专利名称：一种位点特异重组酶、其制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于遗传工程领域，涉及一种位点特异重组酶、其制备方法及应用。
背景技术：
位点特异性重组是重组的一类，只发生在特异DNA区域，有短的同源顺序， 重组的蛋白是int等，如噬菌体1的定点插入。在位点特异性重组 (site-specific recombination)中，DNA节段的相对位置发生了移动，从而 得到不同的结果一DNA序列发生重排。位点特异性重组不依赖于DNA顺序的同源 性(虽然亦可有很短的同源序列)，而依赖于能与某些酶相结合的DNA序列的存 在。这些特异的酶能催化DNA链的断裂和重新连接，它们能发动位点特异性重组 作用。利用位点特异性重组，可以方便的将外源基因定点重组到宿主基因组中， 大大提高了研究外源基因功能的效率。也有一些科学家利用利用位点特异性重组 研究基因治疗问题，所以开发高效特异的位点特异性重组酶是本领域的热点之
发明内容
本发明目的之一是提供一种高效特异的位点特异性重组酶。 本发明目的之二是提供上述位点特异性重组酶的制备方法。
本发明提供了一种位点特异重组酶，该位点特异重组酶特异性的识别下列 结构式所示脱氧核苷酸序列，在箭头位置裂解所示脱氧核苷酸序列，并将 attB识别位点的序列与下列结构式所示序列在裂解位点重新连接，
其中，A、 T、 G和C分别代表腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶。本发明中将
这种位点特异重组酶称为ZHHZA蛋白。上述结构式所示脱氧核苷酸序列即小鼠 MpsLl序列(NCBI登录号为AC079573,取其中的15361-15579)位点。
本发明中，"ZHHZA蛋白"除了SEQ ID NO 2所示序列外，还包括SEQ ID N02序列的变异形式。这些变异形式包括若干个(通常为l-50个，较佳地1-30 个，更佳地1-20个，最佳地1-IO个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C 末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为IO个以内，更佳 地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取 代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端或N末端添加一个或数个 氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。
本发明中，attB识别位点是指细菌基因组上由至少34个碱基组成 的特异性附着点。
本发明还提供了上述点特异重组酶Z冊ZA蛋白的制备方法，该方法包括以 下步骤
(1) 以MpsLl位点为耙点构建含有温度敏感型的lac阻遏基因的筛选 载体pRES- MpsLl;
(2) 以序列如SEQ ID NO 1所示核酸序列为模板，利用易错PCR技术， 获得位点特异重组酶突变DNA产物；
(3) 将(2)所得DNA产物的核酸序列插入pINT载体多克隆位点，构 建重组质粒pINT-T;
(4) 在原核细胞上利用蓝白斑实验筛选位点特异重组酶；最终筛选出 克隆获得的位点特异重组酶即进化的位点特异重组酶。
本发明中，还可以将步骤(4)所的位点特异重组酶在真核细胞上进一步筛 选，进行重组分析。
本发明中，进行重组分析可以是测定重组得到的序列，确定其是否是由 attB识别位点的序列小鼠MpsLl序列重组得到。
本发明还提供了上述位点特异重组酶的应用，即将该位点特异重组酶作为 工具酶应用于基因的定点导入重组。
本发明还提供了上述位点特异重组酶Z朋ZA蛋白的应用，即将该位点特异 重组酶突变体应用于基因定点特异性重组。
本发明中，ZHHZA蛋白应用的宿主细胞可以是非分裂细胞或者分裂细胞。其 中，非分裂细胞可以是神经元细胞、胶质细胞或者干细胞；非分裂细胞也可以是 原代细胞。
本发明的Z朋ZA蛋白，主要识别基因组MpsLl (NCBI登录号为AC079573， 取其中的15361-15579)位点，重组活性显著提高，因而，本发明的ZHHZA蛋白 将成为遗传工程技术操作，尤其是基因定点插入重组的有效工具，而且为基因功 能分析和基因治疗的研究开辟了新途径。
图l是位点特异重组酶ZHHZA蛋白活性检测对照图。即编码①C31位点特 异重组酶质粒转化携带有筛选载体pRES-mpsLl细菌经温度诱导后4小时蓝白斑 结果。
图2是位点特异重组酶ZHHZA蛋白活性检测结果图。即Z冊ZA蛋白转化携 带有筛选载体pRES- mpsLl细菌经温度诱导后4小时蓝白斑结果。与图l相比， Z朋ZA蛋白具有较高活性。
具体实施例方式
