一种提高基因编辑后绵羊胚胎成纤维细胞同源重组修复频率的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，尤其设及一种提高基因编辑后绵羊胚胎成纤维细胞同 源重组修复频率的方法。
【背景技术】
[0002] 利用人工核酸内切酶化ngineered endonuclease,EEN)，如锋指酶（Zinc finger nucleases，ZFNs)、类转录激活因子效应物核酸酶（Transcription activator-l ike effector nucleases,TALENs)和CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palin化omic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated 9(Cas9))，定点切割基因组，产生特 定位点基因组双链断裂化ouble-strand brakes,DSBs)或缺克(化cks)，促进精确编辑哺乳 动物基因组的研究。
[0003] 细胞主要通过非同源末端连接途径(Non-homologous end joining,NHEJ)修复 DSBs，产生基因敲除表型。共同转染EEN和单链寡核巧酸，或同源序列的供体模板，通过依赖 同源模板修复途径，如微同源臂介导连接(Microhomology-mediated end joining,MMEJ) 和同源重组化omologous recombination,皿），精确地将外源目的基因敲入细胞基因组，实 现基因编辑。即使采用高效的CRISPR/tas9系统产生基因组的DSBs，细胞选择NHEJ修复事件 的发生概率超过90%，利用同源模板的修复概率低于10%。说明多数细胞中，NHEJ远远超过 依赖同源模板修复事件的发生概率。
[0004] 抑制NHEJ途径，促使细胞采用皿修复途径，能够提高皿修复频率。用邸N定点断裂 果蛹细胞基因组，RNA干扰(RNA inMbite，RNAi)瞬时抑制Lig4基因 （DNA Ligase 4，Lig4) 翻译，PCR扩增短的左右同源臂(80和60nt)供体模板，在药物筛选的细胞中，同源重组效率 达50%。邸N处理Lig4-/-突变体的果蛹胚胎、拟南芥，与野生型比较，同源重组效率显著提 高。调控抑制线虫(化enorhabditis elegans)体细胞中的Lig4蛋白因子，从而抑制NHEJ，使 有机体修复DSBs途径转向MMEjDBmku70蛋白是NHEJ的必须因子，敲除Bmku70基因的家蚕胚 胎，显微注射CRISPR/Cas9系统质粒和供体模板，与野生型家蚕胚胎比较，皿效率更高。SCR7 (5,6-bis(benzylideneamino)-2-mercapt〇-pyrimidin-4-〇l)特异性同人类 Li 邑 4 蛋白的 DNA结合域化NA binding domain，D抓)结合，阻断了Lig4与DNA结合，抑制畑EJ修复途径，提 高HR修复频率4-5倍。
[0005] Lig4敲除的果蛹能够正常生存，但小鼠 Lig4基因敲除表现为胚胎致死，至今对哺 乳动物Lig4基因敲除的研究较少。哺乳动物细胞修复DSBs的3条主要途径:畑EJ、MMEJ和皿， 呈现互补竞争关系，抑制NHEJ将刺激细胞选用HR修复途径。
[0006] Gorbunova实验室定量研究N肥J和皿修复途径，获得细胞老龄化状态不同，对基因 组DSBs修复结果不同；人类体细胞修复DSBs，主要采用NHEJ途径，而且在细胞周期各个阶段 都可W使用NHEJ;HR修复主要发生在S期。
[0007] 基因打祀技术W同源重组为基础，是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手 段，促进了生物学研究。正常哺乳动物细胞发生同源重组概率极低，造成基因打祀效率极低 (1〇-6)。
【发明内容】
[0008] 本发明的一个目的是提供抑制Lig4基因表达和/或活性的物质的用途。
[0009] 本发明提供了抑制Lig4基因表达和/或活性的物质在制备促进离体绵羊胚胎成纤 维细胞在基因编辑时进行同源重组修复产品中的应用。
[0010] 上述应用中，所述基因编辑为将经过特定位点剪切后外源DNA分子导入离体绵羊 胚胎成纤维细胞中，使所述剪切后外源DNA分子在细胞中进行同源重组修复；
[0011] 或所述基因编辑为将外源DNA分子同源重组到经过特定位点剪切后的离体绵羊胚 胎成纤维细胞基因组上。
[0012] 所述特定位点剪切是通过I-Scel酶切实现。
[0013] 上述应用中，所述抑制Lig4基因表达的物质为用于干扰离体绵羊胚胎成纤维细胞 中Lig4基因表达的siRNA。
[0014] 上述应用中，所述siRNA的核巧酸序列为序列表中序列3或序列4。
[0015] 本发明另一个目的是一种使离体绵羊胚胎成纤维细胞在基因编辑时进行同源重 组修复频率提高的方法。
[0016] 本发明提供的方法，包括如下步骤:抑制进行基因编辑的离体绵羊胚胎成纤维细 胞中Lig4基因表达，实现离体绵羊胚胎成纤维细胞在基因编辑时进行同源重组修复频率提 局。
[0017] 上述方法中，所述抑制进行基因编辑的离体绵羊胚胎成纤维细胞中Lig4基因表达 为将用于抑制离体绵羊胚胎成纤维细胞中Lig4基因表达的物质导入所述进行基因编辑的 离体绵羊胚胎成纤维细胞中。
