基于磁珠法的高效血浆细胞游离dna提取方法
基于磁珠法的高效血浆细胞游离dna提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种基于磁珠法的高效血浆细胞游离DNA的提取方法，属于生物技术 领域。
【背景技术】
[0002] 血浆是血液除去血细胞和血小板外的液体组分，约占全血体积的50-60 %。通过抗 凝采血管采集血液，离屯、后收集到的上层淡黄色液体即为血浆。研究表明，在血浆中除了水 分、血浆蛋白、氨基酸、糖类和无机盐等化学成分外，还存在游离于细胞之外的脱氧核糖核 酸分子，称为血浆细胞游离DNA。近年来，血浆细胞游离DNA在医学诊断中的应用不断拓展， 其广泛应用于无创产前筛查、肿瘤液体活检和肿瘤个体化用药指导等领域。
[0003] 提取高质量的血浆细胞游离DNA是对其进行深入研究和进行医学诊断的基本前 提。血浆细胞游离DNA由于其片段短(几十到几百bp不等）、丰度低（正常人体血浆中每毫升 含量为几纳克至几十纳克）的特点，其提取难度大于体细胞的基因组DNA。在实际应用中，为 了避免DNA片段信息的丢失，对于血浆细胞游离DNA的提取有着高效提取、避免损失的要求。 目前用于提取血浆细胞游离DNA的方法主要有离屯、柱法和磁珠法两大类，但是在实际应用 中均存在提取效率偏低、部分DNA片段易丢失、批次操作效果不均一的问题，运对于血浆细 胞游离DNA的研究应用造成了不利影响。
【发明内容】
[0004] 本发明公开了一种基于磁珠法的高效血浆细胞游离DNA的提取方法，该方法能高 效、快速地获得高质量的细胞游离DNA，可W满足PCR扩增、定量和定性分析、测序等分子生 物学实验的要求。
[0005] 为实现本发明的目的，本发明采用的技术方案是：
[0006] -种基于磁珠法的高效血浆细胞游离DNA提取方法，具体包括如下步骤：
[0007] (1)预处理，取血浆样品置于离屯、管中，加入预处理液P，在50-60°C水浴中保存 0.5-化，预处理液P: 0.5-3% (w/v)蛋白酶K，l-3mM氯化巧。由于血浆细胞游离DNA能与蛋白 形成复合物，因此通过预处理降解血浆蛋白，有助于提高血浆细胞游离DNA的捕获效率和实 验结果一致性。
[000引（2)配置结合液B，在两步溫控条件下采用径基磁珠特异性吸附样品中的DNA，具体 地，向经过预处理的样品中加入结合液B;縱满振荡15-30S;在50-60°C水浴中反应3-5min; 从水浴中取出离屯、管，縱满振荡15-30S;使用旋转混合仪，在室溫条件下反应5-lOmin;计时 结束后，在3000-4000g条件下离屯、30-60S，将离屯、管放在磁力架上，静置l-2min进行磁珠分 离，计时结束后用移液器除去上清，保留磁珠。上述用到的结合液Β:92-98%(v/v)异丙醇， 1-3% (v/v)非极性溶剂，1-5% (v/v)磁珠悬浮液，其中，磁珠悬浮液为20% (w/v)纳米磁珠， 非极性溶剂为石油酸、正己烧、四氯化碳、苯中的一种或多种混合，添加非极性溶剂的目的 是增加溶液环境的非极性，促进核酸分子被纳米磁珠吸附。
[0009] (3)洗涂，配置洗涂液W1和W2对吸附有DM的磁珠进行清洗，具体地，首先盐洗涂去 除杂质，向完成吸附、去除上清、留有磁珠的离屯、管中加入洗涂液W1，縱满振荡2-3min;静置 l-2min后在3000-4000g条件下离屯、30-60S，将离屯、管放在磁力架上，静置l-2min进行磁珠 分离，计时结束后用移液器除去上清，保留磁珠;然后进行醇洗涂去除盐分，向完成吸附、去 除上清、留有磁珠的离屯、管中加入洗涂液W2，縱满振荡2-3min;静置l-2min后在3000-4000g 条件下离屯、30-60S，将离屯、管放在磁力架上，静置l-2min进行磁珠分离，计时结束后用移液 器除去上清，保留磁珠，敞开管口室溫放置lOminW便乙醇挥发，洗涂液Wl:5-20mM^径甲基 氨基甲烧，l-5mM乙二胺四乙酸，60-75% (v/v)乙醇;洗涂液W2:70-80% (v/v)乙醇。
