合成途径的启动子、操纵子部位 (Yanofsky，C.，J.Bacteriol.，158:1018-1024(1984))及隧菌体A的左向启动子（PL入启 动子，Herskowitz,I.andHagen,D. ,Ann.Rev.Genet. , 14:399-445 (1980))可被用作调节部 位。
[0039] 本发明的载体可包含本领域中通常所使用的抗生素抗性基因作为选择标记， 例如有氨节西林（ampicilin)、庆大霉素（gentamicin)、簇节青霉素（carbenicillin)、 氯霉素（chloramphenicol)、链霉素（streptomycin)、卡男P霉素（kanamycin)、遗传霉素 (geneticin)、新霉素（neomycin)及四环素（tetra巧cline)的抗性基因，但并不限定于此。 上述抗生素抗性基因W可操作的方式与用于表达其的启动子相连接。
[0040] 本发明中可使用的载体可通过对在本领域中经常使用的质粒（例：pSClOl、 0〇化1、口8尺322、口1]〔8/9、口肥79、口66乂系列、口61'系列及口1](：19等）、隧菌体（例：^邑145\6、 入-化aron、ArZL及M13等）或病毒（例：SV40等）进行操作来制备。
[0041] 优选地，本发明的载体为原核细胞用载体，包含在原核宿主细胞，尤其在大肠杆菌 巧.COli)中可复制的核酸序列。因此，本发明的载体可包含coIA、co化1或P15A的细菌 的复制原点或如florigin等的隧菌体的复制原点。
[0042] 作为可稳定且连续克隆及表达本发明的重组载体的宿主细胞，还可使用本领域公 知的任何宿主细胞。例如，可举哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母等的真核细胞或原核细胞， 但优选地，使用原核细胞。原核细胞例如有作为大肠杆菌的E.COliJM109、E.COliBL21、 E.COliRR1、E.COliLE392、E.COliB、E.COliX1776、E.COliW3110、枯草芽抱杆菌、苏云 金芽抱杆菌等的芽抱杆菌属菌株、鼠伤寒沙口氏菌、粘质沙雷菌、谷氨酸棒状杆菌及多种假 单胞菌属等的肠道菌和菌株等。
[0043] 在宿主细胞为原核细胞的情况下，将本发明的载体向宿主细胞内运输的方法有 CaC12 方法（Cohen,S.N.etal. ,Proc.化tl.Acac.Sci.USA, 9:2110-2114(1973))、Han址an 方法（Cohen,S.N.etal.,Proc.化tl.Acac.Sci.USA, 9:2110-2114(1973);及Han址an,D.， J.Mol.Biol.，166:557-580 (1983))及电穿孔方法值ower,W.J.etal.，Nucleic.Acids Res.，16:6127-6145(1988))等。
[0044] 步骤化）：在包含肌醇的培养基中培养上述转化的宿主细胞
[0045] 在培养上述转化的宿主细胞期间，重组表达载体内的肌醇转运体、肌醇脱氨酶及 肌糖异构酶被表达，培养液内的肌醇被吸收到细胞内，从而借助上述酶的催化作用，转换为 D-手性肌醇。
[0046]转化的宿主细胞的培养可通过公知的宿主细胞培养方法或对其进行变形的方法 来执行。例如，在宿主细胞为大肠杆菌巧.COli)的情况下，若用于培养转化的宿主细胞 的培养基包含大肠杆菌可有效利用的碳源、氮源、无机盐等，则可使用天然培养基或合成 培养基。可使用的碳源包含葡萄糖（glucose)、果糖（化UCtose)、薦糖（sucrose)等的碳 水化合物；淀粉、淀粉的水解物；乙酸（aceticacid)及丙酸（propionicacid)等的有 机酸；乙醇（ethanol)、丙醇（propanol)、甘油（glycerol)等的乙醇（alcohol)等。