专利名称：用于同源重组的方法和组合物的制作方法
对相关申请的交叉引用按照35 U.S.C.§119(e)的规定，本申请要求以下专利申请的优先权申请日为2002年4月30日的美国临时专利申请号60/377,026，申请日为2002年7月18日的美国临时专利申请号60/396,992，以上专利申请的内容被收作本文参考介绍发明领域本发明的领域是核酸整合，更具体地讲是同源重组。
背景技术：
促进在多细胞生物中进行定向基因组修饰的试剂和方法构成了用于实验遗传学，人类治疗和农业的有效工具。可以使用的进行基因组修饰的一种方法是通过基因导向而直接改变细胞基因组，其中，外源DNA在靶细胞中与它的相应的染色体位点发生了同源重组。基因导向技术的优点是，所导入的基因停留在它的正常染色体基因座上，并且，正因为如此，避免了与将基因导入细胞的其他方法相关的某些主要问题，例如，基因沉默，插入诱变，易位基因表达和缺乏稳定性。
不过，在哺乳动物细胞中，只获得了非常低频率的同源导向事件，通常在每个细胞10-6次范围内。另外，同源导向与非同源事件的背景相比，更常见100-1000倍(Capecchi 1989 Science 2441288-1292)。业已设计了多种方法，以便选择和筛选成功导向产物的比例，不过，有利事件的低的绝对频率仍然是一个严重限制。因此，现有的基因导向技术，至少对于哺乳动物细胞而言取决于将线性化的载体用于分离生长在组织培养物中的细胞。可将所述细胞用于生产转基因动物，并且有可能用于移植治疗。对特殊细胞类型的需要，极大地限制了这种基因导向方法的应用。
更有效的转化载体被不断地生产出来，但是这些载体主要是用于细胞施用的，这主要是因为在细胞与整体动物中的操作中在复杂性方面存在巨大差异。
因此，一直对开发新的转化载体存在兴趣。特别感兴趣的是开发能提供通过同源重组将外源DNA稳定地定点整合入完整多细胞生物的细胞基因组中的载体。
相关文献感兴趣的参考文献包括美国专利6,291,243；5,719,055和4,670,388；以及Rong和Golic(Science，2882013-2018 2000)；Rouet等(Proc.Natl.Acad.Sci.916064-6068，1994)；Segal等(Proc.Natl.Acad.Sci.92806-810，1995)。
发明概述提供了用于将外源核酸同源重组到诸如动物的多细胞生物的靶细胞基因组中的方法。在本发明方法中，让包括诸如重组酶识别位点和同源重组整合因子的线性化内切核酸酶位点的导向载体与多细胞生物接触，例如，通过系统性或局部施用，以便所述多细胞生物的靶细胞摄取所述导向载体。通过线性化内切核酸酶，例如重组酶，将原先是环状导向载体的导向载体线性化，所述线性化是在施用之前(例如，用内切核酸酶进行体外处理)或在进入所述多细胞生物时通过细胞外或细胞内流体中的内切核酸酶进行，所述内切核酸酶可以是导入的或者业已存在于所述多细胞生物中。所述整合因子通过同源重组从所述线性化导向载体进入所述靶细胞基因组。还提供了用于实施本发明方法的导向载体，系统和试剂盒。
附图简述
图1是用于下面的实验部分的线性化ODC载体和正常的基因组ODC基因的示意图。
定义“载体”是双链的染色体外核酸，它包括克隆和表达载体，以及病毒载体。“载体”能够将基因序列转入靶细胞。通常“载体构建体”，“表达载体”，以及“基因转移载体”表示能够将基因序列转入靶细胞的任何核酸构建体。因此，该术语包括克隆和表达载体，以及整合载体。“环状”载体表示由环状核酸组成的载体，并且可以是超螺旋或松弛形式的。环状载体不是线性的或线性化的载体。
″外源核酸″是这样的核酸，在实施本发明的方法之前，存在于靶细胞外。在某些实施方案中，所述外源核酸是这样的，它具有不存在于所述靶细胞基因组中的连续序列。在其他实施方案中，所述外源核酸具有存在于所述靶细胞中的连续序列。
″靶位点″是希望将外源核酸整合到它里面的基因组内的预定位点。
″同源序列″是与用于整合的“靶位点”具有序列同一性的序列。
″同源重组″是包括外源核酸的整合因子的整合，所述外源核酸的侧翼序列提供了通过同源重组进入靶基因组，这是通过以下机制实现的在所述整合因子同源侧翼序列和所述靶基因组的靶位点之间存在足够高水平的序列同一性，例如，75％，80％，85％，90％，95％，98％，99％，包括100％的序列同一性。同源重组导致了插入所述整合因子的靶基因组位点，所述因子包括所述整合因子的同源侧翼序列。
“基因导向”表示通过同源重组使外源核酸定点整合到靶基因组的特定靶位点。
“感兴趣的核酸片段”表示适合插入基因组的任何核酸片段。感兴趣的核酸片段的合适的例子包括启动子基因，治疗基因，标记基因，控制区，性状生产片段，和实现基因破坏的核酸因子等。感兴趣的核酸片段还可以是“表达盒”，其中，“表达盒”包括能够指导感兴趣的基因/编码序列表达的任何核酸构建体。感兴趣的核酸片段还可以是“破坏”核酸，其中，所述破坏核酸一旦整合到靶位点，就会破坏所述靶位点附近的基因的表达，例如所述破坏核酸可以改变所述基因的编码序列，可以干扰所述基因的转录，剪接或翻译，或由它本身表达破坏性的，例如反义核酸。
转化细胞的方法为本领域所公知。“转化过的”表示由于外源核酸，通常是DNA的摄取而导致的细胞改变。术语“转化”的使用并非将要所述外源核酸的导入局限于任何特定的方法。合适的方法包括病毒感染，转染，偶联，原生质体融合，电穿孔，粒子枪技术，磷酸钙沉淀，和直接显微注射等。所述方法的选择通常取决于要转化的细胞的类型，以及进行所述转化的环境(即体外，离体，或体内)。有关这些方法的一般性讨论可以参见Ausubel，等，Short Protocols in MolecularBiology，3rd ed.，Wiley & Sons，1995。
术语“核酸分子”和“多核苷酸”被可互换用于表示具有任何长度的聚合形式的核苷酸，可以是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或它们的类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以发挥任何已知或未知功能。多核苷酸的非限定性例子包括基因，基因片段，外显子，内含子，信使RNA(mRNA)，转运RNA，核糖体RNA，核酶，cDNA，重组多核苷酸，分支的多核苷酸，质粒，载体，具有任何序列的分离的DNA，具有任何序列的分离的RNA，核酸探针，和引物。所述核酸分子可以是线性的或环状的。
多核苷酸通常由四个核苷酸碱基的特定序列组成腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；和胸腺嘧啶(T)(当多核苷酸是RNA时，尿嘧啶(U)取代了胸腺嘧啶(T))。因此，术语多核苷酸是多核苷酸分子的按字母顺序的表述。这种按字母顺序的表述可以输入具有中央处理单元的计算机中的数据库中，并且用于生物信息学应用，如功能性基因组学和同源检索。
“编码序列”或“编码”特定多肽的序列是被转录(对于DNA来说)和翻译(对于mRNA来说)成多肽的核酸分子，例如，当它受合适的调控序列(或“控制因子”)的控制时是在体内进行的。所述编码序列的边界通常是由位于5′(氨基)末端的起始密码子和位于3′(羧基)末端的翻译终止密码子确定的。编码序列可以包括，但不局限于来自病毒，原核或真核mRNA的cDNA，来自病毒或原核DNA的基因组DNA序列，甚至是合成的DNA序列。转录终止序列可位于所述编码序列的3′末端。其他″控制因子″也可以与编码序列结合。可以对编码多肽的DNA序列进行优化，以便通过使用特定细胞优选的密码子在特定细胞中表达，以便提供所述理想多肽编码序列的DNA拷贝。
“由...编码的”表示编码多肽序列的核酸序列，其中，所述多肽序列或它的一部分包括来自由所述核酸序列编码的多肽的具有至少3-5个氨基酸的氨基酸序列，更优选至少8-10个氨基酸，更优选至少15-20个氨基酸。还包括可以在免疫学上通过由所述序列编码的多肽识别的多肽序列。