[0010] (4)加入洗脱液T，在物理强化作用下辅助洗脱，经过充分混合洗脱后，进行磁珠分 离，然后用移液器吸取上清液体，此液体即为提取的血浆细胞游离DNA，所述的物理强化作 用为縱满震荡、超声波、高溫中的一种或多种组合，其中，洗脱液T:8-10mMS径甲基氨基甲 烧，抑= 8.0。物理强化作用可W增加分子运动，促进核酸分子从纳米磁珠上的解吸。具体 地，向完成第二步洗涂、去除上清、留有磁珠的离屯、管中加入洗脱液T，将离屯、管縱满振荡1- 2min后置于盛有冰水的烧杯中，将烧杯放入超声清洗机反应15-30S，取出离屯、管，在50-60 °C水浴中保存2-3min;再次将离屯、管置于盛有冰水的烧杯中，将烧杯放入超声清洗机反应 15-30S，取出离屯、管，室溫放置5-lOmin;计时结束后，将离屯、管放在磁力架上，静置l-2min 进行磁珠分离，计时结束后用移液器吸取上清液体，此液体即为提取的血浆细胞游离DM。
[0011] 进一步地，步骤（2)中所使用的径基磁珠为径基修饰的超顺磁纳米磁珠，粒径为 300-1000ηπι。
[0012] 本发明在预处理过程中，为保证縱满振荡混匀的效果，所提取的血浆样品量不得 超过所使用离屯、管最大装液量的2/15。一般小量提取20化1血浆样品时，使用1.5ml离屯、管； 大量提取2ml血浆时，使用15ml离屯、管。
[0013] 作为优选的，本发明在预处理过程中，预处理液P的用量为血浆样品量的1/10~1/ 5。
[0014] 本发明在吸附过程中，结合液B的用量为血浆样品量的3~4倍。
[0015] 本发明在洗涂过程中，洗涂液W1的用量为血浆样品量的4~5倍，洗涂液W2的用量 为血浆样品量的4~5倍。
[0016] 本发明在洗脱过程中，洗脱液T的用量不少于20μ1，Κ保证洗脱效率，所使用的超 声清洗仪的工作频率为35000-40000ΗΖ，工作功率为500-600W。
[0017]有益效果
[0018] 1.本发明在结合液Β中添加非极性组分，促进核酸分子被纳米磁珠的吸附，在两步 溫控吸附条件下，可W提升DNA的提取效率；
[0019] 2.使用物理强化作用促进核酸分子从纳米磁珠上的解吸，增加洗脱效率。由于血 浆细胞游离DNA的片段长度短(几十到几百bp)，因此物理强化作用对于DNA长片段的剪切破 坏甚微，不影响所提取DNA的质量。
【附图说明】
[0020] 图1为利用本方法提取的血浆细胞游离DNA产物经PCR后的凝胶电泳图。
[0021] 图中：泳道1为使用体细胞基因组为模板的阳性对照，泳道2-4为Ξ平行实验的扩 增产物，泳道5为TAKARA D2000DNA marker，泳道6为用无菌水为模板的阴性对照。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
[0023] 实施例1 一种基于磁珠法的高效血浆细胞游离DNA的提取方法，其特征是，具体步骤如下：
[0024] (1)预处理
[0025] 设置Ξ平行实验。取20化1来自健康人的新鲜血浆样品置于离屯、管中，加入20μ1预 处理液Ρ，在50°C水浴中保存0.化；
[0026] (2)吸附
[0027] 向经过预处理的样品中加入800μ1结合液B;縱满振荡30s;在50°C水浴中反应 5min;从水浴中取出离屯、管，縱满振荡15s;使用旋转混合仪，在室溫条件下反应lOmin;计时 结束后，在4000g条件下离屯、30s，将离屯、管放在磁力架上，静置2min进行磁珠分离，计时结 束后用移液器除去上清，保留磁珠；
[002引（3)洗涂
[0029] 第一步盐洗涂去除杂质。向完成吸附、去除上清、留有磁珠的离屯、管中加入ΙΟΟΟμΙ 洗涂液W1，縱满振荡3min;静置2min后在4000g条件下离屯、30s，将离屯、管放在磁力架上，静 置2min进行磁珠分离，计时结束后用移液器除去上清，保留磁珠；
[0030] 第二步醇洗涂去除盐分。向完成吸附、去除上清、留有磁珠的离屯、管中加入ΙΟΟΟμΙ 洗涂液W2，縱满振荡3min;静置2min后在4000g条件下离屯、30s，将离屯、管放在磁力架上，静 置2min进行磁珠分离，计时结束后用移液器除去上清，保留磁
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种基于磁珠法的高效血浆细胞游离DNA的提取方法，属于生物技术 领域。
【背景技术】