实施例1筛选载体pRES- MpsLl制备方法 从小鼠组织中抽提基因组DNA,以MpsLl位点设计引物(上游 5' -TGAAGCCACTCTGGTCTAC-3'，下游5' -CAGCACACTGTGAATAAATG-3，)，经PCR方法， 获得218bp MpsLl序列并测序鉴定。然后，将含有EcoRI酶切位点MpsLl产物克 隆于同样经EcoRI酶切而除去WA位点的pRES-WA质粒，由此获得筛选载体 pRES- MpsLl。
实施例2 OC31整合酶的突变体质粒库制备方法
以野生型OC31整合酶(pCMVInt载体)为模板，合为带有突变的引物(引 物Cl:5' -TAACTGTTAGGGTCGTGACCG-3，禾卩C2:5' —CTTGGCAAAGGTACGCCTCTA-3)， TaqDNA聚合酶进行致错PCR;具体参数为94'C lmin，94'C 50 s, 72 。C lmin30s, 30个循环，72。C 3min。获得随机突变的OC31整合酶PCR产物(l. 9kb).
制备①C31整合酶的突变体质粒库具体参数为将5—6Pg的0C31整合酶 突变DNA产物用O. 15单位的DNAasel在100W的反应体系中室温下反应20分钟。 整合酶基因的片段在1. 6%NuSieve的凝胶上进行电泳，将50 — 250bp的片段从 胶上切割下来，DNA片段通过0—Agarase与低熔点凝胶分离开来。在PCR仪上 进行了 50-60轮不带引物的PCR扩增，获得随机重组产物。以随机重组产物为模 板，C1和C2为引物进行进一步的PCR扩增，PCR产物中的1.9kb的片段通过凝 胶电泳分离出来。将。C31整合酶的突变重组基因经合适酶切后克隆到PINT-T 表达载体，其连接反应被Micropure—EZ柱清洗之后又通过Microcon YM_100 旋转透析柱进行纯化浓縮，获得。C31整合酶的突变体质粒库。
实施例3 Z朋ZA蛋白在原核细胞上活性验证
将ZHHZA蛋白基因序列装入pINT-T表达载体后，转化已携带有pRES- MpsLl 载体的￡ 细胞，涂于X-gal平板上.经不同温度诱导(先经3CTC后到37°C)， 观察蓝色克隆出现时间(3-12h)、颜色深浅以及数量。
结果如图1和图2所示，经温度诱导后4小时后，表达有ZHHZA蛋白的平 板上克隆中几乎都为蓝色，而且蓝色较深，而以。C31位点特异重组酶为对照的 平板上，蓝色克隆较少，而且颜色偏淡。这说明，Z朋ZA蛋白具有较高活性。
实施例4 ZffiKA蛋白在真核细胞上活性验证
将构建ZHHZA蛋白真核表达载体和携带有attB位点的真核表达载体，转染 小鼠3T3细胞，48小时之后将200Pg/ml的潮霉素B作用于30%的转染细胞，经 14天药物筛选，克隆计数；单克隆扩增，利用DNEasy抽提DNA;利用PCR方法 检测重组结果。PCR产物的测序结果如SEQ ID NO 3所示。经分析，前10bp是 attB位点序列，交换中心TTG (nt. 11-13)后为小鼠基因组卿sLl位点序列。这 说明，本发明的Z朋ZA蛋白可以特异性的介导mpsLl位点基因重组。
实施例5 ZHHZA蛋白在真核细胞上验证整合效率
将50ng的质粒pHZ—attB和5Pg的表达突变体质粒共转染小鼠3T3细胞， 4)C31整合酶的质粒pCmv—Int作对照，使用Lipofectamine方法来完成。在转 染48小时后，将转染细胞中的70%进行组织DNA抽提。基因组DNA通过DNEasy 组织试剂盒进行抽提。这些DNA被用来进行定量PCR检测，来发现位于即sLl 位点的重组频率。依据attB序列和mpsLl位点序列设计PCR正向引物和反向引 物，另在attB序列整合在mpsLl位点结合区设计一个探针，主要被使用探测在 mpsLl位点发生了位点特异性反应。PCR的定量检测是通过SYBR Green试剂盒 (Finzymes， F-430S)来完成的，在一台ABI7700仪器中进行扩增反应；通过 SDS v1.7软件进行结果分析。每一个样品进行三次检测，而且每一次转染至少 进行三次。重组连接的数量和使用DNA的量可通过来自于包含有单独一个位于 mpsLl位点的整合事件的293细胞系的基因组DNA作为标准来计算的。
结果显示，本发明的ZHHZA蛋白具有较高的整合效率。
实施例6 ZHHZA蛋白在真核细胞上验证整合特异性
将构建Z朋ZA蛋白真核表达载体和携带有attB位点的真核表达载体，转染 小鼠3T3细胞，48小时之后将200fxg/ml的潮霉素B作用于30%的转染细胞，经 14天药物筛选，克隆计数；单克隆扩增，利用DNEasy抽提DNA;利用PCR检测 OC31整合酶突变体介导在小鼠细胞基因组MpsLl靶位点上的整合的克隆数，该 克隆数与总克隆数之比即整合特异性效率。用同样的方法计算①C31整合酶的整 合特异性效率，作为对照。
结果显示，本发明的ZHHZA蛋白在识别小鼠细胞基因组MpsLl靶位点后， 整合特异效率比现有的OC31整合酶更高。
序列表
<110〉 复旦大学
<120> —种位点特异重组酶、其制备方法及应用 〈160〉 3
<170> Patentln version 3. 1
<210〉 1
