细菌人工染色体的制作方法

细菌人工染色体的制作方法
【专利说明】细菌人工染色体 发明领域
[0001] 本发明设及适于操作、维持并增殖RNA病毒基因组的感染性CDNA的质粒载体系 统，W及所述载体系统的应用。
【背景技术】
[0002] 先前，已将数种黄病毒和其它RNA病毒的拷贝DNA(CDNA)克隆进入不同低拷贝 细菌载体，W克服其固有的毒性（归因于病毒序列的大尺寸和隐蔽表达）@redenbeek 等.（2003)J.Gen.Virol. 84,1261-1268 ;Durbin，等.（2006)HumVaccin. 2,255-260 ; Fan和Bird(2008)J.Virol.Methods. 149,309-315;Li等.（2011)化OSOne6,el8197; Pu等.（2011)J.Virol.85,2927-2941;化ce等.（1989)化wBiol.l，285-296)Almaz扫n 等.（2008)MethodsMolBiol. 454,275-91)。已将克隆的cDNA作为模板使用，W产生感 染性重组病毒，通过体外合成或RNA基因组的转染度redenbeek等，2003,如上所引）， 或通过将该病毒CDNA纳入表达盒，该表达盒包含启动子，例如允许从转染的质粒DNA转 录病毒RNA的CMV-IE(巨细胞病毒即刻早期（immediateearly))启动子巧n化anes 等.（2001)J.Biotechnol. 88,183-204;Hall等.（2003)Proc.化tl.Acad.Sci.USA. 100， 10460-10464)。引导减毒的手足口病（Ward等.（1997)J.Virol. 71，7442-7447)和库宁病 毒化all等.（2003)Proc化tlAcadSciUSA. 100,10460-10464)的表达的所述病毒表达 盒已被用作实验DNA疫苗。尽管包含病毒表达盒的低拷贝数载体系统能W稳定的方式保持 在细菌宿主细胞中，它们存在重要缺陷：其仅允许W仅仅足够于小规模实验应用的量纯化 感染性病毒cDNA。因此，其作为感染性病毒CDNA的常规来源的应用（例如在活CDNA疫苗 生产中的应用）是不可能的。
[0003] 病毒DNA疫苗的生产需要大量扩增克隆载体，W获得足够的DNA，但运些扩增方法 受到严重的约束。为了避免突变，包含病毒DNA的载体在防止诱变事件（重组、突变、增加 错配修复等）的条件下增殖。细菌人工染色体度AC)的稳定性是已知的，并且其可包含多 达500化或更多的插入。
[0004] 然而，带有外源DNA的运种载体的大小对于细菌而言是个沉重负担，并且其复制 需要大量代谢努力。此外，核巧酸的耗尽可导致突变增加。最终，会出现外源DNA的不希望 的表达（所谓隐蔽表达），运可造成毒性重组蛋白质。隐蔽转录本的毒性蛋白质的产生是黄 病毒DNA所固有的，并且仅能通过降低质粒的拷贝数来解决。事实上，载体的拷贝数越高， 毒性蛋白质的浓度越高。结果是，细菌宿主可能会相反选择（counterselect)突变，其中运 些蛋白质不表达。
[0005] 化等.（2011)J.Virol. 85,2927 - 2941，详细描述了解决细菌中的黄病毒cDNA的 固有毒性的各种尝试。运些包括包含病毒基因组的部分的质粒的体内连接、特定宿主、避免 隐蔽表达的突变体，W及低拷贝数质粒。
[0006] 因此，在细菌中W单一拷贝出现的BAC的应用为运些问题提供了解决方案。
[0007] 低拷贝数不是运些应用的缺点，其中BACDNA随后被亚克隆或扩增W提高浓度，并 且其中通过运些技术引入的一些突变对于设想的实验并不是至关重要的。然而，所述扩增 方法无法应用于DNA疫苗的制造中，运使得BAC在DNA疫苗的大规模质粒制备中并不是优 选的载体。需要超大规模培养来获得大量的BAC。
