直用型高保真pcr扩增混合试剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体设及一种直用型高保真PCR扩增混合试剂。
【背景技术】
[0002] 聚合酶链式反应（Polymerase化ain Reaction，PCR)是一种用于扩增特定的DNA 片段的分子生物学技术，在某种程度上是一种生物体外的特殊DNA复制过程。PCR技术的最 大特点是利用微量的DNA模板实现其大量富集。该技术于1983年，由美国Mullis首先提出设 想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。至今 为止，PCR已发展到第四代技术。
[0003] PCR是利用DNA分子在95 °C左右高溫时变性会变成单链，在60°C左右低溫时引物与 单链按碱基互补配对原则结合，再调溫度至DNA聚合酶最适反应溫度(72°C左右），DNA聚合 酶沿着憐酸到五碳糖(5'-3'）的方向合成互补链，来实现DNA分子的体外扩增。根据W上原 理，常规PCR过程一般分为变性(95°C)、退火(60°C)、延伸(72°C)3个阶段。随着分子生物学 技术的不断进步，PCR技术也不断趋于完善，被利用到生物学、食品科学W及医学等各个领 域，并且随之发展出各种具有针对性功能的PCR扩增试剂。
[0004] 目前市售的PCR扩增试剂主要分为两类:一类是分步加样型试剂，即除了特异性模 板和引物外，其余PCR扩增反应组分独立包装，在使用分别加样混合;另一类是预混型试剂， 也称为直用型或即用型试剂，即除了特异性模板和引物外，将其余PCR扩增反应组分或其中 的一部分混合保存，减少加样步骤。运两类PCR扩增试剂的成分W及混合方式如下表所示：
[0005]
[0007] -个完整的PCR扩增体系需要键入近十种反应组分，在面对大批量的实验方案时， 分步加样型的PCR扩增试剂在实际使用中大大增加了加样次数，同时也增加了交叉污染的 发生概率。通常使用的PCR扩增体系为10化、2扣L或50化等微量体系，DNA聚合酶等试剂的加 入量也通常只有几微升，在运种微量体系中，上述分步加样型的PC时式剂在使用时也就容易 出现因取样不准而导致的重复性差甚至是PCR扩增失败等问题。
[0008] 为了克服分步加样型的PCR扩增试剂在使用过程中的缺陷，发展出了直用型PCR扩 增试剂。然而目前多数市售直用型PCR扩增试剂W化q DNA聚合酶酶作为聚合酶，保真度约 为10-5左右，少数利用Pfu DNA聚合酶制备的直用型扩增试剂的保真度能够达到10-6左右。 为了提高聚合酶的保真度，研究人员或生产厂家开始尝试在PCR扩增试剂中加入一些添加 剂，运些添加剂虽然能够一定程度上提高聚合酶的保真度，但也一定程度地影响了聚合酶 的活性和稳定性，导致目前市售直用型PCR扩增试剂由于添加成分不均衡，整个体系稳定性 差，抗冻融能力相对较弱，数次冻融后聚合酶催化活力和保真度明显降低。并且保存期限较 短，室溫下的保存期限为一到两周左右，4°C下的保存期限也仅为一个月左右。无法满足实 际应用中对PCR扩增试剂兼具保真度、稳定性W及便捷性的需求。
[0009] 综上所述，开发出一种相对稳定的直用型高保真PCR扩增混合试剂，包含除了特异 性模板和引物之外的其余PCR组分，在简化了实验流程的同时，兼具高保真度和高稳定性， 是PCR扩增试剂的研发与应用中的重要问题。
【发明内容】
[0010] 术语；
[0011] 除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的 普通技术人员通常理解的相同意义。
[001^ 本发明中的术语"dNTPs"指dATP、dGTP、dTTP和dCTP四种单脱氧核糖核巧酸的混合 物;术语"d地20"指双蒸水;术语"化i s-HCr指Ξ径甲基氨基甲烧盐酸盐；术语"DMS炉指二 甲基亚讽;术语"BSA"牛血清白蛋白；本发明中的术语"2X"指该溶液中各组分的浓度为其 工作浓度的2倍;术语"IX"指该溶液中各组分的浓度为其工作浓度。
[0013] 本发明要解决的一个问题是提供一种兼具高保真度、高稳定性和使用便捷性的 PCR扩增混合试剂。
[0014] 为解决上述问题，本发明采取的技术方案是，一种直用型高保真PCR扩增混合试剂 2 X P化PCR Mix，所述直用型高保真PCR扩增混合试剂包括:DNA聚合酶、KC1、化iS-HC1、 MgS〇4、（NH4)2S〇4、dNTPs 和甘油，溶剂为 d 地 2〇。