[0002] 血浆是血液除去血细胞和血小板外的液体组分，约占全血体积的50-60 %。通过抗 凝采血管采集血液，离屯、后收集到的上层淡黄色液体即为血浆。研究表明，在血浆中除了水 分、血浆蛋白、氨基酸、糖类和无机盐等化学成分外，还存在游离于细胞之外的脱氧核糖核 酸分子，称为血浆细胞游离DNA。近年来，血浆细胞游离DNA在医学诊断中的应用不断拓展， 其广泛应用于无创产前筛查、肿瘤液体活检和肿瘤个体化用药指导等领域。
[0003] 提取高质量的血浆细胞游离DNA是对其进行深入研究和进行医学诊断的基本前 提。血浆细胞游离DNA由于其片段短(几十到几百bp不等）、丰度低（正常人体血浆中每毫升 含量为几纳克至几十纳克）的特点，其提取难度大于体细胞的基因组DNA。在实际应用中，为 了避免DNA片段信息的丢失，对于血浆细胞游离DNA的提取有着高效提取、避免损失的要求。 目前用于提取血浆细胞游离DNA的方法主要有离屯、柱法和磁珠法两大类，但是在实际应用 中均存在提取效率偏低、部分DNA片段易丢失、批次操作效果不均一的问题，运对于血浆细 胞游离DNA的研究应用造成了不利影响。
【发明内容】
[0004] 本发明公开了一种基于磁珠法的高效血浆细胞游离DNA的提取方法，该方法能高 效、快速地获得高质量的细胞游离DNA，可W满足PCR扩增、定量和定性分析、测序等分子生 物学实验的要求。
[0005] 为实现本发明的目的，本发明采用的技术方案是：
[0006] -种基于磁珠法的高效血浆细胞游离DNA提取方法，具体包括如下步骤：
[0007] (1)预处理，取血浆样品置于离屯、管中，加入预处理液P，在50-60°C水浴中保存 0.5-化，预处理液P: 0.5-3% (w/v)蛋白酶K，l-3mM氯化巧。由于血浆细胞游离DNA能与蛋白 形成复合物，因此通过预处理降解血浆蛋白，有助于提高血浆细胞游离DNA的捕获效率和实 验结果一致性。
[000引（2)配置结合液B，在两步溫控条件下采用径基磁珠特异性吸附样品中的DNA，具体 地，向经过预处理的样品中加入结合液B;縱满振荡15-30S;在50-60°C水浴中反应3-5min; 从水浴中取出离屯、管，縱满振荡15-30S;使用旋转混合仪，在室溫条件下反应5-lOmin;计时 结束后，在3000-4000g条件下离屯、30-60S，将离屯、管放在磁力架上，静置l-2min进行磁珠分 离，计时结束后用移液器除去上清，保留磁珠。上述用到的结合液Β:92-98%(v/v)异丙醇， 1-3% (v/v)非极性溶剂，1-5% (v/v)磁珠悬浮液，其中，磁珠悬浮液为20% (w/v)纳米磁珠， 非极性溶剂为石油酸、正己烧、四氯化碳、苯中的一种或多种混合，添加非极性溶剂的目的 是增加溶液环境的非极性，促进核酸分子被纳米磁珠吸附。
[0009] (3)洗涂，配置洗涂液W1和W2对吸附有DM的磁珠进行清洗，具体地，首先盐洗涂去 除杂质，向完成吸附、去除上清、留有磁珠的离屯、管中加入洗涂液W1，縱满振荡2-3min;静置 l-2min后在3000-4000g条件下离屯、30-60S，将离屯、管放在磁力架上，静置l-2min进行磁珠 分离，计时结束后用移液器除去上清，保留磁珠;然后进行醇洗涂去除盐分，向完成吸附、去 除上清、留有磁珠的离屯、管中加入洗涂液W2，縱满振荡2-3min;静置l-2min后在3000-4000g 条件下离屯、30-60S，将离屯、管放在磁力架上，静置l-2min进行磁珠分离，计时结束后用移液 器除去上清，保留磁珠，敞开管口室溫放置lOminW便乙醇挥发，洗涂液Wl:5-20mM^径甲基 氨基甲烧，l-5mM乙二胺四乙酸，60-75% (v/v)乙醇;洗涂液W2:70-80% (v/v)乙醇。
[0010] (4)加入洗脱液T，在物理强化作用下辅助洗脱，经过充分混合洗脱后，进行磁珠分 离，然后用移液器吸取上清液体，此液体即为提取的血浆细胞游离DNA，所述的物理强化作 用为縱满震荡、超声波、高溫中的一种或多种组合，其中，洗脱液T:8-10mMS径甲基氨基甲 烧，抑= 8.0。物理强化作用可W增加分子运动，促进核酸分子从纳米磁珠上的解吸。具体 地，向完成第二步洗涂、去除上清、留有磁珠的离屯、管中加入洗脱液T，将离屯、管縱满振荡1- 2min后置于盛有冰水的烧杯中，将烧杯放入超声清洗机反应15-30S，取出离屯、管，在50-60 °C水浴中保存2-3min;再次将离屯、管置于盛有冰水的烧杯中，将烧杯放入超声清洗机反应 15-30S，取出离屯、管，室溫放置5-lOmin;计时结束后，将离屯、管放在磁力架上，静置l-2min 进行磁珠分离，计时结束后用移液器吸取上清液体，此液体即为提取的血浆细胞游离DM。
