采用pShuttle/DV2转染的BHK-21细胞的转染后（P.t.) 7天的经清除处理的上清 液来解育亚融合Vero-B培养物，其在4%的多聚甲醒中固定5天后，并基本按照先前所述进 行免疫染色值eBur曲graeve等.（2012)PL〇S0肥7，e37244)。通过DENV2血清型特异性 单克隆抗体（mAb)3册.l(密理博）和AlexaFluor-488标记的二抗（密理博）来检测胞内 E蛋白表达。DAPI染色后，细胞采用化Oid细胞成像工作台（生命技术公司）观察。
[0136] 小鼠的体内转染.
[0137] 将10-20yg的质粒DNA与作为运载体的33 %丙二醇中的20yg碳酸巧微米花混 合（Fumoto等.（2012)Mol. 9,1962-1970)，并腹膜内注射进入成年（约 20g)AG129 小 鼠。或者，腹膜注射半剂量的减毒活YFV-17D疫苗（S化maril?.赛诺菲己斯德MSD公司，布 鲁塞尔）。每天监测体重和行为。
[013引 结果
[0139] 如果转染进入哺乳动物细胞，则正确加工的YFV-17DRNA的转录由pShuttle/ YF17D启动（图3B)，其起始胞内自我维持的病毒复制（图3A)。用pShuttle/YF17D转染的 细胞最终分泌感染性病毒颗粒，其在表型上，关于其在组织培养物中诱导细胞病变作用的 能力）（图4A-C)、病毒产量和空斑表型（图4D+E)，无法与亲本YFV-17D病毒区分。因此， 产生的重组病毒能够被认为是在生物学上相同的（数量和质量上）。同样地，用P化Utte/ DV2转染的细胞产生重组感染性DENV2新几内亚株C(图5)。
[0140]pShuttle/YF17D在AG129小鼠（建立的一种YFV-17D感染的致死体内小鼠模型） 中的腹膜内转染，（Meier等.（2009)PLoSPathog. 5,el000614Jhibodeaux等.（2012)疫 苗30,3180-3187)，导致与真实YFV疫苗Stamaril廢相似的病毒诱导的死亡率（图6)和发 病率（图7)。因此，该方便、强健且可重复的系统能够允许W低成本开发出针对YFV的DNA 疫苗，而无需真核细胞培养物或鸡胚蛋。不再需要冷链，并且可通过无针方式给予。
[014。 实施例4 :p化uttle/YF17D值NA-YFVax)在通过皮下途径和通过无针喷射注射裸 质粒DNA所感染的AG129小鼠中诱导的发病率和死亡率。
[0142] 为了评估除了腹膜内途径W外的，用于施予pShuttle/YF17D(DNA-YFVax)的其它 途径的可行性，数组（n= 3) 9周龄雄性AG129小鼠（雄性，重22-25g)用100yL憐酸盐缓 冲盐水（PB巧中的25yg的DNA-YFVax注射，通过（i)采用注射器和G27针头经皮下（S. C.) 或（ii)通过经批准用于人类临床用于经皮施用（例如，膜岛素或麻醉剂）的应用的无针喷 射注射器（Injex-30,德国柏林的Injex制药股份有限公司）经皮（t.d.)给予。AG129用与 200yL33 %丙二醇中的碳酸巧微晶配制的25ygDNA-YFVax(如之前作为对照组）i.p.注 射。发病率和死亡率向先前那样评分，实验在30天之后终止（参见表2)。
[014引表2 :用DNA-YFVax通过不同途径注射的雄性AG129小鼠的死亡率。
[0146]M孤-平均至死亡天数；n.a.-不适用
[0147] 通过S. C.和t. d.途径注射DNA-YFVax的AG129小鼠中的至少一些发展出YFV-17D 诱导的疾病的迹象（体重损失、皮毛起皱、背僕、迟缓性后肢擁痕）而必须被安乐死。最重 要的是，通过无针喷射注射的全部小鼠在自YFV-17D诱导的脑炎17 + 2天内统一死亡，而全 部i.P.注射的对照小鼠在实验时程中存活（30天）。观察过程中，对照组中缺乏死亡率的 现象（相比实施例3中出现的13 + 2的MDD)能够容易地通过所用雄性动物体重较重来解 释。
