示出W上的结果。
[0136]TB培养基中的碳源甘油在30°C及37°C的溫度下，均在约24小时时耗尽，与此相 对应地，菌体生长也在约24小时时停止。在碳源耗尽、菌体生长停止的24个小时，D-手性 肌醇在30°C的溫度下，生成约12旨/1，在37°(：的溫度下，生成约14g/l，是前者的约1.2倍。 在菌体生长停止后，继续转换为D-手性肌醇，在37°C的溫度下，经过约28小时，增加为约 19邑/1，在30°C的溫度下，经过约32小时，增加为约19g/L。
[0137] 众所周知，运种从肌醇到D-手性肌醇的转换有反应平衡的干预灯OShida et al.，AEM72, 2006)。目P，在肌醇与D-手性肌醇之间有着约86:14的物理化学反应平衡的干 预，相当于150g/L的肌醇的D-手性肌醇的量为约20g/L。运在本实施例中也实验性地得 到了确认。目P，在添加D-手性肌醇来进行培养的情况下，生成了接近W上的反应平衡比率 的肌醇（结果未显示）。基于运种结果，所生产的19g/L的D-手性肌醇的量是添加150g/L 的肌醇来进行培养所得到的最大值。在溫度为37°C的情况下，达到运种反应平衡的时刻也 比在30°C的溫度条件快约4小时。最终，就培养溫度方面，确认了合适的培养溫度为37°C。
[0138] 4-2.基于诱导时期的D-手性肌醇的生产率
[0139] 观察了导入pACYCD-StiolTl-StiolT2(F2)和pC0LAD-Cgi巧-PaiolI的大肠杆 菌化2〇)E3)菌株基于诱导时期的D-手性肌醇的生产率。将未添加作为诱导剂的异丙 基-0 -D-硫代半乳糖巧的组为阴性对照组，分别在培养初期的0时间、光密度为0.6、光密 度为3、光密度为10时，并分别进行投放来在37°C的溫度下确认了生产率。除此之外的培 养条件与上述项目4-1相同，图7示出培养结果。
[0140] 在未执行基于异丙基-0-D-硫代半乳糖巧的诱导（in化Ction)的组和在完全停 止生长后的光密度为10时添加异丙基-P-D-硫代半乳糖巧来进行诱导的组中，呈现出非 常低水平的D-手性肌醇的生产量。在开始培养时，投放异丙基-0 -D-硫代半乳糖巧的组 中，初期呈现出严重的菌体生长抑制形态。即使在光密度为0.6和光密度为3的组中，若 被诱导（imluction)，则即刻呈现出菌体生长被抑制的形态，究其原因，可能是由于借助异 丙基-0-D-硫代半乳糖巧来使蛋白质表达，并本应用于菌体生长的氮源、碳源等被消耗在 蛋白质合成上，或蛋白质导致肌醇转运体的膜受损。最终，确认在光密度为0.6或光密度 为3时，即在对数期初期，菌体多少适应新的培养基环境，并在开始对数生长时投放诱导剂 (inducer)，运是最优选的。
[014。 4-3.基于诱导剂的种类的D-手性肌醇的生产率的确认
[014引 观察了导入pACYCD-StiolTl-StiolT2(F2)和pC0LAD-Cgi巧-PaiolI的大肠杆 菌化2UDE3)菌株的基于诱导剂（imlucer)的种类的D-手性肌醇的生产率。由于作为诱 导剂的异丙基-P-D-硫代半乳糖巧呈现出抑制细胞生长的形态，因而添加了可替代异丙 基-e-D-硫代半乳糖巧的乳糖作为诱导剂。W调节添加时期和添加量的方式添加乳糖，在 初期，光密度为0.6、光密度为7时添加0.5 % (w/v)的乳糖，或在光密度