氮源 包含氨（ammonia);氯化锭（ammoniumchloride)、硫酸锭（ammoniumsulfate)、醋酸锭 (ammoniumacetate)及憐酸锭（ammonium地OS地ate)等的无机酸或有机酸的锭盐；蛋白 腺（peptone)、肉类提取物（meatextract)、酵母提取物（yeastextract)、玉米浆（corn Ste巧liquor)、干酪素（casein)水解物、大豆提取物、大豆水解物；多种发酵的细胞及它 们的分解物等。无机盐包含憐酸二氨钟（potassiumdihy化Ogenphosphate)、憐酸氨二钟 (dipotassiumhydrogenphosphate)、憐酉《儀（magnesiumphosphate)、硫酉《儀（magnesium sulphate)、氯化钢（sodiumchloride)、硫酸儘（manganesesulfate)、硫酸铜（^copper sulfate)、碳酸巧（^calciumcarbonate)等。
[0047] 通常，在振荡培养或借助旋转器的旋转等的有氧条件下进行培养。优选地，培养溫 度在10至40°C的范围内，培养时间通常为5小时至7天。优选地，在培养过程中，培养基 的抑维持在3.0至9.0的范围内。培养基的抑可由无机酸或有机酸、碱溶液、尿素、碳酸 巧、氨等调节。在培养的过程中，若有需要，可为了维持及表达重组载体而添加氨节西林、 链霉素、氯霉素、卡那霉素及四环素等的抗生素。在培养转化为具有可诱导（imluction) 的启动子的重组表达载体的宿主细胞的情况下，若有需要，可向培养基添加适当的诱导剂 (in化cer)。例如，在表达载体包含Iac启动子的情况下，添加异丙基-0 -D-硫代半乳糖巧 (IPTG，isop;ropy；L-0 -D-thiogalactopyranoside)，在表达载体包含t;rp启动子的情况下， 可向培养基添加吗I噪丙締酸（indoleac巧lie acid)。
[0048] 根据本发明的优选实例，本发明的方法在上述步骤（b)之后，还包括从培养了上 述转化的宿主细胞的培养物分离D-手性肌醇的步骤（C)。
[004引步骤（C):从培养了上述宿主细胞的培养液分离D-手性肌醇
[0050] 使用分离及纯化碳水化合物（carbohy化ate)或糖（sugar)的公知的方法及其变 形的方法，来从培养了转化的宿主细胞的培养液分离D-手性肌醇。
[0051] 在D-手性肌醇W溶解于培养基上的状态存在的情况下，从培养基去除所培养的 转化体。例如，通过离屯、分离法或微孔过滤法（microfiltration)等，来从培养液去除所培 养的转化体，从而仅得到培养上清液。从培养上清液得到D-手性肌醇的方法可使用W往的 公知的糖的分离纯化方法及其变形的方法。
[0052]W往公知的糖的分离纯化方法有基于利用沸石（zeolite)分子筛的选择性吸附 方法的分离方法（美国专利第4482761号）、基于利用阳离子交换树脂的柱层析法的分离方 法（美国专利第5096594号）、基于使用阴离子交换树脂的柱层析法的分离方法（美国专利 第5482631号）、基于活性炭的吸附及基于有机溶剂的溶出方法（韩国特许第10-0753982 号）、冷冻干燥及再结晶化方法等，可使用运些方法，或组合运些方法的变形的方法及运些 方法来使用，但并不限定于此。
[0053] 根据本发明的再一实施方式，本发明提供宿主细胞，使用（i)包含操作性地与启 动子相结合的肌醇转运体编码脱氧核糖核酸序列的重组载体W及（ii)包含操作性地与启 动子相结合的肌醇脱氨酶编码脱氧核糖核酸序列及肌糖异构酶编码脱氧核糖核酸序列的 重组载体来转化上述宿主细胞。