[0008] 从Wild等.（2002)基因组Res. 12,1434-1444已知诱导型BAC载体的应用，由此， BAC的拷贝数从每细胞1个拷贝增加至多达每细胞100个拷贝或甚至更多。尽管该系统提 供了增加BACDNA产量的方法，还是存在合理的担屯、，即，诱导后复制系统的活性的强力增 加会增加突变频率。因此，DNA疫苗的制造需要运样一种系统，其中所述系统能够获得载体 的高拷贝数，但其中所述载体发生复制却不引入无法耐受的突变。

【发明内容】

[0009] 本发明通过提供一种载体，所述载体能W低拷贝数在宿主细胞中稳定保持，但能 通过调节其宿主的培养条件来大量扩增，而不发生不希望的诱变事件，从而解决了本领域 就载体系统中制备疫苗而言的病毒CDNA的扩增问题。本发明的另一个目的在于，提供运样 一种载体，所述载体能够在酵母和细菌宿主之间穿梭，从而提供非常通用的系统，所述系统 可按控制来操作酵母和细菌遗传系统中的载体。
[0010] 本发明出乎预料地证明，BAC载体的拷贝数的可诱导增加提供了具有低得惊人的 突变速率的DNA。甚至更令人吃惊的是，发生的少数突变大部分是移码突变或终止密码子， 导致表达后的截短形式。点突变（其没有作用或导致修饰的氨基酸）则代表性不足。
[0011] 该预料之外的效果导致有利作用，即，能获得高量载体，并且有限量的错误导致非 功能性病毒基因组，而不导致相较于原始克隆的构建体而言毒力会增加的突变病毒基因 组。
[0012] 本发明提供一种细菌人工染色体，其包含诱导型细菌ori序列，该序列允许诱导 所述细菌人工染色体扩增至高拷贝数，例如，通过调节细菌宿主的培养条件来进行。本文 所用的细菌人工染色体还包含病毒表达盒，所述病毒表达盒包含侧接有顺式-调节元件的 RNA病毒基因组的cDNA，其在将所述细菌人工染色体导入哺乳动物细胞之后促进所述病毒 CDNA的转录，并且允许将转录的RNA加工成感染性病毒RNA。所述病毒表达盒中所含的病 毒CDNA可W对应于野生型RNA病毒基因组的那些或是嵌合病毒CDNA构建体，其中，异源性 DNA序列已被插入，和/或，天然病毒序列已删除、截短或突变。通常而言，异源性DNA序列 编码一种或多种肤/蛋白质，其在本发明的细菌人工染色体被引入哺乳动物细胞之后，由 重组病毒异源表达，本发明的细菌人工染色体包含含有所述嵌合病毒CDNA的病毒表达盒。 所述细菌人工染色体还可包含用于穿梭至酵母或在酵母中保持所述细菌人工染色体的酵 母自主复制序列。穿梭至酵母细胞或在酵母细胞中保持本发明的细菌人工染色体的可能性 提供了可按控制在酵母和细菌遗传系统中进行遗传操作的优势。同样地，本发明提供一种 单一载体系统，其适合于RNA病毒基因组的感染性CDNA的操作、维持和增殖。
[0013] 在不存在所述诱导型ori的刺激时，本发明的细菌人工染色体可用于实现细菌 宿主中感染性病毒CDNA的稳定克隆，而所述刺激存在时，所述CDNA能被容易地扩增，随 后分离并使用。本发明的细菌人工染色体在待作为抵抗RNA病毒病原体的活疫苗（life vaccine)使用的病毒cDNA的开发、稳定性保持和生产中尤为有用。或者，所述细菌人工染 色体用于保持并从CDNA增殖天然或重组病毒（例如，出于研究目的）。
[0014] 本发明中，采用具有诱导型细菌ori的BAC来制备病毒表达盒的疫苗，所述病毒表 达盒包含用于在哺乳动物细胞中转录病毒CDNA和用于将转录的RNA加工成感染性病毒RNA的顺式调节元件和RNA病毒的cDNA。
[001引令人吃惊的是，包含所述病毒DNA的BAC的多个拷贝的产生并不会导致已知采用 高拷贝数系统会出现的缺陷。