[0011] 进一步地，步骤（2)中所使用的径基磁珠为径基修饰的超顺磁纳米磁珠，粒径为 300-1000ηπι。
[0012] 本发明在预处理过程中，为保证縱满振荡混匀的效果，所提取的血浆样品量不得 超过所使用离屯、管最大装液量的2/15。一般小量提取20化1血浆样品时，使用1.5ml离屯、管； 大量提取2ml血浆时，使用15ml离屯、管。
[0013] 作为优选的，本发明在预处理过程中，预处理液P的用量为血浆样品量的1/10~1/ 5。
[0014] 本发明在吸附过程中，结合液B的用量为血浆样品量的3~4倍。
[0015] 本发明在洗涂过程中，洗涂液W1的用量为血浆样品量的4~5倍，洗涂液W2的用量 为血浆样品量的4~5倍。
[0016] 本发明在洗脱过程中，洗脱液T的用量不少于20μ1，Κ保证洗脱效率，所使用的超 声清洗仪的工作频率为35000-40000ΗΖ，工作功率为500-600W。
[0017]有益效果
[0018] 1.本发明在结合液Β中添加非极性组分，促进核酸分子被纳米磁珠的吸附，在两步 溫控吸附条件下，可W提升DNA的提取效率；
[0019] 2.使用物理强化作用促进核酸分子从纳米磁珠上的解吸，增加洗脱效率。由于血 浆细胞游离DNA的片段长度短(几十到几百bp)，因此物理强化作用对于DNA长片段的剪切破 坏甚微，不影响所提取DNA的质量。
【附图说明】
[0020] 图1为利用本方法提取的血浆细胞游离DNA产物经PCR后的凝胶电泳图。
[0021] 图中：泳道1为使用体细胞基因组为模板的阳性对照，泳道2-4为Ξ平行实验的扩 增产物，泳道5为TAKARA D2000DNA marker，泳道6为用无菌水为模板的阴性对照。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
[0023] 实施例1 一种基于磁珠法的高效血浆细胞游离DNA的提取方法，其特征是，具体步骤如下：
[0024] (1)预处理
[0025] 设置Ξ平行实验。取20化1来自健康人的新鲜血浆样品置于离屯、管中，加入20μ1预 处理液Ρ，在50°C水浴中保存0.化；
[0026] (2)吸附
[0027] 向经过预处理的样品中加入800μ1结合液B;縱满振荡30s;在50°C水浴中反应 5min;从水浴中取出离屯、管，縱满振荡15s;使用旋转混合仪，在室溫条件下反应lOmin;计时 结束后，在4000g条件下离屯、30s，将离屯、管放在磁力架上，静置2min进行磁珠分离，计时结 束后用移液器除去上清，保留磁珠；
[002引（3)洗涂
[0029] 第一步盐洗涂去除杂质。向完成吸附、去除上清、留有磁珠的离屯、管中加入ΙΟΟΟμΙ 洗涂液W1，縱满振荡3min;静置2min后在4000g条件下离屯、30s，将离屯、管放在磁力架上，静 置2min进行磁珠分离，计时结束后用移液器除去上清，保留磁珠；
[0030] 第二步醇洗涂去除盐分。向完成吸附、去除上清、留有磁珠的离屯、管中加入ΙΟΟΟμΙ 洗涂液W2，縱满振荡3min;静置2min后在4000g条件下离屯、30s，将离屯、管放在磁力架上，静 置2min进行磁珠分离，计时结束后用移液器除去上清，保留磁
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0访客 来自[中国] 2020年05月08日 10:30依据与硅胶膜离心柱相同的原理 ，运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。BIOG磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。利用氧化硅纳米微球的超顺磁性，在Chaotropic盐和外加磁场的作用下，能从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中分离出DNA和RNA。
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