[0015] 上述PCR扩增混合试剂中，DNA聚合酶为极端嗜热性细菌Pyrococcus化riosus来 源的重组型Pfu DNA聚合酶，分子量为90KD。押U DNA聚合酶的浓度为0.1~0.抓AiL，优选为 0.15~0.2抓/μL^;进一步优选为0.2υ/μΙ
[0016] 上述PCR扩增混合试剂中，KC1的浓度为10~30mM;优选为15~25mM;进一步优选为 20mM。
[0017] 上述PCR扩增混合试剂中，Tris-HCl的浓度为30~60mM;优选为35~50mM;进一步 优选为40mM。
[0018] 上述PCR扩增混合试剂中，MgS化的浓度为2~6mM;优选为3~5mM;进一步优选为 4mM〇
[0019] 上述PCR扩增混合试剂中，（NH4)2S化的浓度为25~40mM;优选为30~35mM;进一步 优选为32mM。
[0020] 上述PCR扩增混合试剂中，dNTPs的浓度为300~500μΜ;优选为350~450μΜ;进一步 优选为400μΜ。
[0021] 上述PCR扩增混合试剂中，甘油的体积浓度为6~15% ;优选为8~12% ;进一步优 选为10%。如未另行指出，本文中设及的甘油浓度均为体积浓度。
[0022] 在某些优选的实施方案中，所述的直用型高保真PCR扩增混合试剂中还包括优化 剂，所述的优化剂为DMS0、四亚甲基亚讽、径脯氨酸、海藻糖、乙二醇和BSA中的一种或多种。
[0023] 所述的DMS0的体积浓度为1~4%;优选为1.5~3%;进一步优选为2%。如未另行 指出，本文中设及的甘油浓度均为体积浓度。
[0024] 所述的四亚甲基亚讽的浓度为20~60mM;优选为30~50mM;进一步优选为40mM。
[00巧]所述的径脯氨酸的浓度为3~8mM;优选为4~7mM;进一步优选为5.5mM。
[0026] 所述的海藻糖的浓度为50~80mM;优选为60~75mM;进一步优选为70mM。
[0027] 所述的乙二醇的体积浓度为6~10% ;优选为7~9% ;进一步优选为8%。如未另行 指出，本文中设及的甘油浓度均为体积浓度。
[002引所述的BSA的浓度为4~祉g/mL优选为5~化旨/1^;进一步化g/mL。
[0029] 本发明要解决的另一个问题是提供上述直用型高保真PCR扩增混合试剂的使用方 法:使用时，按照所需扩增体积的50 %量取该扩增混合试剂，加入扩增模板和引物后，使用 dd出0补足至所需扩增体积，即可进行PCR扩增。
[0030] 所述的直用型高保真PCR扩增混合试剂在用于PCR扩增时，模板种类可W为基因组 DNA、质粒或隧菌体DNA，但并不局限于上述种类的模板。当W基因组DNA作为模板时，扩增反 应体系中比较适宜的模板浓度为1~1〇4旨/1^;当^质粒或隧菌体DNA作为模板时，扩增反应 体系中比较适宜的模板浓度为0.1~化g/mL
[0031] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0032] 1.本发明提供的直用型高保真PCR扩增混合试剂2XPfu PCR Mix的保真度高。目 前市售PCR预混液中多采用化q DNA聚合酶，其保真度为1〇-5左右，少数利用P化DNA聚合酶 制备的PCR预混液保真度为10-6左右。本发明提供的直用型高保真PCR扩增混合试剂的保真 度达到2.3 X 10-7~3.9 X 10-7;扩增长度为2肺的片段，没有出现突变碱基。
[0033] 2.本发明提供的直用型高保真PCR扩增混合试剂为2Χ的浓缩试剂，其中含有Pfu DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液等除模板和引物W外的扩增必需组分。使用时，仅需在扩增体系 中加入模板和引物即可进行PCR，大大简化了操作流程，缩短了操作时间，降低了交叉污染 的风险，最大限度地减少人为误差。可于Imin内建立反应体系，能够快速完成大批量样品 PCR反应体系的建立。
[0034] 3.本发明提供的直用型高保真PCR扩增混合试剂选用的Pfu DNA聚合酶具有比化q DNA聚合酶更高的耐热活性，且P化DM聚合酶是目前已发现的所有耐高溫DNA聚合酶中出 错率最低的，该酶该酶具有5 ' ^3 '聚合酶活性和3 ' ^5 '外切酶活性。在PCR反应中，P化DNA 聚合酶延伸速度为0.5-1化/分钟，产物3 '端为平端，可用于平端载体克隆。
[0035] 4.本发明提供的直用型高保真PC