<211> 1842
<212〉 DNA
<213〉 Homo sapiens
<220〉
<221> CDS
<222〉 (1)..(1842)
<223>
<400〉 1
tac 48 Tyr
atg aca caa ggg gtt gtg acc ggg gtg gac eicg tac gcg ggt get Met Thr Gin Gly Val Val Thr Gly Val Asp Thr Tyr Ala Gly Ala 15 10 15
gac cgt cag tcg cgc gag cgc gag aat tcg Asp Arg Gin Ser Arg Glu Arg Glu Asn Ser 20 25
age gca gca age cca gcg Ser Ala Ala Ser Pro Ala 30
96
aca cag cgt age gcc aac gaa gac aag gcg Thr Gin Arg Ser Ala Asn Glu Asp Lys Ala 35 40
gcc geic ctt cag cgc gaa Ala Asp Leu Gin Arg Glu 45
144
gtc gsg cgc gsc ggg ggc egg ttc sgg ttc Val Glu Arg Asp Gly Gly Arg Phe Arg Phe 50 55
gtc ggg cat ttc age gaa Val Gly His Phe Ser Glu 60
192
gcg ccg ggc acg tcg gcg ttc ggg acg gcg gag cgc ccg gag ttc g犯 240 Ala Pro Gly Thr Ser Ala Phe Gly Thr Ala Glu Arg Pro Glu Phe Glu 65 70 75 80
cgc ate ctg aac gaa tgc cgc gcc ggg egg Arg lie Leu Asn Glu Cys Arg Ala Gly Arg 85 90
etc aac atg ate att gtc Leu Asn Met lie lie Val 95
288
tat gac gtg tcg cgc ttc tcg cgc ctg aag gtc atg gac gcg att ccg 336 Tyr Asp Val Ser Arg Phe Ser Arg Leu Lys Val Met Asp Ala lie Pro 100 105 110
att gtc tcg gaa ttg etc gcc ctg ggc gtg acg att gtt tec act cag 384 lie Val Ser Glu Leu Leu Ala Leu Gly Val Thr lie Val Ser Thr Gin 115 120 125
gaa ggc gtc ttc egg cag gga aac gtc atg gac ctg att cac ctg att 432 Glu Gly Val Phe Arg Gin Gly Asn Val Met Asp Leu lie His Leu lie 130 135 140
atg egg etc gac gcg tcg cac aaa gaa tct tcg ctg aag tcg gcg aag 480 Met Arg Leu Asp Ala Ser His Lys Glu Ser Ser Leu Lys Ser Ala Lys 145 150 155 160
att etc gac acg aag aac ctt cag cgc gaa ttg ggc ggg tac gtc ggc 528 lie Leu Asp Thr Lys Asn Leu Gin Arg Glu Leu Gly Gly Tyr Val Gly 165 170 175
ggg aag gcg cct tac ggc ttc gag ctt gtt tcg gag acg aag gag ate 576 Gly Lys Ala Pro Tyr Gly Phe Glu Leu Val Ser Glu Thr Lys Glu lie 180 185 190
acg cgc aac ggc cga atg gtc aat gtc gtc ate aac aag ctt gcg cac 624 Thr Arg Asn Gly Arg Met Val Asn Val Val lie Asn Lys Leu Ala His 195 200 205
tcg acc act ccc ctt acc gga ccc ttc gag ttc gag ccc gac gta ate 672 Ser Thr Thr Pro Leu Thr Gly Pro Phe Glu Phe Glu Pro Asp Val lie 210 215 220