[0054] 根据本发明的另一实施方式，本发明提供包含上述转化的宿主细胞的用于从肌醇 生产D-手性肌醇的用途的组合物。
[00巧]根据本发明的还一实施方式，本发明提供用于从肌醇生产D-手性肌醇的重组载 体试剂盒，上述用于从肌醇生产D-手性肌醇的重组载体试剂盒包含如下重组载体作为有 效成分，上述重组载体分别为（i)包含操作性地与启动子相结合的肌醇转运体编码脱氧核 糖核酸序列的重组载体W及（ii)包含操作性地与启动子相结合的肌醇脱氨酶编码脱氧核 糖核酸序列及肌糖异构酶编码脱氧核糖核酸序列的重组载体。
[0056] 在作为本发明的再一实施方式的宿主细胞、包含该宿主细胞的组合物及包含重组 载体的试剂盒中，关于上述肌醇转运体、肌醇脱氨酶及肌糖异构酶、包含对上述肌醇转运 体、肌醇脱氨酶及肌糖异构酶进行编码的脱氧核糖核酸序列的重组表达载体、包含上述重 组表达载体的宿主细胞的内容与上述的本发明的一实施方式的内容相同，因而不进行重复 说明。
[0057]有益效果
[0058] 本发明设及利用表达上述酶肌醇转运体、肌醇脱氨酶及肌糖异构酶的转化的宿主 细胞来从肌醇生产D-手性肌醇的方法。根据本发明的方法，能够将肌醇转换为D-手性肌 醇。
【附图说明】
[0059] 图1示出肌醇（myo-inositol)和D-手性肌醇值-chiro-inositol)的化学结构。
[0060] 图2示出肌醇和D-手性肌醇W及它们的立体异构体或衍生物的高效液相色谱法 (HHX)色谱图。
[0061] 图3示出在向表达肌醇脱氨酶及肌糖异构酶的大肠杆菌追加导入多源的肌醇转 运体来得到的转化大肠杆菌中，测定从肌醇到D-手性肌醇的转换率及菌体生长率的结果。 对肌醇转运体的各试验组为培养将转运体表达载体与pCOLAD-sAti巧-sAtiepf-同导入 来制备的重组大肠杆菌24小时及48小时的结果。白色柱表示在培养24小时之后测定的 值，灰色柱表示在培养48小时之后测定的值。
[0062] 图4示出基于肌醇脱氨酶（iolG)的同源性分析的系统树（phylogenetictree)。
[0063] 图5示出基于肌糖异构酶（ioll)的同源性分析的系统树（phylogenetictree)。
[0064]图6a至图6c示出基于培养溫度的本发明的转化的大肠杆菌的从肌醇到D-手性 肌醇的转换率的测定结果。各符号的实验组如下。在图6a中，? ：30°C，O:37°C，在图化 中，溫度为30°C的情况下，O:菌体生长，? ：pH，▲:甘油的剩余量，在图6c中，溫度为37°C 的情况下，O:菌体生长，?神，▲:甘油的剩余量。
[0065] 图7示出当培养本发明的转化的大肠杆菌时基于诱导（imluction)时期的从肌醇 到D-手性肌醇的转换率的测定结果。各符号的实验组如下。:未诱导（Noimluction)， O:在时间为0时诱导（in化ction)，▲:在光密度（OD)为0.6时诱导（in化ction)，▽:在 光密度为3时诱导（in化ction)，?:在光密度为10时诱导（in化ction)。
[0066]图8示出当培养本发明的转化的大肠杆菌时基于诱导剂种类的从肌醇到D-手性 肌醇的转换率的测定结果。各符号的实验组如下。:在光密度为0.6时添加ImM的异丙 基-0-D-硫代半乳糖巧（IPTG)，O:在时间为0时添加0. 5%的乳糖（lactose)，▲:在光密 度为0.6时添加0.5 %的乳糖（lactose)，▽:在光密度为7时添加0.5 %的乳糖（lactose), ?:在光密度为0. 6时添加0.I%的乳糖（lactose)。
[0067] 图9示出导入了源自多种菌株的肌醇脱氨酶及肌糖异构酶基因或它们的组合的 重组菌株的D-手性肌醇生产率（图9的（A)部分）、菌体生长（图9的做部分）及生 产速度的梯度（图9的（C)部分）的测定结果。向转化的大肠杆菌一同导入肌醇转运体 表达