一种检测诊断离子通道病致病基因的dna文库及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种通过靶向高通量半导体测序技术检测诊断离子通道病致病基因 的DNA文库及其应用。具体说是根据离子通道病致病基因，设计能覆盖上述基因外显子及毗 邻区域的超多重PCR引物，并对样本基因组DNA进行超多重PCR扩增，扩增产物利用高通量测 序技术进行测序，寻找致病突变，明确离子通道病的遗传学病因，为临床诊断提供遗传学和 分子生物学的理论依据，属于生物医学领域临床检测技术中的基因检测技术。
【背景技术】
[0002] 离子通道是细胞膜和细胞器上一类特殊的亲水蛋白质，是人体细胞进行生物电活 动的物质基础，还参与激素分泌、感受器电位形成等多种生理活动。自1995年确定长QT综合 征与离子通道基因突变相关后，近20年来越来越多的心律失常(尤其是可致猝死的恶性心 律失常)被证实与心脏离子通道基因突变有关。离子通道病种类众多，几乎所有心脏的重要 离子通道(如钠离子通道、钾离子通道、钙离子通道等）都可能通过基因突变导致离子通道 病。离子通道病是遗传病，患者通常呈现家族聚集性，并且会把致病突变传递给下一代。离 子通道病的临床表现多种多样，有的仅出现非致死性心律失常，有的则可能伴有其它器官 的受累或畸形，有的会引起患者晕厥或者猝死，甚至在一些患者首发症状即表现为猝死。在 一些国家和地区甚至是中青年猝死的主要原因之一。对离子通道病进行基因诊断，有助于 为临床患者提供最合适的治疗策略，包括抗心律失常药物种类的选择、生活方式的干预、植 入性器械治疗方案的选择以及预后评估等。
[0003] 目前，研究发现离子通道病的众多致病基因中，只要任意一种基因发生功能性突 变，即可引起疾病表型，即：同一种离子通道病可以由多种遗传因素所导致。并且，不同基因 的突变导致的同一种离子通道病，其严重程度和预后有着较大差异(如长QT综合征有13型， 每一型对应一个致病基因）。除此之外，同一患者如果携带了一个以上的致病基因突变，其 临床表现和预后与只携带单一致病突变的患者相比会有差异。因此，全面、快速、准确地筛 查致病基因是离子通道病精确诊断和个性化治疗的必须前提条件。
[0004] 临床上现有的离子通道病的常规诊断技术，主要是心电图检查。但是，心电图检查 不能精确、特异地区别离子通道病的具体种类。对于阵发性和隐匿型心律失常患者，其病态 心电表现不是时时都可捕捉到，因此心电图检查不能100%做到确切判断，也不能在早期尚 未表现出临床症状的情况下对患者进行诊断。因此，目前仅结合临床症状、心电图检查不能 把各种离子通道病精准地区分开来。对于特殊类型的离子通道病，如:Brugada综合征，患者 常在床上夜间猝死，猝死前可以没有任何症状和临床表现，对临床的诊断提出了巨大的挑 战。因此具有预告性的基因诊断是解决这一难题的唯一解决办法。然而，传统的基于Sanger 测序的基因检测方法存在通量低的弊端，一次反应只能检测一个扩增区域，无法满足庞大 的基因检测区域和多样本检测时效性的要求。
[0005] 因此，有必要寻求一种新的检测离子通道病致病基因突变的方法，提高诊断准确 率，降低成本和劳动强度并提高时效性。
【发明内容】
[0006] 为实现上述目的，本发明提供一种覆盖包括长QT综合征、短QT综合征、Brugada综 合征、儿茶酚胺敏感性室速、家族性房颤、病态窦房结综合征、心脏传导阻滞等多种常见致 死性离子通道病，包含74个离子通道病致病相关基因的DNA文库。这74个基因选择基于基于 国际已报道和公认的临床致病基因数据库(CMM数据库、HGMD数据库、Cl inVar数据库）以及 发明者自己的课题研究内容。这74个基因上的致病突变既可以单独致病，也可以联合致病 导致更加严重和复杂的临床表型，本发明首次做到可以一次性全面的对它们进行测序。其 中74个基因如下：
[0007]
[0008]
[0009]
[0020] (7)对步骤(6)得到的二次扩增产物进行片段选择及浓度测定，即建成患者目标区 域扩增文库；
[0021 ] (8)对步骤(7)所得到的文库经过油包水PCR扩增反应后，将待测序目的片段连接 于ISP珠子，得到反应液；
[0022] (9)将步骤(8)得到的包含ISP珠子的反应液点入芯片，上Ion Torrent?高通量测 序进彳丁测序；
[0023] (10)将步骤(9)得到的碱基序列信息进行生物信息学比对处理，得到与疾病相关 的突变位点；
[0024] (11)对步骤（10)得到的突变位点进行Sanger测序法验证。优选的，所述样本来自 受试者的外周血、体液、组织器官样本。
[0025] 更优选的，所述应用进一步用于指导治疗，例如:通过基因检测确诊的SCN5A基因 突变Brugada综合征患者，应考虑I⑶植入术等治疗。
[0026] 本发明还提供一种诊断试剂盒，其中，所述试剂盒包括上述包含74个离子通道病 的致病基因的DNA文库。
[0027] 本发明还提供一种诊断装置，其中，所述装置包括上述包含74个离子通道病的致 病基因的DNA文库。优选的，所述装置为测序芯片。