[0148] 注，采用碳酸巧作为运载体用于DNA-YFVax对于疫苗递送而言并不必然是最理想 的；即，有时候甚至在仓鼠中观察到一些抑制作用（参见实施例5)，运取决于注射途径和不 同批次的碳酸巧微米花之间的差异性。总之，DNA-YFVax能够W不同的制剂通过不同的注 射途径（包括通过无针喷射注射）被成功递送。
[0149] 实施例5 :叙利亚金仓鼠在用P化uttle/YF17D〇)NA-YFVax)免疫之后的血清转化
[0150] 为了评估通过DNA-YFVax的针对YFV的保护性免疫的诱导，采用临床前叙利亚金 仓鼠（Mesoc;rice1:usaura1:us)模型（Tesh等.（2001)JInfectDis. 183,1431-1436)。为 此，数组磁性仓鼠（8-10周龄，9〇-l〇〇g)通过腹膜内（i.p.)注射1/5剂量的Stamaril?a00yL)，或，如前所述用200yL的33%丙二醇中的碳酸巧微晶配制的20ygp化uttle/ YF17D〇)NA-YFVax)来免疫。W重复形式，替代性施用IOiigDNA-YFVax。每周在完全外科 麻醉的情况下，通过屯、脏穿刺取血，通过离屯、收获血清，并冻存在-80°C。两只未经处理的仓 鼠作为正常血清的供者。为了对保护相关的免疫评分，（i)通过间接免疫巧光试验（IIFA)， 和（ii)通过空斑-减少中和试验（PRNT)来分析血清。
[015。 间接免疫巧光试验（IIFA).通过经批准用于人临床应用的市售的YFVIIFA试剂盒（抓ROIMMUN医学实验诊断股份公司，德国吕贝克，目录号FI-2665-1005G和 FI-2665-1010G) (Nie化ig等.（2008)ClinVaccineImmunol. 15,177-81)，按照生产商的说 明稍加改变，测定免疫的仓鼠血清中的YFV-17D(Stamari陆和DNA-YFVax)特异性IgG抗 体。仓鼠血清在样品缓冲液中稀释20-、66-、200-、660-和2000倍，并且在￥。￥-1伴4载玻片 上施加30yL血清稀释物。载玻片在室溫解育30分钟，然后在包含0. 2%吐溫-20的PBS 中清洗5分钟。为了检测金仓鼠中诱导的抗体，門TC-标记的抗仓鼠IgG二抗（杰克森免 疫研究实验室公司，目录号307-095-003)在包含2%BSA的PBS中W1:50稀释，并替代试 剂盒中提供的抗人二抗而使用。载玻片用DAPI复染，并通过巧光显微镜测定端点效价。
[0152] 空斑减少中和试验（PRNT).黄热病免疫的仓鼠血清中的中和抗体效价采用PRNT 测定。简言之，0. 5x1〇6bHK细胞/孔铺板于12孔板，在生长培养基（MEM培养基，补充有10%FCS，l%碳酸氨钢和l%谷氨酷胺）中过夜。全部血清一式=份Wl:20、l:66、l:200、 1:660、1:2000和1:6600的系列稀释度测定。将30yL血清稀释物混合在30yL试验培 养基（与生长培养基相同，但仅包含2 %的FC巧，其包含YFV-17D病毒形成的40个空斑 (StamaHl巧，批次G5400P1，在Vero-B细胞上传代一次）。在37°C运样预吸附1小时之后， 添加440yL试验培养基，并将500yL各混合物添加至BHK细胞。室溫解育1小时之后，细 胞经清洗并用试验培养基（补充LMP琼脂糖（英杰公司）至终浓度0. 5% )覆盖。随后，在 37°C培养5天，用8%的甲醒混合2小时，并用吉姆萨（Giemsa)染剂染色。对空斑计数，并 根据Reed和Munch所述计算 50 % 中和效价（Reed和Muench(1938)Am.J.Hyg. 27,493-497)。 [015引总体而言，通过IIFA进行的交叉反应抗体的检测（表3)和通过PRNT进行的中和 抗体的检测（表4) 一致。