对血浆游离dna进行多目标位点扩增建库的方法

对血浆游离dna进行多目标位点扩增建库的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学，医学领域，尤其涉及一种针对血浆游离DNA或短片段（〈 300bp )DNA的多位点扩增文库的方法。
【背景技术】
[0002] 近年来发现人体的外周血血浆中存在游离的DNA片段，长度在100-300bp，主要集 中在150bp附近。在肿瘤病人中这些游离的DNA可能包括来自脱落和死亡的肿瘤细胞，在孕 妇体内可能包括胎儿的DNA片段。因而通过检测游离DNA片段中的特定位点的突变情况一定 程度上可以反映肿瘤或胎儿的特定位点的变异状况。但是血浆中的游离DNA片段较短，绝大 部分在150-200bp左右，一般不会超过300bp，而且含量很低。现有的游离血浆DNA提取方法 的提取率一般在lOng/ml血液，而lng游离人体DNA约含150-300份基因组拷贝，再加上血浆 游离DNA来源多样，还有大量正常细胞或母体来源的DNA，导致需要检测的突变DNA所占比例 很低。近来迅速发展的高通量测序技术通过对大量序列的高覆盖测序一定程度上可以计算 出这些突变所占的比例。但是现有的二代高通量测序技术都首先需要对DNA进行文库构建， 在两侧加上测序使用的接头，而且如果对所有的DNA片段进行测序则成本过高而且会导致 目标区段的覆盖层数大大降低。这就需要我们有一种方法能对低含量的短片段DNA进行建 库，并特异性的富集或扩增突变位点所在的区段，而且可以同时检测多个位点的文库构建 方法。目前已有的建库方法包括：1)首先对所有DNA片段进行建库，然后使用特异性捕获探 针捕获突变区段所在的文库片段（目前安捷伦的SureSelect Target Enrichment技术和罗 氏的NimbleGen方法都是这类技术的代表）；2)使用多重PCR方法进行扩增建库(如Life公司 的Ion Ampliseq和Illumina的TruSeq Amplicon就属于这类技术的代表）。其中特异性捕获 探针的方式对DNA起始量有一定的要求，而且过程需要进行杂交，周期较长(一般需要24小 时以上），成本较高，且存在较为一定的脱靶问题(捕获区段不是目标区段）。而现有的多重 PCR方法均使用双端特异性引物的方式，也存在许多问题，因为多重PCR需要设计特异性引 物，而一个位点至少需要设计一对特异性引物，同时要考虑多重PCR多个位点的引物之间的 干扰所以设计引物通常较长(通常30bp左右），且通常距离突变位点有一定距离。但是由于 片段较短，且突变位点可能位于片段末端，导致采用双端特异性引物实际能结合的部位过 短，导致大量(超过50%)的片段都无法有效的扩增，从而大大提高了对DNA起始量要求，甚 至无法有效建库。因而本领域仍需一种可适用于血浆游离DNA这种低当量(<10ng)短片段(〈 300bp)DNA的可对多位点快速扩增富集的建库方法。