“可操作地连接”表示因子的排列，其中，对所述描述的成分进行构造，以便发挥它们的常见功能。因此，与编码序列(例如报道表达盒)可操作地连接的特定启动子能够在存在合适的酶时，实现所述编码序列的表达。所述启动子或其他控制因子不一定是与所述编码序列连续的，只要能够起到指导它们的表达的作用就行。例如，间插的未翻译的仍然转录的序列可存在于所述启动子序列和编码序列之间，而所述启动子序列仍然被认为是与所述编码序列“可操作地”连接的。
“核酸构建体”表示业已被构建成包括一个或多个不能在天然状态下同时存在的功能单位的核酸序列。其例子包括环状，线性，双链，染色体外DNA分子(质粒)，粘粒(含有来自λ噬菌体的COS序列的质粒)，和包括非天然核酸序列的病毒基因组等。
用于确定核酸和氨基酸“序列同一性”的技术同样为本领域所公知。通常，所述技术包括确定基因的mRNA的核苷酸序列和/或确定由它所编码的氨基酸序列，并且将这些序列与第二种核苷酸或氨基酸序列进行比较。一般，“同一性”分别表示两种多核苷酸或多肽序列的确切核苷酸-核苷酸或氨基酸-氨基酸相关性。通过确定它们的“百分同一性”。可以比较两种或两种以上序列(多核苷酸或氨基酸)。两种序列，无论是核酸或氨基酸序列的百分同一性是两种比对序列之间的确切匹配的数目除以较短序列的长度，并且乘以100。对核酸序列的合适的比对是由Smith和Waterman的局部同源性算法提供的，Advances inApplied Mathematics 2482-489(1981)。可以将这种算法应用于氨基酸序列，包括使用由Dayhoff开发的评分矩阵，Atlas of ProteinSequences and Structure，M.O.Dayhoff ed.，5 suppl.3353-358，National Biomedical Research Foundation，Washington，D.C.，USA，并且由Gribskov标准化，Nucl.Acids Res.14(6)6745-6763(1986)。将这种算法用于确定序列的百分同一性的典型的实施方案是由GeneticsComputer Group(Madison，WI)在″BestFit″应用用途中提供的。该方法的默认参数披露于Wisconsin Sequence Analysis Package ProgramManual，Version 8(1995)(由Genetics Computer Group提供，Madison，WI)。在本发明中建立百分同一性的优选方法是使用爱丁堡大学拥有版权的MPSRCH程序包，该程序包是由John F.Collins和Sbane S.Sturrok开发的，并且由IntelliGenetics，Inc.(Mountain View，CA)销售。通过该软件包，可以采用所述Smith-Waterman算法，其中，将默认参数用于评分表(例如，空位开放罚分为12，空位延伸罚分为1，并且空位为6)。从所产生的数据，“匹配”值表示“序列同一性”，用于计算序列之间的百分同一性或相似性的其他合适的程序为本领域所普遍公知，例如，另一种比对程序是BLAST，是以默认参数使用的。例如，BLASTN和BLASTP能够以以下默认参数使用遗传密码＝标准；过滤值＝无；链＝双；截断值＝60；预期值＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50序列；分选参数＝HIGH SCORE；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。有关这些程序的细节可以查阅以下互联网地址http//www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。
另外，可以通过在可以在同源区之间形成稳定的双链体的条件下进行多核苷酸杂交测定同源性，然后用单链特异性核酸酶消化，并且对消化的片段进行大小测定。在用上述方法测定时，当两种DNA或两种多肽序列在所述分子的确定长度上具有至少大约80％-85％，优选至少大约85％-90％，更优选至少大约90％-95％，最优选至少大约95％-98％序列同一性时，它们彼此“基本同源”。在本文中，基本同源还表示与特定DNA或多肽序列具有完全同一性的序列。基本同源的DNA序列可以通过Southern杂交实验鉴定，例如，在特定系统所确定的严格条件下进行杂交。确定的合适杂交条件为本领域技术人员所公知。例如，参见Sambrook等，同上；DNA cloning，同上；核酸杂交，同上。
正如本文所披露的，两个核酸片段被认为“能选择性地杂交”。两个核酸分子之间的序列同一性程度影响这两个分子之间杂交事件的效率和强度。部分相同的核酸序列至少能部分抑制完全相同的序列与靶分子的杂交。完全相同的序列的杂交的抑制可以采用杂交测定方法评估，该方法为本领域所熟知(例如Southern印迹，Northern印迹，或溶液杂交等，参见Sambrook，等，Molecular CloningA LaboratoryManual，Second Edition，(1989)Cold Spring Harbor，N.Y.)。所述测定方法可以采用不同的选择性程度进行，例如，使用从低到高严格性变化的条件。如果采用低严格性条件，非特异性结合的缺乏可以采用第二探针评估，这种探针甚至缺乏部分程度的序列同一性(例如，与靶分子的序列同一性低于大约30％的探针)，以便在缺乏非特异性结合事件时，所述第二探针能够与所述靶分子杂交。
在采用基于杂交的检测系统时，选择互补于靶核酸序列的核酸探针，然后通过选择合适的条件，使所述探针和所述靶序列彼此“选择性地杂交”或结合，以便形成杂交分子。能够在“中等严格”条件下与靶序列选择性地杂交的核酸分子通常能够在允许检测与所选择的核酸探针序列具有至少大约70％序列同一性的长度至少大约为10-14个核苷酸的靶核酸序列的条件下杂交。严格的杂交条件，通常允许检测与选择的核酸探针的序列的序列同一性超过大约90-95％的长度至少大约为10-14个核苷酸的靶核酸序列。当探针和靶分子具有特定程度的序列同一性时，用于探针/靶分子杂交的杂交条件可以通过本领域已知方法确定(例如，参见Nucleic Acid HybridizationA Practical Approach，editors B.D.Hames and S.J.Higgins，(1985)Oxford；Washington，DC；IRLPress)。
就杂交的严格条件而言，本领域众所周知的是可以采用多种等同的条件建立特定的严格性，例如，包括以下因素探针和靶序列的长度和性质，各种序列的碱基组成，盐和其他杂交溶液成分的浓度，阻断剂在所述杂交溶液中的存在或缺乏(例如，甲酰胺，硫酸葡聚糖，和聚乙二醇)，杂交反应温度和时间参数，以及各种洗涤条件。特定类型杂交条件的选择，是选自现有技术中的以下标准方法(例如，参见，Sambrook，等，Molecular CloningA Laboratory Manual，SecondEdition，(1989)Cold Spring Harbor，N.Y.)。严格的杂交条件的例子是在50℃或更高温度下，在0.1×SSC(15mM氯化钠/1.5mM柠檬酸钠)中杂交。严格的杂交条件的另一个例子是42℃下，在以下溶液中孵育过夜50％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5×Denhardt’s溶液，10％硫酸葡聚糖，和20mg/ml变性的，剪切的鲑鱼精子DNA，然后在大约65℃下，在0.1×SSC中洗涤所述滤膜。严格的杂交条件是这样的杂交条件，它至少与上述典型的条件一样严格，其中，如果这些条件与上述特定的严格条件相比至少占大约80％，通常至少大约90％的严格性，就至少被认为是严格的。其他严格的杂交条件为本领域所公知，并且还可将这种条件用于鉴定本发明的该特定实施方案的核酸。