egg tgg tgg tgg cgt gag ate aag acg cac aaa cac ctt ccc ttc aag 720 Arg Trp Trp Trp Arg Glu lie Lys Thr His Lys His Leu Pro Phe Lys 225 230 235 240
ccg ggc agt caa gcc gcc att cac ccg ggc age ate acg ggg ctt tgt 768 Pro Gly Ser Gin Ala Ala lie His Pro Gly Ser lie Thr Gly Leu Cys 245 250 255
aag cgc a/tg gac get gac gcc gtg ccg acc egg ggc gag acg att ggg 816 Lys Arg Met Asp Ala Asp Ala Val Pro Thr Arg Gly Glu Thr lie Gly
260 265 270
aag a_ag acc get tea age gcc tgg gac ccg gca acc gtt atg cga ate 864 Lys Lys Thr Ala Ser Ser Ala Trp Asp Pro Ala Thr Val Met Arg lie 275 280 285
ctt egg gac ccg cgt att gcg ggc ttc gcc get gag gtg ate tac aag 912 Leu Arg Asp Pro Arg lie Ala Gly Phe Ala Ala Glu Val lie Tyr Lys 290 295 300
a_ag aag ccg gac ggc acg ccg acc a_cg aag att gag ggt tac cgc att 960 Lys Lys Pro Asp Gly Thr Pro Thr Thr Lys lie Glu Gly Tyr Arg lie 305 310 315 320
cag cgc gac ccg ate acg etc egg ccg gtc gag ctt gat tgc gga ccg 1008 Gin Arg Asp Pro lie Thr Leu Arg Pro Val Glu Leu Asp Cys Gly Pro 325 330 335
ate ate gag ccc get gag tgg tat gag ctt cag gcg tgg ttg gac ggc 1056 lie lie Glu Pro Ala Glu Trp Tyr Glu Leu Gin Ala Trp Leu Asp Gly 340 345 350
agg ggg cgc ggc aag ggg ctt tec egg ggg caa gcc att ctg tec gcc 1104 Arg Gly Arg Gly Lys Gly Leu Ser Arg Gly Gin Ala lie Leu Ser Ala 355 360 365
atg gac犯g ctg tac tgc gag tgt ggc gcc gtc atg act tcg aag cgc 1152 Met Asp Lys Leu Tyr Cys Glu Cys Gly Ala Val Met Thr Ser Lys Arg 370 375 380
ggg gaa gaa tcg ate aag gac tct tac cgc tgc cgt cgc egg aag gtg 1200 Gly Glu Glu Ser lie Lys Asp Ser Tyr Arg Cys Arg Arg Arg Lys Val 385 390 395 柳
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Arg His Ala Glu Gly Asp Glu Glu Thr Leu Ala Leu Leu Trp Glu Ala 435 440 445
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gag ctg tac gaa gac cgc gcg gca ggc gcg tac gac gga ccc gtt ggc 1488 Glu Leu Tyr Glu Asp Arg Ala Ala Gly Ala Tyr Asp Gly Pro Val Gly 485 490 495
agg aag cac ttc egg aag caa cag gca gcg ctg acg etc egg cag caa 1536 Arg Lys His Phe Arg Lys Gin Gin Ala Ala Leu Thr Leu Arg Gin Gin 500 505 510
ggg gcg g肪gag egg ctt gCC g33 ctt g33 gcc gcc g33 gcc ccg朋g 1584 Gly Ala Glu Glu Arg Leu Ala Glu Leu Glu Ala Ala Glu Ala Pro Lys 515 520 525