[0016] 一般而言，在细菌系统中会产生毒性蛋白质，运归因于病毒序列的隐蔽表达。事 实上，黄病毒感染性克隆的生产传统上受到细菌中其全长CDNA的毒性的干扰。已采用多 种方法来克服该问题，包括极低拷贝数质粒和细菌人工染色体的应用（在E血onds(2013) J.Virol. 87, 2367-2372中讨论）。运是设及插入的现象，所述插入被克隆进入BAC，从而阻 碍细菌生长和代谢。其中没有发生隐蔽表达的带有突变的细菌具有生长优势，并且会使原 始群落过度生长。现有技术中，运由细菌集落的大小反映。非突变构建体产生毒性蛋白质， 并且通常获得小集落。突变构建体产生较少或不产生毒性蛋白质，运导致出现较大集落。
[0017] 基于该现有技术知识，从而预计质粒复制的诱导将导致毒性转录本的增加，W及 伴随的不发生隐蔽表达的突变体的增加。
[001引令人吃惊的是，诱导型复制系统似乎对隐蔽蛋白质的毒性不敏感。事实上，相比现 有技术的高拷贝数系统，细菌集落在某种程度上更大，运指示细菌宿主对最后的毒性蛋白 质较不敏感。更重要的是，非常大的集落，代表没有出现突变质粒。
[0019] 该发现，即诱导型系统对毒性蛋白质不敏感，是预料之外的。现有技术中并没有教 导表示该系统会对毒性蛋白质不敏感（或该毒性蛋白质并没有产生）。
[0020] 诱导型系统的另一个缺点是固有地产生BAC的多拷贝。事实上，诱导型系统的作 者解释，BAC克隆的最重要的特点是因其极低拷贝数所致的其稳定性。如上所引的Wild 等.（2002)显示，拷贝数甚至可通过添加葡萄糖而被进一步降低。该单一拷贝状态通过减 少克隆之间的胞内重组的机会而改善了BAC文库的保留稳定性。运证明，Wild等公布的诱 导型系统并没有减低只要BAC的多个拷贝存在于宿主细胞中就会很快发生的不希望的重 组事件的变化。本领域技术人员应理解，诱导和随后的高拷贝数会重新引入重组事件。因 此，技术人员会避免采用所述系统来制备待用于疫苗接种目的的DNA。
[002。 本发明中，已在诱导型ori系统中扩增BAC，并且已测试所述扩增的BAC的重组事 件。预料之外地，重组事件十分罕见。
[0022] 此外，除了测试重组事件W外，还测试了扩增的BAC是否存在其它突变。发生突变 的频率非常低，此外，错义部分令人吃惊地低于理论预期情况。如果发生突变，则主要是无 义突变或导致无功能病毒RNA的移码突变。
[002引本发明允许显著扩大DNA疫苗生产的规模。例如，目前的减毒活(life-attenuated)黄热病疫苗的主要生产商尚无法满足存在的需求。采用本发明技术，将 能够W相较于目前的减毒活疫苗而言显著降低的成本和更高的质量生产DNA疫苗，由此满 足长期W来的需求。
[0024] 同样地，对于其它病毒性疾病，例如巧V、WNV、麻疹、风疹和HIV疫苗，需要一种能 够提供足量DNA的疫苗制备平台。
[00巧]本发明的第一方面设及细菌人工染色体度AC)用于制备疫苗的应用，其中所述BAC包含：
[0026] -诱导型细菌ori序列，其用于扩增所述BAC至每个细菌细胞多于10个拷贝，和
[0027] -病毒表达盒，其包含减毒RNA病毒基因组的cDNA，并且包含用于在哺乳动物细胞 中转录所述病毒cDNA和用于将转录的RNA加工成感染性RNA病毒的顺式-调节元件。
[0028] 减毒RNA病毒基因组的CDNA的实施方式是RNA病毒基因组的嵌合病毒CDNA构建 体，其中，异源性DNA序列已被插入，或其中，天然病毒序列已缺失、被截短或突变。
[0029] 所述病毒表达盒的实施方式包括：
[0030] -正链RNA病毒基因组的cDNA，
[003。 -RNA聚合酶驱动的启动子，其位于所述cDNA的5'端之前，用于起始所述cDNA的 转录，和
[003引-供于RNA自切割的元件，其位于所述CDNA的3'端之后，用于在设定位置切割所 述病毒cDNA的RNA转录本。
[0033] 正链RNA病毒的实施方式有：黄病毒、丙型肝炎病毒、疫病毒、囊膜病毒、小核糖核 酸病毒、冠状病毒、戊型肝炎病毒，和專状病毒。