如果第一种多核苷酸与第二种多核苷酸，它的cDNA，它的互补体的一个区域具有相同或基本上相同的核苷酸序列，或者它具有如上文所述的序列同一性，所述第一种多核苷酸就是“源于”所述第二种多核苷酸。
如果第一种多肽是(i)由源于第二种多核苷酸的第一种多核苷酸编码的，或(ii)与上述第二种多肽具有序列同一性，就认为第一种多肽是“源于”第二种多肽。
“基本上纯化的”一般表示分离物质(化合物，多核苷酸，蛋白，多肽，多肽组合物)，以便所述物质构成它所存在的样品中的主要百分比。通常，在一种样品中，基本上纯化的成分占该样品的50％，优选80％-85％，更优选90-95％。用于纯化感兴趣的多核苷酸和多肽的技术为本领域所熟知，例如，离子交换层析，亲和层析和根据密度沉淀。
″内切核酸酶″表示能够剪切核苷酸的DNA链的内部(例如，不是位于该DNA链的5′或3′末端)共价键的任何分子，导致在双链核酸底物的特定序列上的双链断裂，其中，所述特定序列被称为“内切核酸酶位点”。“内切核酸酶”可以是DNA酶，例如，限制性内切核酸酶，切口酶等，或重组酶，例如，转座酶，解离酶，整合酶，转化酶等。
″限制性内切核酸酶″是酶家族的一员，它能介导双链核酸分子的定点切割(即切割特定的DNA序列)。感兴趣的限制性内切核酸酶是所谓的“罕见切割”限制性内切核酸酶，它能识别并且介导对长度为至少8个碱基对的特定DNA序列的切割。罕见切割性限制性内切核酸酶披露于Lamber等的文章中(Mutat Res.1999；433159-68)；Belford等(Nucleic Acids Res 1997；253379-88)和Jasin，1996(Trends Genet.12244-228)。特别感兴趣的是I-SceI内切核酸酶(Dujon，Gene 198992-119)，它能识别18bp的非回文序列，以及嵌合的I-SceI核酸酶(Bibikova等，Mol.Cell.Bio.2001 21289-287)，和酿酒酵母的HO内切核酸酶(由NCBI保藏号X90957编码)。
″重组酶″是酶家族的一员，它能介导由所述重组酶识别的特定DNA序列之间的定点重组(Esposito，D.，和Scocca，J.J.，Nucleic AcidsResearch 25，3605-3614(1997)；Nunes-Duby，S.E.，等，Nucleic AcidsResearch 26，391-406(1998)；Stark，W.M.，等，Trends in Genetics8，432-439(1992)；Sadowski，1993 FASEB J 7760-767)。重组酶可以是解离酶，整合酶，转化酶和转座酶。
具体实施方案的说明提供了用于将外源核酸同源重组到诸如动物的多细胞生物的靶细胞基因组中的方法。在本发明方法中，让包括诸如重组酶识别位点和同源重组整合因子的线性化内切核酸酶位点的导向载体与所述多细胞生物接触，例如，通过系统性或局部施用，以便所述多细胞生物的靶细胞摄取所述导向载体。所述导向载体是这样的，它最初是环状导向载体，它被线性化内切核酸酶线性化，例如，业已提供给所述靶细胞的重组酶。所述整合因子通过同源重组从所述线性化导向载体进入所述靶细胞基因组。还提供了用于实施本发明方法的导向载体，系统和试剂盒。
在对本发明作进一步的说明之前，应当理解的是，本发明不局限于本发明下面所披露的特定实施方案，因为可以对所述具体实施方案加以改变，而仍然属于所附权利要求书的范围。还应当理解的是，所使用的术语是用于说明特定实施方案的，而不是用于限定目的。相反，本发明的范围是由所附权利要求书确定的。另外，可以进行多种改进，以便使特定的场合，材料，物质组成，工艺，工艺步骤适应本发明的目的，构思和范围。所有这样的改进都被认为属于本文所提出的权利要求的范围。
在本说明书以及所附权利要求书中，单数形式的“一种”、″一个″和″该″包括复数的情形，除非上下文清楚地确定了其他的含义。相反，预定权利要求书可以这样撰写来排除任何任选的要素。此一声明旨在用作先决条件，作为在描述权利要求的要素时使用“唯一的”、“仅有的”等这类排他性的术语或使用“否定性”限定时的前提。
在给出一个范围的值时，应当理解为在所述范围的上限和下限之间的每一个值其变化幅度在下限整体的1/10，除非上下文清楚地确定了其他的含义，和处在该所述范围内的任何其他所述值或其间的值，均包括在本发明的范围内。这些更小范围的上限和下限可独立地包含在所述更小的范围内，并且包括在本发明的范围内，即使在所述范围内具体排除了任何上限或下限。当所述范围包括所述上下限中的一个或两个时，排除了那些所包括的上下限中的一个或两个的范围也包括在本发明范围内。同样，预定的是，本说明书所披露的本发明的变化形式的任何选择性特征均可独立地提出和要求保护，或可与本说明书所披露的任何一种或多种特征组合在一起提出和要求保护。
除非另有说明，本文所使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员所普遍了解的相同的含义。尽管与本文所披露的类似或等同的任何方法，装置和材料都可用于实施或检验本发明，下面将披露优选方法，装置和材料。
本文所提到的所有现有的主题(例如，出版物，专利，专利申请和硬件)都以它的整体形式收作本文参考。提供这些参考文献仅仅是因为它们的
公开日期早于本申请的申请日。本说明书中，没有任何内容可以理解为承认本发明不能享受因发明在先而先于这些材料的权利。
综上所述，本发明提供了将外源核酸同源重组到多细胞生物的靶细胞基因组中的方法，以及用于实施本发明方法的试剂盒和系统。在对本发明作进一步的说明时，首先将更详细地披露所述方法，然后对用于实施本发明方法的本发明的系统和试剂盒，以及试剂盒的成分进行综述。
使用本发明基因导向载体的方法上述本发明载体可用于多种用途，其中，希望将外源核酸导入并且稳定地整合到靶细胞的基因组中，例如，存在于多细胞生物中的靶细胞，如植物，动物，例如，脊椎动物，包括哺乳动物等。本发明载体特别适用于通过将外源核酸同源重组进入动物的靶细胞基因组而进行定点整合，所述动物包括昆虫，脊椎动物等。在某些实施方案中，可以使用本发明载体的动物是脊椎动物，其中，在很多实施方案中，所述动物是哺乳动物。因此，在很多实施方案中，特别感兴趣的是用本发明的载体导向脊椎动物，特别是禽类和海洋动物，例如，鸡，和斑马鱼等；哺乳动物，包括鼠类，有蹄动物，猪，绵羊，马，大鼠，狗，猫，猴和人等。
在本发明的方法中，让本发明的导向载体在足以使所述导向载体被所述细胞摄取或内化的条件下与所述靶细胞接触。将在同源重组事件之前最初是环状的导向载体线性化，并且通过同源重组将所述载体的所述整合因子插入所述靶细胞的基因组。
导向载体如上文所述，在本发明方法中使用的导向载体是环状载体，更具体地讲，是环状的，双链的DNA载体，即质粒。所述环状导向载体的大小可以改变，其中，总体大小可以为至少大约100个碱基对，有时候为至少大约1000个碱基对，以及有时候为至少大约3kb，其中，在某些实施方案中，所述大小可以大到300kb或更大，不过，一般不会超过大约30kb，并且通常不会超过大约15kb。本发明的导向载体是包括以下两种因子的载体(a)线性化内切核酸酶位点和(b)同源重组整合因子。在某些实施方案中，所述导向载体可以包括一个或多个其他因子，如线性化内切核酸酶编码序列等。
线性化内切核酸酶位点本发明的导向载体包括线性化内切核酸酶位点。所述线性化内切核酸酶位点是由内切核酸酶识别的位点或核苷酸残基的结构域，即，由内切核酸酶切割，以便所述内切核酸酶能通过酶促在所述位点上产生双链切割，并因此使所述环状导向载体线性化。所述线性化内切核酸酶位点可以回文的或非回文的，并且长度通常为至少大约4个核苷酸，有时候长度为至少大约16个核苷酸，有时候长度为至少大约24个核苷酸，其中，所述长度可以为至少大约50个核苷酸或更长，不过，长度通常不超过大约600个核苷酸。所述线性化内切核酸酶位点通常是不存在于所述靶细胞基因组中的位点，以少数几个拷贝存在，以便在切割之后，它们在所述细胞中修复，以便不会产生不利后果，或者所述细胞位点是受到保护的，例如，DNA结构(甲基化等)，结合蛋白等，以便本发明的实施不会导致所述靶细胞基因组的显著切割。