关于疫苗功效，DNA-YFVax显示不劣于Sta姐MI? ;在两个试验组 中，3个个体中有2个（1 5別amaril够对比20ygDNA-YFVax)，和5个个体中有4个对比 4个个体中有2个（1/5S化mari俾对比10ygDNA-YFVax)血清转化至高效价的YFV交叉 反应和中和抗体（参见表3和4)。可认为运些值代表了完全保护性免疫（与保护相关的免 疫），其中PRNT效价MO的在致死YFV挑战仓鼠模型中具有保护性CJulander等.（2011) 疫苗29,6008-6016)。最重要地，WHO表示，已经〉0. 7的对数中和指数（LNI)与灵长类动物 中的疫苗接种后免疫保护相关，而运对人类也是如此（W册意见书（2013)Wkly.Epidemiol. Rec.88, 269-283.)。该PRNTLoglO效价〉0. 7的基准被仓鼠中的DNA-YFVax超出数个数量 级，超出多于150倍（参见表4)。
[0154] 此外，相比于St触朋i随，免疫应答在DNA-YFVax疫苗接种的个体中更具同源性， 在3周内一致检测到血清转化至高PRNT效价，而不是仅在4周后，即比来自S切mari惦组 的其它血清转化物晚3周。
[01巧]表3 :別amaril⑥和DNA-YFVax免疫的叙利亚金仓鼠中的YFV交叉反应抗体应答
[0157] ND=未检测；* (x/x)=血清转化的个体数/测试个体数
[0158] 表4.別amaii颐和DNA-YFVax免疫的叙利亚金仓鼠中的中和抗体应答
[0161]ND=未检测
[0162] 实施例6:评估克隆的YFV-17DcDNA的遗传不稳定性.
[0163] (a)起始材料：采用标准技术进行上述PACNR-FLYF17DII的度redenbeek 等.（2003))和pauittle/YFV-17D的大规模质粒制备。为此，将PACNR-FLYF17DII转化进 入标准大肠杆菌K12衍生株，铺板于含有100yg/mL氨节青霉素的LB-琼脂，并在28°C(替 代37°C)生长过夜，W利于质粒稳定性。将小集落扩大规模并在两个连续过夜培养物中于 28°C剧烈振荡下生长在包含100yg/mL的LB中，W最终达到IL的批次培养物。该批次在 28°C过夜生长，并最终通过添加氯霉素至终浓度20yg/mL另在28°C持续8小时来扩增。类 似地，将pShuttle/YFV-17D转化到大肠杆菌株EPI300-T细胞（爱彼森特）中，铺板于包 含20yg/mL氯霉素的LB-琼脂，并在37°C生长过夜。相应地将后者质粒扩大规模，而所有 生长在20yg/mL氯霉素的存在下于37°C进行。最终过夜批次培养物W1:6稀释进入包含 20yg/血氯霉素和0.Ol%k阿拉伯糖的新鲜LB培养基，并生长不超过6小时。质粒采用 标准柱亲和纯化法（凯杰）纯化，溶解于TE(IOmMTris-HCLlmM邸TA)至终浓度Iiig/mL， 并冻存与-20°C。
[0164] (b)集落生长和尺寸.将两种质粒转化进入大肠杆菌EPI300-T并在包含合适抗 生素作为选择培养基的MacConk巧琼脂（2%蛋白腺、0. 5%化Cl、l%乳糖、0. 15%胆汁盐、 0.003%中性红、0.0001 %结晶紫、1.35%琼脂）上划线。将无菌Zirkonia珠（直径2. 5mm) 包埋进入琼脂，W作为绝对尺寸测量的校准器。对于用pShuttle/YFV-17D转染的1等份细 菌，所述琼脂另包含0.Ol%k阿拉伯糖。在37°C解育16小时之后，采用常规数码相机（佳 能化wershotSXlOI巧拍照，并保存成JPEG文件（参见图9)。将图片导入化enCFU3.8. 11 版，用于关于集落计数和大小的图像分析Geissman(2013)化oS化e.8, 654072。