ctt ccc ctt gac caa tgg ttc ccc gaa gac gcc gac get gac ccg acc 1632 Leu Pro Leu Asp Gin Trp Phe Pro Glu Asp Ala Asp Ala Asp Pro Thr 530 535 540
ggc cct aag tcg tgg tgg ggg cgc gcg tea gta gac gac aag cgc gtg 1680 Gly Pro Lys Ser Trp Trp Gly Arg Ala Ser Val Asp Asp Lys Arg Val 545 550 555 560
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ggc agg ggg cag gga acg ccc ate gag卿cgc get tcg ate acg tgg 1776 Gly Arg Gly Gin Gly Thr Pro lie Glu Lys Arg Ala Ser lie Thr Trp 580 585 590
gcg aag ccg ccg acc gac gac gac gaa gac gac gcc cag gac ggc acg 1824 Ala Lys Pro Pro Thr Asp Asp Asp Glu Asp Asp Ala Gin Asp Gly Thr 595 600 605
gaa gac gta gcg gcg tag 1842 Glu Asp Val Ala Ala 610
<210〉2
<211〉613
<212>PRT
<213>Homo
<400>2
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〈212〉 廳
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〈220〉
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ct犯tcggtt cagaggggtt c犯ttcaata tcatcattgc 360
aagcagacat gatgctaga 399
权利要求
1.一种位点特异重组酶，其特征在于，该位点特异重组酶特异性的识别下列结构式所示脱氧核苷酸序列，在箭头位置裂解所示脱氧核苷酸序列，并将attB识别位点的序列与下列结构式所示序列在裂解位点重新连接， ↓5’-accatctgagtagtaccctggctttcctaTTGacacccaaaggccctattaatttaggga-3’其中，A、T、G和C分别代表腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶。
2. 生产如权利要求1所述位点特异重组酶的方法，其特征在于，该方 法包括以下步骤-(1) 以MpsLl位点为耙点构建含有温度敏感型的lac阻遏基因的筛选 载体pRES- MpsLl;(2) 以序列如SEQIDNOl所示核酸序列为模板，利用易错PCR技术， 获得位点特异重组酶突变DNA产物；(3) 将(2)所得DNA产物的核酸序列插入pINT载体多克隆位点，构 建重组质粒pINT-T;(4) 在原核细胞上利用蓝白斑实验筛选位点特异重组酶；最终筛选出 克隆获得的位点特异重组酶即进化的位点特异重组酶。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，将步骤(4)所得位点特异重组酶在真核细胞水平进一步筛选，进行重组分析。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，进行重组分析是测定重组 得到的序列，确定其是否是由attB识别位点的序列与权利要求1中化学 式所示序列重组得到。
5. 如权利要求1所述位点特异重组酶的应用，其特征在于，将该位点 特异重组酶作为工具酶应用于基因的定点导入重组。
全文摘要
本发明属于遗传工程领域，具体涉及一种位点特异重组酶、其制备方法及应用。本发明提供了一种新的位点特异重组酶，该位点特异重组酶特异性的识别下列结构式所示脱氧核苷酸序列，在箭头位置裂解所示脱氧核苷酸序列，并将attB识别位点的序列与下列结构式所示序列在裂解位点重新连接，(见图)。本发明的位点特异重组酶能够特异性的识别基因组MpsL1位点，具有较高活性，因而，本发明的位点特异重组酶将成为遗传工程技术操作，尤其是基因定点插入重组的有效工具。
文档编号C12N9/22GK101186906SQ200710172188
公开日2008年5月28日 申请日期2007年12月13日 优先权日2007年12月13日
发明者龙 余, 刘韶辉, 唐丽莎, 彭斯曼, 朱焕章, 辛清婷, 马金芳 申请人:复旦大学