[0028] 本发明提供一种使用上述DNA文库、诊断试剂盒或诊断装置对患者进行诊断的方 法，所述方法包括下列步骤：
[0029] (1)提供受试者样本的基因组DNA;
[0030] (2)利用上述的DNA文库从Ion Torrent?高通量测序平台自动合成覆盖全部74个 致病基因的扩增引物文库，对目标区域进行超多重PCR扩增；
[0031] (3)对步骤(2)得到的扩增产物进行酶切；
[0032] (4)对步骤(3)得到的酶切产物加 Barcode接头;优选的，所述Barcode接头来自于 高通量测序建库试剂盒；
[0033] (5)对步骤(4)得到的连接产物进行纯化；
[0034] (6)对步骤(5)得到的纯化产物用通用引物进行二次扩增，优选的，该通用引物来 自于高通量测序建库试剂盒；
[0035] (7)对步骤(6)得到的二次扩增产物进行片段选择及浓度测定，即建成患者目标区 域扩增文库；
[0036] (8)对步骤(7)所得到的文库经过油包水PCR扩增反应后，将待测序目的片段连接 于ISP珠子，得到反应液；
[0037] (9)将步骤(8)得到的包含ISP珠子的反应液点入芯片，上Ion TorrentTM高通量测 序进彳丁测序；
[0038] (10)将步骤(9)得到的碱基序列信息进行生物信息学比对处理，得到与疾病相关 的突变位点；
[0039] (11)对步骤（10)得到的突变位点进行Sanger测序法验证。
[0040] 优选的，所述样本来自受试者的外周血、体液、组织器官样本。
[0041] 更优选的，所述应用进一步用于指导治疗，例如:通过基因检测确诊的SCN5A基因 突变Brugada综合征患者，应考虑I⑶植入术等治疗。
[0042]采用本发明的DNA文库对离子通道病患者进行基因诊断有着以下重要意义和效 果：
[0043] 1.及时发现隐匿型和阵发性恶性心律失常患者:多种易发猝死的离子通道病患者 可以在发病前毫无临床表现，首发症状即是猝死，尤其是已经有猝死家族史的病人，猝死风 险更高。对于这种隐匿型恶性心律失常患者，未发病时传统的检查方法无法对其进行确诊。 类似的，有的阵发性心律失常患者，未发病时心电图检查完全正常，传统的检查方法对其进 行诊断有很大难度。因此而基因诊断则成为了诊断这些患者的重要手段；
[0044] 2.基因诊断有助于制定进一步个性化治疗方案:通过基因诊断筛选出已知的恶性 心律失常致病突变携带患者，应更加积极地考虑植入性器械治疗，在风险评分达到标准时， 哪怕尚无临床表现，应考虑行激发试验进行诊断。如:KCNQ1突变导致的长QT综合征1型患 者，有明确的猝死家族史，检测到已知致病突变，临床如果没有表现应行激发试验，激发试 验阳性应考虑ICD植入术。同时，基因诊断可以帮助心律失常药物的优化选择。如:基于长期 以来的临床经验及致病机制研究，可以知道倍他乐克对KCNQ1突变的长QT综合征1型患者最 有效，对KCNH2突变的长QT综合征2型患者效果次之，而对于SCN5A突变的长QT综合征3型患 者而言，首选应为普萘洛尔加美西律。
[0045] 3.本申请的DNA文库是申请人从众多的离子通道病致病基因中选择的74个基因， 这些基因尤其适合包括中国人在内的黄色人种患者的检测。国际上缺乏大规模的中国汉族 人群致死性离子通道病基因诊断相关信息，绝大多数已知致死性离子通道病基因都主要来 自欧美人群的报道，它们对中国人的致病性及特点目前没有详细报道。发明者进行了长期 的临床观察和大规模中国汉族人群致死性离子通道病的基因诊断研究。所选基因中的绝大 多数基因均为发明人在汉族人群中发现的致病基因。
[0046] 4.本发明的DNA文库能够检测包括长QT综合征、短QT综合征、Brugada综合征、儿茶 酚胺敏感性室速、家族性房颤、病态窦房结综合征、心脏传导阻滞等多种常见致死性离子通 道病。本发明提供的DNA文库及基于高通量测序技术的序列检测方法能够检测74种离子通 道病的遗传缺陷；
[0047] 5.本发明中采用基于Ion Torrent?高通量测序技术对目标区域的扩增产物进行 检测，能够在一次测序反应中同时检测本发明中涉及的74个相关致病基因的全部外显子及 毗邻区域，并且能根据不同芯片数据量的大小，调整检测样本数量，在保证平均测序深度 500X的前提下，检测1到24人不等的样本数量，整个测序反应和数据分析判读能在两天之 内完成，大大降低了扩增反应的成本和劳动强度，提高了时效性，同时，该检测区域具有覆 盖度广，整体覆盖度达到97.98% 。通过对目标扩增区域的测序和数据判读，能够准确识别 与疾病相关的突变，判断疾病种类和病因，为临床提供及时可靠的检测报告。本发明设计的 检测方法经过Sanger测序法验证，对二代测序深度达到100 X的点突变，本方法的准确度达 到100 % ;
[0048] 6.基因诊断有助于遗传咨询、产前诊断和新生儿筛查等。因很多离子通道病患者 面临猝死的风险，家人非常关注患者的兄弟姐妹或将来下一胎的健康。患者致病基因突变 的确诊，可以为孕育健康的下一代提供明确的遗传咨询服务。离子通道病多数为常染色显 性遗