[0165] 携带扣huttle/YFV-17D的大肠杆菌克隆（图9B)生长出的尺寸远大于含 PACNR-FLYF17DII的克隆（图9A)，其群落也比含PACNR-FLYF17DII的克隆（图9A)更为均 一。预料之外的是，P化uttle/YFV-17D的运一表面上较低的毒性甚至保持在阿拉伯糖诱导 的状态中（图9C)。PACNR-FLYF17DII转化株群落（图9A)中存在的较大集落更可能包含 带有突变的质粒，所述突变消除毒性病毒蛋白质的隐蔽表达（参见实施例6)。
[0166] 图像分析显示包含pShuttle/YFV-17D的克隆对比包含PACNR-FLYF17DII的克隆 具有显著较高的均一性（表5)。事实上，PACNR-FLYF17D转化株能够明显分成至少两个不 同尺寸的亚群，表示导致（i)偏离平均值的大标准偏差（表5)，非高斯尺寸分布（图10A)， 和（iii)在例如计算的算术平均和中值集落尺寸之间存在较大差异（表5)。相反，带有 P化uttle/YFV-17D的转化体显示更加均一的集落尺寸（表5)和钟形的高斯尺寸分布（图 IOB) 。预料之外地，后者也完全适于pShuttle/YFV-17D的阿拉伯糖诱导的状态（表5,图 IOC) 。
[0167] 表5.对转化株集落尺寸（W mm计）的描述统计学评分 [016 引
[0170] 实施例7克隆的YFV-17DcDNA在大肠杆菌中的增殖过程中的突变模式和频率。
[0171] 为了落实包含YFV-17DCDNA的质粒的克隆遗传稳定性，将实施例6中所述的两 种质粒转化进入大肠杆菌EPI300-T，并在上文所述那样包含合适抗生素作为选择培养基的 MacConk巧琼脂上划线（参见实施例化）。PACNR-FLYF17DII克隆在28°C解育24小时，而 pamttle/YF17D克隆在37°C解育16小时。
[0172] 从各质粒挑取两个系列的各24-48个集落，供于质粒在200yL液体培养基（包含 合适抗生素的补充有20mMMgC12的LB)中的生长。分别选择一个PACNR-FLYF17DII系列 从小集落开始（pAS系列），并选择一个从大集落（pAL系列）开始。对于没有观察到主要尺 寸差异的pShuttle/Y17D(参见实施例化），选择具有合理尺寸差异的集落作为两个培养系 列，分别从较小（pSS系列）和较大集落（P化系列）开始。
[017引包含pACNR质粒的细菌在28°C解育24小时，而pShuttle集落在37°C解育过夜， 随后在包含氯霉素和0. 01%阿拉伯糖的600yLLB中解育6小时。分别采用引物#208和 #94 (对应YFV-17D核巧酸 1-940,W及 #953 和 #954 (对应YFV-17D核巧酸 2500-3600)，对 运些培养物[视作第0代（PO)的质粒]的部分直接进行PCR扩增（GoTaqGreen主混物， 普洛麦格）。
[0174] 扩增子亲和纯化（凯杰）并且分别采用引物#208和#953直接测序度igdye，应用 生物系统公司（AppliedBiosystems))。经分析，预计cDNA区域分别包含先前已知的毒性 决定簇的cDNA，即供于大肠杆菌中病毒5'未翻译区域中的不正常转录和翻译的隐蔽启动 子（Li等.（2011)，如上所引；化等.（2011)，如上所引），W及尤其是病毒E-NSl区域中的 疏水蛋白质延伸（YamshcWkov等.（2001)Vi;rology281，272-280)。
[0175] 各培养的克隆的另一部分W1/100在新鲜培养基中稀释并如前所述生长，W获得 下一传代（P1)。后者重复达10代（P10)。如前所述通过PCR和测序分析P1、P3和P3的质 粒。对于P10,质粒在较大体积的5血培养基中生长，并且通过标准碱性质粒小抽法分离质 粒。对运些质粒小抽物进行（i)PCR分析（祀向核巧酸1 - 940和2500 - 3600区域），然后 进行琼脂糖电泳检测，（ii)直接测序（如果能够检测PCR扩增子），和（iii)采用PstI进 行限制性酶切分析。P0、P1、P3和PlO的测序结果总结于表6和7。PlO的PCR和限制性分 析的结果总结于表8。
[0176] 早期传代发现的