在某些实施方案中，本发明载体的特征是所述线性化内切核酸酶位点不是由所述靶细胞的内源性内切核酸酶选择性识别的。换句话说，所述靶细胞在它的基因组内部本身不包括编码线性化内切核酸酶的编码序列。因此，所述线性化内切核酸酶位点是由一种线性化内切核酸酶识别的，这种酶对于不同于所述靶细胞的物种的物种来说是内源的。任何两种特定的生物如果使用标准分类学标准分类属于不同的类型，就认为它们是不同的物种，所述分类学标准如由国家卫生部提供的用于开发所述分类表的分类标准。尽管所述线性化内切核酸酶不是被为它所针对的靶细胞来说内源的线性化内切核酸酶识别的，在某些实施方案中，可以对靶细胞进行工程改造，以便表达所述线性化内切核酸酶，正如在下面所更详细地披露的。观察本发明该特征的另一种方式是，识别存在于所述导向载体中的它的靶位点的线性化内切核酸酶是不存在于所述靶细胞的野生型生物体中的酶。
根据所述导向载体是否用于″ends-out″或″ends-in″导向方案，所述线性化内切核酸酶位点可存在于所述整合因子的内部或外部，下面将对它作更详细地说明。″ends-out″和″ends-in″导向方法为本领域技术人员所公知，并且在以下文献中进行过综述Rong和Golic，Science(2000)2882013-2018。这样，在某些实施方案中，所述线性化内切核酸酶位点存在于所述整合因子内部。在其他实施方案中，所述线性化内切核酸酶位点存在于所述整合因子外部。在不希望将所述线性化内切核酸酶位点掺入所述靶基因组上的实施方案中，采用所述ends-out方法，以便所述线性化内切核酸酶位点位于整合因子的载体外面，即，位于所述载体上的整合因子的5′或3′。
所述线性化内切核酸酶位点可以是由限制性内切核酸酶识别的位点，其中，特别感兴趣的内切核酸酶是上文所披露的罕见切割酶，例如，I-Sce-1，I-SsP-1等，其中，在某些实施方案中，所述位点是由重组酶识别的，其中，重组酶可以是解离酶，整合酶，转化酶或转座酶。感兴趣的重组酶和转座酶系统的例子是，例如，来自噬菌体P1的Cre-lox系统，酿酒酵母的FLB-FRT系统，Zygosaccharomyces rouxii的R-RS系统，噬菌体μ的Gin-gix系统，果蝇的P因子转座酶/P足系统，φC31 att位点/整合酶系统。当所述内切核酸酶是重组酶，而所述内切核酸酶位点是标记转座子边界的末端重复时，所述内切核酸酶和内切核酸酶位点可以是来自若干种已知可转座的因子中的任意一个，例如，果蝇属的hobo，copia，gypsy因子，植物的Ac/Dc，En/Spm，Tam系统，秀丽新杆线虫的任一种Tc因子，酿酒酵母的TY因子，多种高等真核生物水手和水手样(例如Sleeping Beauty)因子，以及大肠杆菌的任何Tn和ISS可转座的因子。当所述内切核酸酶是重组酶，而所述内切核酸酶位点是由所述内切核酸酶识别的重组位点(例如，att位点，识别序列等)时，所述内切核酸酶和内切核酸酶位点可以源于若干种噬菌体中的一种，如λ，φC31，γδ噬菌体att系统等，可转座的因子，病毒(例如，腺伴随病毒，逆转录病毒等)或其他系统。根据内切核酸酶的这些例子，和定义，本领域技术人员能方便地鉴定用于本发明的其他限制性内切核酸酶，重组酶，以及转座酶。所述内切核酸酶的切割位点，例如I-SceI和loxP位点，P足，LTRs，att位点等，在以下文献中有详细描述(Marshall等TIG 1992 8432-439；Hallet and Sherratt等，FEMS Mic.Reviews 21 1999 157-178；Sadowski等FASEB J，1993 7760-767)。
在任何事件中，所述载体是通过上述方法中的任意一种等线性化的，在给所述多细胞生物施用之前或使用之后线性化。所述线性化的载体是所述细胞开始同源重组的关键信号传递事件。
整合因子除了所述线性化内切核酸酶位点之外，本发明的导向载体还包括同源重组整合因子，它是由外源核苷酸或核酸(即，希望整合到靶细胞基因组中的核酸)组成的，其侧翼是提供与所述靶细胞基因组进行同源重组的序列，所述载体就是为了用于所述靶细胞基因组而设计的。如上文所述，同源侧翼序列与所述靶基因组上的靶位点具有序列同一性，并且促进载体的整合因子和靶位点之间的同源重组，以便导致所述整合因子插入所述靶细胞基因组。所述侧翼同源序列的长度可以改变，其中，所述长度通常为至少大约500个碱基对，一般至少大约500个碱基对，更优选至少大约1kb，其中，在某些实施方案中，所述长度至少大约30kb或更长，不过有时候不超过大约10kb，并且有时候不超过大约3kb。
在提供同源重组的序列的侧翼是要插入基因组的外源核酸，其中，所述外源核酸的长度为至少大约1nt，其中，在很多实施方案中，所述外源核酸的长度为至少两个或两个以上nt，其中，在某些实施方案中，所述外源核酸的长度为至少大约100nt，有时候长度为至少大约1,000nt，其中，所述外源核酸的长度可以为30kb或更长，不过，有时候其长度不超过大约3,000nt。在某些实施方案中，所述外源核酸包括表达盒，表达调控核酸，治疗基因，和表达破坏核酸等，其中，所述感兴趣的核酸片段可以是性状产生核酸。
任选成分如上文所述，根据所述导向载体设计用于的特定用途或方法，本发明载体还可以包括多种任选成分。正如在下面更详细地披露的，在实施本发明时，除了所述导向载体，本发明系统的所述内切核酸酶成分(例如，蛋白或编码所述蛋白的核酸)也被导入所述靶细胞，以便存在所述内切核酸酶，通过同源重组介导所述导向载体整合到所述靶基因组中。所述线性化内切核酸酶可以作为多肽或编码具有需要的内切核酸酶活性产物的核酸导入所述靶细胞。在后面这些实施方案中，所述核酸可以在独立于所述导向载体的载体中导入所述靶细胞，或者编码需要的内切核酸酶活性的核酸可以存在于所述导向载体本身上。这样，在后面这些实施方案中，所述导向载体还包括编码能识别载体上的线性化内切核酸酶位点的内切核酸酶的结构域。内切核酸酶-编码核酸可以是化学合成的，或者通过常规重组DNA技术(例如，聚合酶链式反应，文库筛选等)从携带所述核酸的宿主中分离，并且克隆到导向载体上以便表达。应当理解的是，可以在使用之前修饰所述核苷酸(例如，去除限制位点，改变密码子使用，改变调控区，添加/去除内含子等)。
如上文所述，线性化内切核酸酶可以是限制性内切核酸酶或重组酶，其中，重组酶可以是解离酶，整合酶，转化酶或转座酶。感兴趣的重组酶和转座酶系统的例子是，例如，来自噬菌体P1的Cre-lox系统，酿酒酵母的FLB-FRT系统，Zygosaccharomyces rouxii的R-RS系统，噬菌体μ的Gin-gix系统，果蝇的P因子转座酶/P足系统，φC31att位点/整合酶系统。当所述内切核酸酶是重组酶，而所述内切核酸酶位点是标记转座子边界的末端重复时，所述内切核酸酶和内切核酸酶位点可以是来自若干种已知可转座的因子中的任意一个，例如，果蝇属的hobo，copia，gypsy因子，植物的Ac/Dc，En/Spm，Tam系统，秀丽新杆线虫的任一种Tc因子，酿酒酵母的TY因子，多种高等真核生物水手和水手样(例如Sleeping Beauty)因子，以及大肠杆菌的任何Tn和ISS可转座的因子。当所述内切核酸酶是重组酶，而所述内切核酸酶位点是由所述内切核酸酶识别的重组位点(例如，att位点，识别序列等)时，所述内切核酸酶和内切核酸酶位点可以源于若干种噬菌体中的一种，如λ，φC31，γδ噬菌体att系统等，可转座的因子，病毒(例如，腺伴随病毒，逆转录病毒等)或其他系统。因此，如上文所述，在某些实施方案中所述导向载体包括编码线性化内切核酸酶的核酸。另外，某些实施方案可以采用这样的系统，其中，所述内切核酸酶已经存在于所述多细胞生物的基因组中，它是作为天然基因存在的，或是遗传工程的生物。