【发明内容】

[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种对血浆游离DNA等短片段DNA进行多目标位 点扩增建库的方法，本发明鉴于现有多重PCR对于引物设计和DNA片段的缺陷，所提供的建 库方法不仅可以大幅降低引物设计和DNA起始量要求而且可以提高文库扩增效率。
[0004] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种对血浆游离DNA进行多目标位点扩增建 库的方法，依次包括以下步骤：
[0005] 1)、末端修复和加 A:
[0006] 从而获得末端加 A的DNA片段；
[0007] 2)、接头连接：
[0008] 包括在步骤1)所得的末端加 A的DNA片段中加入已退火形成环状发夹结构的接头 DNA，从而获得两侧结合上环状发夹接头后的双链DNA(简称加好接头的DNA);
[0009] 所述环状发夹结构的接头DNA由环状接头序列、两侧互补序列构建而成（还包括6 个碱基的随机序列）；
[0010]当步骤1)中提取纯化的血衆游离DNA的量< 10ng时，进行下述步骤3);
[0011] 反之，当步骤1)中提取纯化的血衆游离DNA的量>10ng时，直接进行下述步骤4);
[0012] 3 )、在步骤2)所得的加好接头的DNA中加入特异性引物I、Phi 29酶和缓冲液，在 36 · 8~37 · 2°C (较佳37°C)进行线性扩增0 · 5~3小时；
[0013] 4)、PCR 扩增：
[0014]在步骤2)所得的连接接头后的DNA中或步骤3)所得的经过扩增的DNA中加入特异 性引物II和通用引物以及带有index的测序接头引物P5和P7,进行14~30轮PCR循环扩增， 获得扩增产物，所述扩增产物构成所述游离DNA突变位点富集测序文库。
[0015] 备注:所有反应均在同一反应管中，无需进行转移和纯化。
[0016] 作为本发明的对血浆游离DNA进行多目标位点扩增建库的方法的改进：
[0017] 该方法还包括步骤5)的文库检测。
[0018] 作为本发明的对血浆游离DNA进行多目标位点扩增建库的方法的进一步改进：
[0019] 所述步骤1)为:使用NEB(New England Biolabs，纽英伦）的末端修复和加 A模块（ NEBNext? Ultra? II End Repair/dA-Tailing Module(E7546))对提取纯化的血衆游离 DNA进行末端修复和加 A，从而获得末端加 A的DNA片段。
[0020] 作为本发明的对血浆游离DNA进行多目标位点扩增建库的方法的进一步改进:所 述步骤2)为：
[0021] 在步骤1)所得的末端加 A的DNA片段中加入已退火形成环状发夹结构的接头DNA， 以及NEB快速连接模块[NEBNext? Ultra? II Ligation Module(E7595)]，最终获得两侧 结合上环状发夹接头后的双链DNA(简称加好接头的DNA)，其中包含的连接酶可对游离DNA 或福尔马林固定后的DNA片段的损伤进行修复。
[0022] 作为本发明的对血浆游离DNA进行多目标位点扩增建库的方法的进一步改进:所 述步骤4)为:步骤3)或步骤2)的所得物通过使用单侧特异性扩增引物结合另一侧的通用接 头引物进行特异性PCR并通过高通量测序比对后判断是否存在突变的方法。
[0023] 作为本发明的对血浆游离DNA进行多目标位点扩增建库的方法的进一步改进:环 状发卡接头序列为:ΡΗ0- CTACTTGCCTCGACATCCAGCGTGCGGACACATAACGCACTACATCATTCCGTACTCNNNNNNCGAGGCAAGTAGT。
[0024] 作为本发明的对血浆游离DNA进行多目标位点扩增建库的方法的进一步改进:特 异性引物I为特异性扩增引物l_EGFR_p. G598V、特异性扩增引物l_EGFR_p. D761Y、特异性扩 增引物l_KRAS_p.Q61K;
[0025] 对应的特异性引物II为特异性引物2_EGFR_p.G598V、特异性引物2_EGFR_ p · D761Y、特异性引物2_KRAS_p · Q61K。
[0026] 本发明的发明点主要体现为(不仅仅为如下）：
[0027] 1、步骤2)的环状接头序列以及两侧互补序列的构建方法；
[0028] 2、步骤3)的利用单链环状结构使用Phi29扩增酶以及特异性引物1序列，对原始 DNA样品进行线性环状预扩增。
[0029] 本发明具有如下技术优势：
[0030] 1)、只需单向特异性引物，从而解决血浆游离DNA片段短双侧引物设计的局限性， 同时可以检测位于DNA片段首尾处的靶位点。
[0031] 2)、引物设计简单，一个靶位点只需要用一条特异性引物II，避免双侧引物发生的 引物互补以及错配。
[0032] 3)、在环状发卡接头中加入了唯一的barcade，可以评估后续PCR效率，及时纠正 PCR循环数和后续数据分析。
[0033] 4)、相较于原有的捕获和简单多重PCR方法无论是特异性引物设计还是样品起始 量要求和实验操作以及成本都大幅降低。此外单链环化之后也可以进行特异性扩增，从而 使得对DNA的起始要求大大下降。
【附图说明】
[0034]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0035]图1为建库方法示意图；
[0036]图2为图不及引物序列；
[0037]图3为DNA检测结果；
[0038] 左侧为游离DNA提取检测结果，右侧为marker，最下方的为250bp，可见DNA均位于 250bp以下；
[0039] 图4为本方法建库后PCR产物的电泳结果；
[0040] 左侧为PCR完成后的文库产物，右侧为marker，最上方的条带为500bp，下方的2条 亮带为300和250bp;
[0041 ]图5为本方法和其他方法对比实验结果。
[0042] 从左至右分别为marker，PCR完成后的尿液样品文库产物，marker，以及建库完成 后的肿瘤福尔马林固定样品文库，marker中间亮条带为500bp，下方的亮带为300bp。
【具体实施方式】
[0043]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不 用于限定本发明。
[0044]本发明对血浆游离DNA进行多目标位点扩增建库方法的前置准备步骤：
[0045] 1、选取5ml血衆样品，使用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(Qiagen 55114)，根据试剂盒方法提取游离血浆DNA，最终获得lOOul洗脱体积约lOOng总量游离DNA 片段。为检测本发明对低当量DNA的建库效果，取上述DNA溶液10ul，加水40ul至50ul体积， DNA总量为10ng作为后续步骤样品。
[0046] 2、将合成的干粉状接头序列，加水溶解，升温至98°Clmin，自然降温到室温，退火 环状发卡接头序列，并使最终浓度为15uM。
[0047] 3、本实施例对EGFR基因的p.G598V和p.D761Y以及KRAS基因的p.Q61K三个突变位 点进行检测，合成引物见附表1。
[0048]实施例1、对血浆游离DNA进行多目标位点扩增建库方法，依次进行以下步骤：
[0049] 1)、末端修复和加 A
[0050] 按照下表1的配比准备反应混合液，用枪轻柔地上下吸吹混匀，使用NEBNext? Ultra? II End Repair/dA-Tailing Module(E7546)包括NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix和NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer两部分，起始游离DNA量的范 围在500pg-lug(例如为lOng)。
[0051] 表 1
[0052]
[0053] 放置于PCR仪中，设置程序反应：
[0054] 设置顶盖温度2 75°C
[0055] 20〇C30min
[0056] 65〇C30min