[0018] 上述方法中，所述基因编辑为将经过特定位点剪切后外源DNA分子导入离体绵羊 胚胎成纤维细胞中，使所述剪切后外源DNA分子在细胞中进行同源重组修复；
[0019] 或所述基因编辑为将外源DNA分子同源重组到经过特定位点剪切后的离体绵羊胚 胎成纤维细胞基因组上。
[0020] 上述方法中，所述抑制离体绵羊胚胎成纤维细胞中Lig4基因表达的物质为用于干 扰离体绵羊胚胎成纤维细胞中Lig4基因表达的siRNA;
[0021 ]所述siRNA的核巧酸序列具体为序列表中序列3或序列4。
[0022] 上述方法中，所述使离体绵羊胚胎成纤维细胞在基因编辑时进行同源重组修复频 率提高为抑制进行基因编辑的离体绵羊胚胎成纤维细胞中Lig4基因表达的细胞同源重组 修复频率高于进行基因编辑的离体绵羊胚胎成纤维细胞的同源重组修复频率。
[0023] 上述外源DNA分子为HR质粒。
[0024] 本发明的实验证明，本发明筛选到抑制绵羊Lig4基因表达的SiRNA，通过SiRNA抑 制绵羊Lig4基因表达，抑制绵羊胚胎成纤维细胞的NHEJ修复途径从而刺激细胞内HR修复途 径，提高了细胞采用HR修复的频率，为提高绵羊胚胎成纤维细胞基因打祀效率和研究绵羊 基因组精确编辑提供基础。
【附图说明】
[0025] 图1为针对绵羊Lig4基因设计的siRNA位点示意图。
[0026] 图2为分析HR修复途径的报告基因结构(a)和断裂DNA粘性末端(b)图。
[0027] 图3为绵羊Lig4基因 CDS序列PCR扩增结果。
[0028] 图 4 为pMD18T-aiLig4 菌体 PCR 检测。
[0029] 图5为SiRNA影响绵羊Lig4基因表达的实时巧光定量PCR结果。
[0030] 图6为SiRNA干扰绵羊Lig4基因表达的Western blot图。
[0031 ]图7为HR修复载体重连巧光成像结果。
[0032] 图8为HR修复载体重连流式细胞仪检测结果。
【具体实施方式】
[0033] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0034] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0035] Lig4基因的核巧酸序列为序列1，编码蛋白的氨基酸序列为序列2。
[0036] 部分材料如下：pcDNA3. 1 +载体（Invitrogen)，pMD18-T(TaKaRa)，HR 质粒 Gorbunova实验室惠赠，pDsRed2-Nl (Clontech)，pEGFP-Nl (Clontech)，stbl3菌种 (Invihogen)，电转仪(Amax NucleofectorH )，流式细胞仪(BDFACSAria虹），绵羊胚胎成 纤维细胞由本实验室原代培养保存。
[0037] 部分试剂如下：RealBand 10KB(0.25-10化）DNA Ladder(Cat N0.B600031-0500) 上海生工；DL 2000DNA MarkeHCat N0.3427A，TaKaRa)〇Taq DNA Polymerase(Cat NO.ETlOl-02)，小量质粒提取试剂盒（Cat N0.DP103-02,天根生化科技有限公司）。 PrimerSTAR DNA 化lymerase(Cat N0.R045，Takara)，胶回收试剂盒（Cat N0.D2500-02， OMEGA);限制性内切酶(Thermo Fisher) ;Lig4 单克隆抗体（（Cat NO.GTX100100，GeneTex); EasyScript All-in-one First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(Cat N0.AT314北京全式金生物技术有限公司）；实时巧光定量PCR试剂盒(Cat N0.B639271，上海 生工)。
[0038] TrizoHCat NO. 15596-026，Invitrogen);哺乳动物蛋白抽提试剂（Cat N0.CW0889)、BCA蛋白定量试剂盒（Cat N0.CW0014)、蛋白酶抑制剂混合物（Cat N0.CW2200)、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(Cat N0.CW0022)、速泳SDS-PAGE电泳缓冲液（10 X ) (Cat N0.CW2566)、蛋白示踪上样缓冲液（5X)(Cat N0.CW0027A)、山羊抗兔IgG 皿P(Cat N0.CW0103)、抗GAPDH兔多克隆抗体（Cat N0.CW0101)、Western Blot封闭液I(BSA)(Cat 顯.〔￥0054)、￥63*6脚抗体稀释液（〔日*顯.〔￥2340)、高灵敏度化学发光检测试剂盒（〔曰* NO. CW0049B)、蛋白印迹膜再生液（Cat NO. CW0056A)购自康为世纪；15-150kDa双色预染蛋 白Marker(化t NO.C610011)购自上海生工;耗材购自上海生工。
[0039] 实验室用DEPC处理的水配制电转液。Solutionl(10ml):2g ATP-Na2，1.2g MgCb* 6此0;5〇1111:;[0]111 (5001111):6邑1(出口04,