其他任选的成分在某些实施方案中，作为感兴趣的核酸片段，在所述基因导向载体中还包括选择标记。所述选择标记允许相对不具备整合载体的细胞选择含有整合基因导向载体的细胞。
载体构建本发明的载体可以通过限制酶切割，连接和分子克隆的标准方法生产。用于构建本发明载体的一种方法包括以下步骤首先，利用限制性内切核酸酶从原始来源上切割含有所需成分核苷酸序列以及外来序列的纯化的核酸片段。然后利用常规分离方法，例如，通过琼脂糖凝胶电泳将含有所需核苷酸序列的片段与具有不同大小的不需要的片段分离开。将所需片段从所述凝胶上切除，并且以合适的构型连接在一起，以便生产如上文所述的含有所需序列的环状核酸或质粒，例如，所需的序列是与本发明载体的各种因子相应的序列。如果需要，然后在原核宿主，例如大肠杆菌中扩增如此构建的环状分子。与所述步骤相关的切割，质粒构建、细胞转化，和质粒生产的方法为本领域技术人员所熟知，并且进行限制消化和连接的酶可以通过商业渠道获得。(例如，参见，R.Wu，Ed.，Methods in Enzymology，Vol.68，Academic Press，N.Y.(1979)；T.Maniatis，E.F.Fritsch and J.Sambrook，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.(1982)；Catalog 1982-83，New England Biolabs，Inc.；Catalog 1982-83，Bethesda Research Laboratories，Inc.)。
导向载体与靶细胞接触综上所述，在实施本发明方法时，让本发明的导向载体与基因组需要修饰的靶细胞接触，以便所述导向载体被所述细胞内化。在所述导向载体内化时(其中，所述导向载体的某些点通过合适的线性化内切核酸酶线性化)，所述整合因子可以通过同源重组进入所述靶细胞基因组。
导向载体与靶细胞的接触可以通过任何常规方法实现。在这些实施方案中，其中，所述靶细胞是作为诸如动物的多细胞生物的一部分存在的，所述导向载体通常被施用于(例如，注射，喂食等)诸如完整动物的所述多细胞生物，其中，施用可以是系统性的或局部的，例如，直接应用于多细胞生物的特定组织和/或器官。
可以用任何常规方法将所述导向载体导入动物细胞，其中，所述方法可以提供所述载体的体内，体外，或离体的导入。在可用于送递本发明载体的体内方法中，包括通过基于脂质的，例如，脂质体载体进行送递，其中所述基于脂质的载体可以导向于特定细胞类型，以便进行所述载体的细胞或组织特异性送递。披露所述方法的专利包括美国专利号5,877,302；5,840,710；5,830,430；和5,827,703，这些专利的内容被收作本文参考。还可以采用其他体内送递系统，包括使用可以有或没有用导向部分修饰过的基于聚赖氨酸的肽作为载体，显微注射和电冲孔等(Brooks，A.I.，等1998，J.neurosci.Methods V.80 p137-47；Muramatsu，T.，Nakamura，A.，和H.M.Park 1998，Int.J.Mol.Med.V.1 p55-62)。在某些感兴趣的实施方案中，没有采用基于病毒的核酸导入载体，因为由于可以使用多种不同类型的载体和送递载体，施用可以通过多种不同的途径进行，其中，典型的施用途径包括口服，局部，动脉内，静脉内，腹膜内，肌内，鼻内，结膜内等。具体的施用方式至少部分取决于用于送递所述载体的媒介物的性质。在很多实施方案中，所述载体是通过血管内途径施用的，例如动脉内或静脉内，其中采用水基送递媒介物，例如，盐溶液。
导入动物体内的载体核酸的量足以提供需要的所述外源核酸向所述基因组中的整合。因此，所导入的导向载体核酸的量应当提供所述外源核酸的足够的拷贝数量。被导入所述动物体内的载体核酸的数量根据所采用的特定导入或转染方法的效力而改变。
如上文所述，所述导向载体是在足以提供在内切核酸酶位点上切割载体的条件，以便使最初是环状的导向载体线性化，即载体线性化条件下导入靶细胞的，其中，所述条件是以多种方式提供的，其中，所述条件包括在给所述多细胞生物施用之前将最初环状的导向载体线性化的状况，以及将最初环状的导向载体以它的原始环状形状给所述多细胞生物施用，然后在体内线性化的状况，例如，通过采用业已经过工程改造能够在所述靶细胞内表达所述线性化内切核酸酶的宿主，或者给所述细胞或含有所述细胞的宿主共同施用所述线性化内切核酸酶或它的编码序列，其中，共同施用可以在施用所述载体之前或同时进行。
因此，在后面这些实施方案中，其中，所述最初是环状的导向载体的线性化是在体内进行的，本发明系统的所述内切核酸酶成分(例如，蛋白或编码蛋白的核酸)存在于所述靶细胞中，以便介导所述导向载体的线性化，并且通过同源重组将其整合因子整合到所述靶细胞基因组中。如上文所述，所述宿主可以是预先工程改造过的，以便表达所述线性化内切核酸酶，或者可以给所述靶细胞施用所述线性化内切核酸酶。其中，所述线性化内切核酸酶活性是作为多肽提供的，可以采用任何常规的多肽/蛋白导入方法。将功能性蛋白导入细胞的方法为本领域所熟知。另外，在用于转化所述细胞的表达载体中可以包括编码内切核酸酶的核酸。内切核酸酶编码核酸可以是化学合成的，或者通过常规重组DNA技术从携带所述核酸的宿主中分离(例如，聚合酶链式反应，文库筛选等)，并且克隆到用于表达的合适载体上。应当理解的是，所述核苷酸可以在使用之前进行修饰(例如，去除限制性位点，改变密码子使用，改变调控区，添加/去除内含子等)。
如上文所述，所述方法导致了所述同源重组整合因子整合到所述靶细胞基因组中。
上述整合方法可用于将多种外源核酸稳定地整合到靶细胞中。在很多实施方案中，存在于所述外源核酸中的核苷酸的序列可以是不存在于所述靶细胞基因组中的序列，即，对所述靶细胞来说它是外源的。在其他实施方案中，所述外源核酸的序列实际上可以是存在于所述靶细胞中的序列。
如上文所述，本发明的系统可用于多种靶细胞，其中，在很多实施方案中，靶细胞是非细菌靶细胞，并且通常是真核靶细胞，包括植物和动物靶细胞，例如昆虫细胞，脊椎动物细胞，特别是禽类细胞，例如，鸡细胞；哺乳动物细胞，包括，鼠，猪，有蹄动物，绵羊，马，大鼠，狗，猫，猴和人类细胞等。
用途本发明方法可应用于多种用途中，其中，需要将外源核酸以定点方式整合到靶细胞中。可以采用本发明载体和方法的用途包括研究用途，多肽合成用途和治疗用途。下面将更详细地分别披露上述每一种典型类型的用途。
研究用途可以采用本发明方法的研究用途的例子包括为了表征特定基因而设计的用途。在所述用途中，将所述载体用于1)将感兴趣的基因或编码序列插入靶细胞；2)部分或完全去除一个基因；或3)用不同的核苷酸取代基因上的一个或多个特定核苷酸，并且观察对所述动物表型产生的影响。这样，可以推测有关所述基因活性以及由它所编码的产物性质的信息。
还可以将本发明的载体用于生产模型，其中，在细胞中产生感兴趣的基因的表达，包括超量表达和/或错误表达，并且观察这种突变型表达形式的作用。因此，人们可以将本发明方法和组合物用于有效和快速地生产专门设计的转基因，敲除或敲入动物，可以将这种动物用作多种不同条件的模型，正如本领域所已知的。
多肽合成用途除了上述研究用途之外，本发明方法和载体还可用于多肽的合成，例如，感兴趣的蛋白的合成。在这些用途中，将包括与必要的和/或需要的表达调控序列，例如，启动子等结合的编码感兴趣多肽的基因的载体(即表达组件)导入靶细胞，将所述细胞用作表达所述多肽的表达宿主。在导入并且随后稳定整合到所述靶细胞基因组中之后，在足以表达所述整合基因的条件下维持所述靶宿主细胞。一旦制备了能表达所述蛋白的转化宿主，就对所述蛋白进行纯化，以便生产含有所需蛋白的组合物。任何常见的蛋白纯化方法都可以采用，其中，合适的蛋白纯化方法披露于以下文献中(Deuthser ed.)(Academic Press，1990)。例如，可以用表达所述蛋白的表达宿主制备裂解物，并且通过HPLC，排阻层析，凝胶电泳，和亲和层析等纯化。