[0034] 在一个典型实施方式中，所述病毒表达盒包含黄热病病毒的cDNA，例如减毒活 YFV-17D黄热病病毒疫苗的cDNA。
[0035] 在其它实施方式中，所述病毒表达盒包含属于下组的病毒的cDNA:负链RNA病毒、 双链RNA病毒或双义RNA病毒。
[0036] 在特定实施方式中，所述细菌人工染色体还包含酵母自主复制序列，所述酵母自 主复制序列用于穿梭至酵母，并将所述细菌人工染色体保留在酵母中。
[0037] 酵母ori序列的一个示例是2Ji质粒起点或ARSl(自主复制序列1)或其功能同 源衍生物。
[0038] 在某些实施方式中，所述RNA聚合酶驱动的启动子是RNA聚合酶II启动子，例如 巨细胞病毒即刻早期（CMV-re)启动子、猴病毒40启动子或其功能同源衍生物。
[0039] 在其它实施方式中，所述RNA聚合酶驱动的启动子是RNA聚合酶I或III启动子。
[0040] 用于RNA自切割的元件的示例是：T型肝炎病毒的基因组核酶或功能同源RNA元 件的cDNA。
[0041] 在【具体实施方式】中，所述病毒表达盒包含减毒活YFV-17D疫苗的cDNA，其中，编码 病毒颗粒表面蛋白的一种或多种CDNA序列缺失、被截短或突变，从而YFV-17D的所述功能 性病毒颗粒表面蛋白不表达，并且编码异源性蛋白质的CDNA序列插入所述YFV-17DcDNA。 所述异源性蛋白质的一个示例是黄病毒的病毒颗粒表面蛋白。
[0042] 病毒表达盒的实施方式包含减毒活YFV-17D疫苗的cDNA，其中，插入一种或多种 无关的CDNA序列，其表达为所述病毒多聚蛋白中的一种或多种异源性蛋白质。
[0043] 在其它实施方式中，所述病毒表达盒包含病毒cDNA，其中，插入外源CDNA序列，其 由所述重组病毒异源表达。
[0044] 另一个方面设及制备针对RNA病毒的疫苗的方法，所述方法包括如下步骤：a)提 供用第一方面及其多种实施方式中所述的用BAC转染的细菌宿主
[0045] b)通过添加能够激活所述诱导型ori的化合物来扩增所述BAC
[0046] C)分离该扩增的BAC，
[0047] d)将所述BAC配制成疫苗。
[0048] 另一个方面设及：第一方面及其多种实施方式中所述的BAC，所述BAC被用作疫 苗。
[0049] 本发明的另一个方面设及：第一方面及其多种实施方式中所述的BAC，所述BAC用 于预防RNA病毒感染。
[0050] 另一个方面设及：第一方面及其多种实施方式中所述的BAC作为活DNA疫苗的应 用。
[0051] 另一个方面设及：第一方面及其多种实施方式中所述的BAC用于从所述CDNA增殖 天然或重组病毒的应用。
[0052] 另一个方面设及：第一方面及其多种实施方式中所述的细菌人工染色体度AC)作 为BAC用于制备疫苗的应用。
[00閲发明详述
【附图说明】
[0054]图1.RNA病毒表达质粒的pShuttleBAC系列的生成。（A)图显示：作为起始载体 构建体的pShuttleBAC/Rne的构建。度）图显示pShuttleBAC/Rne衍生的黄病毒表达载体 的构建，通过插入病毒cDNA，通过SV40启动子（SV40P)和皿V核酶（皿rz)之间的同源重组 来进行上述构建。
[005引图2.增强大肠杆菌中pShuttleBAC构建体的质粒稳定性。通用质粒图谱显示现有 技术黄病毒CDNA质粒（A)和新型pShuttleBAC载体系列度，DNA-YFVax)的设计原理。其 中转化（A)和度）各自的单一集落之后的大肠杆菌在37°C生长过夜，并铺板在选择培养基 上。总体而言，A型构建体长成的集落尺寸比B型的那些小得多（分别示于图2C和D)。此 外，A型构建体产生具有宽范围集落尺寸的后代（图2C的右侧图显示标准化的集落直径）， 指示有时候使运些CDNA对于大肠杆菌的毒性较低的突变质粒克隆的选择和分离。克隆分 析鉴定了多种可能的潜在突变，包括病毒E/NS1区域中的转座子插入