体内蛋白生产本发明的重组细胞可以用作重组细胞系群体，用作重组原代或继代细胞的群体，重组克隆细胞株或系，重组异源细胞株或系，以及用作细胞混合物，其中，存在上述四种类型的重组细胞之一的至少一种代表性细胞。可以将所述细胞用于送递系统，用于治疗具有异常或不希望状况的个体，所述状况对治疗性产品的送递有反应，所述产品是1)治疗蛋白(例如，缺乏的，相对个体的生理学需要而言是产量不足的，在所述个体内是缺乏的或无效或不适当利用的；具有新功能的蛋白，如酶促或转运功能)或2)治疗核酸(例如，能抑制基因表达或具有内在的酶促活性的RNA)。在本发明的提供治疗蛋白或核酸的方法中，给需要治疗或预防所述异常或不希望的状况的个体施用重组原代细胞，克隆细胞株或异源细胞株，通过合适的途径以足够的数量施用，以便在生理学相关的水平上表达或提供所述蛋白或外源DNA。感兴趣的代表性治疗蛋白包括，但不局限于因子VIII，因子IX，β-球蛋白，低密度脂蛋白受体，腺苷脱氨酶，嘌呤核苷磷酸化酶，鞘磷脂酶，葡糖脑苷脂酶，囊性纤维化跨膜传导调节剂，α1-抗胰蛋白酶，CD-18，鸟氨酸转氨甲酰酶，精氨琥珀酸合成酶，苯丙氨酸羟化酶，支链α-酮酸脱氢酶，延胡索酰乙酰乙酸水解酶，葡萄糖6-磷酸，α-L-岩藻糖苷酶，β-葡糖醛酸酶，α-L-iduronidase，半乳糖1-磷酸尿苷酰转移酶，白介素，细胞因子，和小肽等(其中，上述蛋白是人类蛋白)。另外，给生物直接施用上述载体系统，例如，通过合适的系统或局部施用途径，其中，所述载体成分进入一个或多个靶细胞，并且调节被导向的基因组结构域的转录，例如，获得治疗作用，例如，表达治疗蛋白，而这种蛋白在实施本发明方法之前是不能表达的。生理学上相关的水平是这样的水平，它是接近所述产物在体内正常生产的水平，或导致所述异常或不希望的状况的改善。例如，hGH，hEPO，人胰岛素调理素，hGM-CSF，hG-CSF，人α-干扰素，或人FSHβ可以系统性地送递到人体内，以便获得治疗作用。因此，本发明的载体系统可用于治疗用途，其中，将所述方法和载体用于调节靶细胞的基因组结构域，例如，编码治疗蛋白的结构域的转录，例如，可用于进行基因治疗用途。本发明载体可用于调节多种治疗蛋白的转录。
体外蛋白生产还可将本发明的源于人或非人物种的重组细胞用于体外蛋白生产。所述细胞是在本领域所公知的能导致蛋白表达的条件下维持的。利用所述方法表达的蛋白可以从细胞裂解物或细胞上清液中纯化，以便纯化所需要的蛋白。按照该方法生产的蛋白包括治疗蛋白，可以通过本领域所公知的常规药用途径(例如，口服，静脉内，肌内，鼻内或皮下)将它送递到人或非人动物体内。所述蛋白包括hGH，hEPO，和人胰岛素调理素，hGM-CSF，hG-CSF，FSHβ或α-干扰素。所述细胞可以是永生化的，原代，或继代细胞。当非人细胞用于蛋白生产目的(其中，所述非人蛋白具有治疗性或商业用途)有利的时候，可能需要使用来自其他物种的细胞，例如，利用源于鲑鱼的细胞生产鲑鱼降血钙素，利用源于猪的细胞生产猪胰岛素，并且利用牛细胞生产牛生长激素。
因此，本发明方法可用于合成多肽，例如感兴趣的蛋白。在所述用途中，将包括感兴趣的多肽的转录调控单位的载体导入所述靶细胞，所述细胞用作表达所述多肽的表达宿主。在导入以及随后稳定整合到所述靶细胞基因组中之后，在足以表达现在可操作地与新整合的转录调控单位连接的基因的条件下维持所述被导向的宿主细胞。一旦制备了表达所述蛋白的转化宿主，然后可以纯化所述蛋白，以便生产包括所需蛋白的组合物。任何常规的蛋白纯化方法都可以使用，其中，合适的蛋白纯化方法披露于以下文献中(Deuthser ed.)(Academic Press，1990)。例如，可以用能表达所述蛋白的表达宿主制备裂解液，并且通过HPLC，排阻层析，凝胶电泳，和亲和层析等纯化。
治疗用途本发明载体还可用于治疗用途，其中，将所述方法和载体用于将治疗核酸，例如，基因或其蛋白/因子编码序列稳定地整合到靶细胞的基因组中，即基因治疗用途。可将本发明载体用于送递多种治疗核酸。用于治疗基于遗传缺陷的疾病状况的特定的治疗基因包括编码以下产物的基因因子VIII，因子IX，β-球蛋白，低密度脂蛋白受体，腺苷脱氨酶，嘌呤核苷磷酸化酶，鞘磷脂酶，葡糖脑苷脂酶，囊性纤维化跨膜传导调节剂，α1-抗胰蛋白酶，CD-18，鸟氨酸转氨甲酰酶，精氨琥珀酸合成酶，苯丙氨酸羟化酶，支链α-酮酸脱氢酶，延胡索酰乙酰乙酸水解酶，葡萄糖6-磷酸，α-L-岩藻糖苷酶，β-葡糖醛酸酶，α-L-iduronidase，半乳糖1-磷酸尿苷酰转移酶，白介素，细胞因子，和小肽等。
上面所列举的蛋白是哺乳动物蛋白，而在很多实施方案中，是人类蛋白，其中，上述蛋白的核苷酸和氨基酸序列为本领域技术人员所普遍公知。可以通过本发明载体送递的癌症治疗基因包括能够增强淋巴细胞的抗肿瘤活性的基因，它的表达产物能够增强肿瘤细胞的免疫原性的基因，肿瘤抑制基因，毒素基因，自杀基因，多药物抗性基因，和反义序列等。
给动物直接施用本发明的基因导向载体具有多种治疗用途，包括纠正与疾病或状况相关的突变基因的序列，激活内源基因，破坏毒性内源基因，导入外源基因等。本领域技术人员应当了解该基因导向系统的多种用途。
系统还提供了用于实施本发明方法的系统。本发明的系统至少包括由上文所述的导向载体。当所述导向载体不能提供线性化内切核酸酶活性时，本发明的系统通常还包括线性化内切核酸酶活性的来源，例如，具有所需活性的多肽或编码具有所述所需内切核酸酶活性的产物的核酸。
试剂盒还提供了用于实施本发明方法的试剂盒。本发明的试剂盒至少包括如上文所述的导向载体，以及相应的内切核酸酶或内切核酸酶-编码序列，其中，后面这些成分可以是或不是独立于所述导向载体的成分。本发明的试剂盒还包括可用于本发明的其他成分，例如缓冲液，送递载体等。
所述试剂盒的各种成分可以存在于独立的容器中，或者可以根据需要将某些相容的成分预先组合在一个容器中。
除了上述成分之外，本发明的试剂盒还包括用于指导实施本发明的说明书。所述说明书能够以各种形式出现在本发明的试剂盒中，在所述试剂盒中可以存在一种或多种形式。提供所述说明书的一种形式是印刷在合适的介质或基质上的信息，所述介质或基质例如，在它上面印刷有所述信息的纸张，存在于所述试剂盒的包装中的信息，存在于包装插件等中的信息。另一种装置是计算机可读的介质，例如，软盘，CD等，在这些介质上业已记录了所述信息。可以提供的另一种形式是网站地址，可以利用该地址通过互联网从远处获得所述信息。任何常见的方式都可存在于所述试剂盒中。以下实施例是以说明形式而不是以限定形式提供的。
实验提供以下实施例是为了给本领域普通技术人员提供如何实施并且使用本发明的完整的说明和介绍，而不是要限定本发明人所认为的本发明的范围，也不是要将下面的实验作为所进行的所有或仅有的实验。为了确保所使用的数字(例如，数量，温度等)的精确性，业已做出了努力，但是，某些实验误差和偏差也是存在的。除非另有说明，份数是重量份数，分子量是重量平均分子量，温度是摄氏度，而压力是大气压或接近大气压。
载体构建用于下文所述DNA载体的原始材料是本领域技术人员能方便地获得的(例如，Casper4和P因子转座酶质粒(Flybase)，鸟氨酸脱羧酶(ODC)大鼠基因组DNA(可以从ATCC以及它的网站获得，该网站是在″atcc″的前面添加″www.″，在它的后面添加″.org″构成的)乳清相关蛋白(WAP)小鼠基因组DNA(同样可以从ATCC(www.atcc.org)获得，Sleeping Beauty DNA(Minnesota大学)(例如，相关序列的信息参见美国专利号6,489,458，该专利的内容被收作本文参考)，以及具有单一PI-SCEI切割位点的质粒(New England Biolabs))。由于Casper4不能整合到非果蝇物种的基因组中，可以将它用于检测同源整合，或通过标准限制性消化和克隆方法将一个P足从所述载体上去除(留下单个P足切割位点)。对于Sleeping Beauty因子来说，它不能整合到多种物种上，必须去掉一个足。由于每一个足(转座酶识别序列是相同的)，可以将任一个足去掉。然后P因子载体，Sleeping Beauty载体，或含有PI-SCEI单一切割位点的质粒具有按下文所述通过标准分子生物学方法克隆到其中的需要的WAP或ODC DNA。本发明的载体可以通过标准限制酶切割，连接和分子克隆方法生产。
用于构建本发明载体的一种方法包括以下步骤首先，用限制性内切核酸酶将含有需要的成分核苷酸序列以及外来序列的纯化核酸片段从它的原始来源上切割下来。然后利用常规分离方法，例如，通过琼脂糖凝胶电泳将含有所需核苷酸序列的片段从具有不同大小的不需要的片段中分离出来。将所需片段从所述凝胶上切除，并且以合适的构型连接在一起，以便生产如上文所述的含有所需序列的环状核酸或质粒，例如相当于本发明的各种因子的序列。如果需要，可以利用原核宿主，例如大肠杆菌扩增由此构建的环状分子。在这些步骤中所涉及到的切割方法，质粒构建，细胞转化和质粒生产为本领域技术人员所熟知，并且，进行限制和连接所需要的酶可以通过商业渠道获得(例如，参见，R.Wu，Ed.，Methods in Enzymology，Vol.68，Academic Press，N.Y.(1979)；T.Maniatis，E.F.Fritsch and J.Sambrook，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.(1982)；Catalog 1982-83，New England Biolabs，Inc.；Catalog 1982-83，Bethesda Research Laboratories，Inc)。
实施例1利用环状基因导向载体对大鼠的鸟氨酸脱羧酶基因进行基因导向为了证实这种方法是成功的，构建了环状基因导向载体。所述环状载体包括单个果蝇属P因子转座酶切割位点(P足)以及改变了的大鼠基因组DNA的片段。选择所述大鼠鸟氨酸脱羧酶基因(odc)是因为它的完整序列是已知的，并且可以通过商业渠道获得。为了分析所述载体的整合，在所述载体的odc基因上形成三个小的缺失。所述小的缺失位于该基因的5′末端，3′末端和中间部分。也制备了取代修饰过的odc基因的含有大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因的对照载体。该对照载体不含有与所述大鼠基因组具有显著同源性的已知序列。用50μg所述环状odc/P足基因导向载体和10μg编码P因子转座酶的质粒DNA，以及环状阴性对照质粒共同注射大鼠。三周之后，处死所述大鼠，并且从多种组织中制备所述大鼠的基因组DNA，其中的某些组织包括肝脏和肠。对所述DNA进行PCR分析，使用能扩增P足和odc中间缺陷的引物，以及对照。
使用P足或β-半乳糖苷酶-特异性引物对施用对照的大鼠的各种基因组DNA样品进行PCR，没有得到产物，因此，没有发生所述对照载体的可检测的基因组整合。对来自施用了具有所述修饰过的odc基因的基因导向载体的大鼠的基因组DNA的各种样品进行PCR，发现所述修饰过的odc基因业已整合到了所述大鼠基因组中。另外，在所述样品中，用P足特异性引物不能检测到扩增，这表明所述odc基因业已通过同源重组机制整合。如图1所示，还获得了有关同源重组的其他证据。
在图1中示出了线性化的ODC载体和正常基因组ODC基因的示意图。在将它克隆到ODC载体上之前，通过工程改造使ODC基因具有三个小的缺失，并且这些缺失在基因组ODC基因上通过垂直线条表示。从用上述ODC载体注射过的大鼠组织中分离基因组DNA。使用PCR方法，同时使用引物2和3，在各种组织中检验基因组DNA的ODC载体整合。所述PCR反应检测到了长度为500bp的强的正常基因组ODC基因带。不过，在很多只来自注射过的动物，包括它们的一些后代的组织(例如，脑，睾丸，卵巢，尾，肝脏，肺，心脏，肠道，脾脏)中检测到了长度为200bp的另一条带(ODC载体带的大小)。然后用能特异性检测P足DNA的PCR引物检测出现了表明存在ODC载体的带的DNA样品。PCR分析没有检测到P足DNA的存在。这一发现表明，所述ODC载体不是随机整合到大鼠基因组DNA中的，否则，所述PCR足序列也将是可检测的。最后，用引物1和3对所述样品进行的PCR证实，在来自注射过的大鼠的样品中，同时存在正常(基因组)和缺失(ODC载体)形式的ODC基因。对所述基因的缺失形式进行PCR扩增的唯一途径是，如果所述ODC载体以同源方式整合到ODC基因组基因中。
实施例2利用环状基因导向载体对小鼠的乳清相关蛋白(WAP)基因进行基因导向为了证实该方法在小鼠中同样是成功的，构建了环状基因导向载体。该环状载体包括单个果蝇属P因子转座酶切割位点(P足)和改变了的小鼠基因组DNA的一个片段。选择所述小鼠乳清相关蛋白基因(WAP)是因为它的完整序列是已知的。为了分析所述载体的整合，在所述载体的WAP基因上形成两个小的缺失。这些小的缺失位于该基因的5′末端和3′末端。将具有组成型活性小鼠启动子的大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因克隆到修饰过的WAP基因的中间。用10μg的环状WAP基因导向载体和2μg的编码P因子转座酶的质粒DNA，以及环状阴性对照质粒同时注射小鼠。三个月之后，从所述注射动物以及它们的后代的多种组织(例如，血液，肝脏，肺，肾脏)中制备基因组DNA。对所述DNA进行PCR分析，使用能扩增P足，β-半乳糖苷酶基因，以及WAP基因和β-半乳糖苷酶基因这两者的引物。
利用P足或β-半乳糖苷酶PCR-特异性引物对来自施用对照的小鼠的基因组DNA的各种样品进行PCR没有得到产物，这表明没有发生所述对照载体的可检测的基因组整合。对来自施用所述WAP基因导向载体和对照的小鼠的基因组DNA的各种样品进行的PCR，证实了所述β-半乳糖苷酶基因整合到所述基因组上，并且位于小鼠基因组中的WAP基因组基因上。最后，检查了所述β-半乳糖苷酶基因的表达，并且在所有组织中都发现了它的表达。
实施例3按以下方法修饰所述WAP载体去除β-半乳糖苷酶基因，在WAP基因的中间形成一个小的缺失，并且去除P足DNA序列。通过用限制性内切核酸酶SspI处理所述DNA，将该载体线性化。将这种线性DNA注射到小鼠体内，并且利用与实施例2所述类似的方法分析。所述DNA同源整合到了所述注射过的动物的所有检测的组织中的WAP基因上，并且产生了具有遗传学改变的WAP基因的后代。
实施例4用10μg含有相应于突变基因的正常形式的整合载体和1μg转座酶DNA共同注射肥胖的小鼠突变体。一共进行了10次注射，每周注射1次。另外，同样将不含基因的对照载体注射到所述突变小鼠体内。在5周时间末，对照小鼠表现出体重平均增加了15％(每只小鼠的体重增加了大约8克)。用含有正常肥胖基因序列的整合载体注射的小鼠，表现出体重下降了10％(每只小鼠的体重下降了大约5克)。由于所述整合载体具有相当于所述肥胖基因的外显子14-17(和该区的内含子)的基因组DNA，只有同源重组是治愈所述小鼠出现肥胖的原因。就是说，如果是随机整合的，所述正常的肥胖基因片段不能挽救所述表型，因为它只含有所述基因的一小部分，并且没有启动子，并且没有翻译的起始位点等。已知所述肥胖小鼠的突变发生在15和16外显子之间，这表明不仅发生了同源重组，而且它的发生足以产生生理学反应。另外，这种特殊的肥胖基因需要在大脑中产生，因此它表明了这种技术能够通过血脑屏障。
实施例5基于P因子的载体的替代物构建了具有与实施例3所述相同的缺失的WAP基因的载体(参见上文)。此时所述载体主链包括单个切割位点，该切割位点用于a)Sleeping Beauty或b)其他罕见的DNA切割酶(例如，PI-SCEI)。将10微克的这些DNAs与编码所述切割酶的DNA(1微克Sleeping Beauty酶的DNA和大约5个单位的PI-SCEI，购自New England Biolabs)注射到小鼠体内。进行10次注射，每次注射时间间隔1周，然后用一个月时间不对这些小鼠作进一步的处理。然后处死所述小鼠，并且采集各个组织/器官，并且用每一种分离的样品制备基因组DNA。利用所述方法观察同源重组，不过，它的整合频率远远低于用基于P因子的载体观察到的整合频率。这可能是由于Sleeping Beauty的不太有效的切割。同样，对于PI-SCEI来说，所述切割可能在注射期间发生或所述蛋白进入细胞的能力减弱或可能没有使用足够的酶。
实施例6利用环状基因导向载体对人进行治疗为了证实该方法在人体上是成功的，构建了环状基因导向载体。该环状载体包括单个果蝇属P因子转座酶切割位点(P足)和正常人β-球蛋白基因组基因的一个片段。选择所述人β球蛋白基因是因为它的完整序列是已知的，并且它是镰状细胞性贫血的发病原因。
给患有通过所述选择的β球蛋白基因上的突变导致的镰状细胞性贫血的患者施用20毫克所述环状基因导向载体和4毫克的P因子转座酶-表达质粒。在经过3周时间的每周使用1次所述β球蛋白定向构建体之后，检验血液形态学，以便确定形态学正常的血细胞的存在。另外，对从定期采集的血样中分离的基因组DNA进行DNA分析，以便确定所述β球蛋白基因正在被所述基因导向载体修复。最后，记录镰状细胞性贫血的症状的减轻。
通过以上结果和讨论证实，本发明提供了有效和高效的试剂和方法，可以实现外源核酸向多细胞生物的靶细胞基因组中的定点整合。由于所述机制是同源重组，避免了与随机整合相关的问题。此外，本发明提供了同源重组效率的显著提高。因此，本发明对本领域作出了突出的贡献。
在本说明书中所引用的所有出版物和专利申请都被收作本文参考，就如同每一份出版物或专利申请被专门和分别指明被收作参考文献一样。对任何出版物的引用都是因为它的公开早于本申请的申请日，而不是认为承认本发明不能享受因发明在先而先于这些材料的权利。
尽管为了清楚理解而通过说明和举例形式对上述发明进行了披露，通过本发明的介绍，本领域普通技术人员可以理解的是，在不超出所附权利要求书的构思和范围的前提下，可以对它进行某些改变和改进。
权利要求
1.一种通过同源重组使外源核酸进入多细胞生物的靶基因组的方法，所述方法包括给所述多细胞生物施用有效量的整合载体，包括(a)包括所述外源核酸的同源重组整合因子，所述外源核酸侧翼为提供与所述靶基因组的同源重组的序列；和(b)线性化内切核酸酶识别位点，在存在用于所述线性化内切核酸酶位点的内切核酸酶的情况下，该识别位点能够被所述内切核酸酶切割，以便产生线性化载体；该方法的使用条件使得所述整合载体被所述内切核酸酶切割，以便产生线性化载体，通过这种载体使所述整合因子同源重组进入所述靶基因组。
2.如权利要求1的方法，其中，所述整合载体是在施用于所述多细胞生物之前，通过所述内切核酸酶线性化的。
3.如权利要求1的方法，其中，所述整合载体是在施用于所述多细胞生物之后，通过所述内切核酸酶线性化的。
4.如权利要求1的方法，其中，所述内切核酸酶是限制酶。
5.如权利要求4的方法，其中，所述限制酶是SspI。
6.如权利要求1的方法，其中，所述内切核酸酶是重组酶。
7.如权利要求6的方法，其中，所述重组酶是转座酶。
8.如权利要求1的方法，其中，所述方法还包括给所述多细胞生物施用所述内切核酸酶或包括其编码序列的核酸。
9.如权利要求8的方法，其中，所述方法还包括给所述多细胞生物施用包括所述内切核酸酶的编码序列的核酸。
10.如权利要求9的方法，其中，所述编码序列不存在于所述整合载体上。
11.如权利要求9的方法，其中，所述编码序列存在于所述整合载体上。
12.如权利要求1的方法，其中，所述整合载体是通过血管内途径施用的。
13.如权利要求1的方法，其中，所述多细胞生物是动物。
14.如权利要求13的方法，其中，所述动物是昆虫。
15.如权利要求1的方法，其中，所述动物是脊椎动物。
16.如权利要求15的方法，其中，所述脊椎动物是哺乳动物。
17.一种通过同源重组使外源核酸进入脊椎动物的靶基因组的方法，所述方法包括给所述脊椎动物施用有效量的环状整合载体，包括(a)同源重组整合因子，它包括所述外源核酸，其侧翼为提供与所述靶基因组的同源重组的序列；和(b)线性化内切核酸酶识别位点，当它与能识别所述线性化内切核酸酶识别位点的线性化内切核酸酶接触时，被所述内切核酸酶切割，以便产生线性化的整合载体，其中，所述线性化内切核酸酶是对所述脊椎动物而言，不是内源的内切核酸酶；以便所述环状整合载体被所述内切核酸酶切割，以产生线性化整合载体，通过这种载体使所述整合因子同源重组进入所述靶基因组。
18.如权利要求17的方法，其中，所述脊椎动物在所述施用步骤之前表达所述线性化内切核酸酶。
19.如权利要求17的方法，其中，所述方法还包括给所述脊椎动物施用所述内切核酸酶，或包括其编码序列的核酸。
20.如权利要求19的方法，其中，所述方法还包括给所述脊椎动物施用包括所述线性化内切核酸酶的编码序列的核酸。
21.如权利要求20的方法，其中，所述编码序列不存在于所述环状整合载体上。
22.如权利要求20的方法，其中，所述编码序列存在于所述环状整合载体上。
23.如权利要求17的方法，其中，所述脊椎动物是哺乳动物。
24.如权利要求17的方法，其中，所述整合载体是通过血管内途径施用的。
25.一种环状核酸整合载体，包括(a)能够被重组酶切割的单个重组酶识别位点；和(b)同源重组整合因子，它包括外源核酸，其侧翼为提供同源重组的序列。
26.如权利要求25的载体，其中，所述重组酶是转座酶。
27.如权利要求25的载体，其中，所述转座酶是果蝇属P-因子转座酶。
28.如权利要求25的载体，其中，所述载体还包括所述重组酶的编码序列。
29.如权利要求28的载体，其中，所述编码序列不存在于所述整合因子上。
30.如权利要求25的载体，其中，所述整合因子包括表达盒。
31.一种用于将外源核酸同源重组到多细胞生物的靶细胞基因组中的系统，所述系统包括(a)导向载体，包括(i)能够被重组酶切割的单个重组酶识别位点；和(ii)整合因子，它包括外源核酸，其侧翼为提供同源重组的序列；和(b)所述重组酶或包括其编码序列的核酸。
32.如权利要求31的系统，其中，所述系统包括所述重组酶。
33.如权利要求31的系统，其中，所述系统包括编码所述重组酶的核酸。
34.如权利要求33的系统，其中，所述核酸存在于所述导向载体上。
35.如权利要求33的系统，其中，所述核酸存在于独立于所述导向载体的载体上。
36.一种用于将外源核酸同源重组到多细胞生物的靶细胞基因组中的试剂盒，所述试剂盒包括(a)导向载体，包括(i)能够被重组酶切割的重组酶识别位点；和(ii)同源重组整合因子，它包括外源核酸，其侧翼为提供同源重组的序列；和(b)所述重组酶或包括其编码序列的核酸。
37.如权利要求36的试剂盒，其中，所述试剂盒包括所述重组酶。
38.如权利要求36的试剂盒，其中，所述试剂盒包括编码所述重组酶的核酸。
39.如权利要求38的试剂盒，其中，所述存在于所述导向载体上。
40.如权利要求38的试剂盒，其中，所述核酸存在于独立于所述导向载体的载体上。
全文摘要
提供了用于将外源核酸同源重组到诸如动物的多细胞生物的靶细胞基因组中的方法。在本发明方法中，让包括线性化内切核酸酶位点，例如，重组酶识别位点，和同源重组整合因子的导向载体与多核细胞生物接触，例如，通过系统性或局部施用，以便所述多细胞生物的靶细胞摄取所述导向载体。所述导向载体是在同源重组事件之前，例如，在与所述多细胞生物接触之前或之后通过诸如重组酶的线性化内切核酸酶在某些点上线性化的载体。在被所述靶细胞摄取之后，所述整合因子通过同源重组从所述线性化导向载体进入所述靶细胞基因组。还提供了用于实施本发明方法的导向载体，系统和试剂盒。
文档编号C12N15/87GK1774506SQ03815573
公开日2006年5月17日 申请日期2003年4月29日 优先权日2002年4月30日
发明者P·福加蒂 申请人:托斯克公司