一种检测诊断主动脉夹层病致病基因的dna文库及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种通过靶向高通量半导体测序技术检测诊断主动脉夹层致病基因 的DNA文库及其应用。具体说是根据主动脉夹层致病基因，设计能覆盖上述基因外显子及毗 邻区域的超多重PCR引物，并对样本基因组DNA进行超多重PCR扩增，扩增产物利用高通量测 序技术进行测序，寻找致病突变，明确主动脉夹层的遗传学病因，为临床诊断提供遗传学和 分子生物学的理论依据，属于生物医学领域临床检测技术中的基因检测技术。
【背景技术】
[0002] 主动脉夹层是心血管系统较常见的一种严重威胁患者生命安全的主动脉疾病，起 病急，预后差，死亡率高，病因复杂，日益受到人们的重视。目前，针对该病尚无治疗效果满 意的特异性药物，因此能否早期筛查诊断出潜在患病人群对于该病的防治就显得至关重 要。
[0003] 传统的主动脉夹层诊断主要依靠临床表现（突发撕裂样剧烈胸痛或腰腹痛)和传 统生物标记物(平滑肌肌球蛋白重链smMHC、f丐调蛋白calpon in、弹力蛋白降解产物sELAF、C 反应蛋白CRP、DD二聚体D-Dimer)和影像学检查(经食管超声心电图、主动脉超声、主动脉CT 及核磁共振）。然而，临床上由于主动脉夹层患者出现临床症状的时间差异大，很多患者甚 至没有明显的胸痛和腰腹痛，首发症状即为猝死。传统生物标记物预测和诊断主动脉夹层 特异性差。传统的影像学检查诊断方法存在确诊时间晚（症状出现后），难以判断预后等问 题。
[0004] 主动脉夹层既可以独立发病，也可以作为临床综合征的一种表现。与主动脉夹层 相关的临床综合征有:Marfan综合征(MFS)、Ehlers_Danlos综合征(EDS)、Loeys_Dietz综合 征(LDS)以及主动脉扭曲综合征(ATS)。
[0005] 随着测序技术近年来的迅猛发展，人类基因检测方法变得越来越简单快捷，检测 成本也日益下降，使得基因诊断应用在临床一线的常规检查中成为可能。而且，基因诊断敏 感性高，能早期诊断，即：可在症状出现前和不可逆病理改变前做出诊断，临床医生也可以 根据基因型判断恶性临床转归和预后，早期干预。在各种高通量测序平台中，新进出现的基 于半导体测序技术的扩增子测序以其快速的运行时间，灵活的通量选择，较低的运行成本 和相对简单的操作方法脱颖而出。
[0006] 因此，有必要寻求一种新的基于高通量半导体测序技术的检测主动脉夹层致病基 因突变的方法，提高诊断准确率，降低成本和劳动强度并提高时效性。
【发明内容】
[0007] 为实现上述目的，本发明提供一种覆盖包括：家族性主动脉瘤或夹层(FTAAD)、 Marfan综合征(MFS)、Ehlers_Danlos综合征(EDS)、Loeys_Dietz综合征(LDS)以及主动脉扭 曲综合征(ATS)等多种常见主动脉夹层相关疾病，包含33个主动脉夹层致病相关基因的DNA 文库。本发明是目前已知检测主动脉夹层最全面的靶向测序基因检测试剂盒，33个基因的 选择基于国际已报道和公认的临床致病基因数据库(0M頂数据库、HGMD数据库、Cl inVar数 据库）以及发明者自己的课题研究内容。这33个基因上的致病突变既可以单独致病，也可以 联合致病导致更加严重和复杂的临床表型，本发明首次做到可以一次性全面的对它们进行 测序。其中33个基因及其导致的相关疾病如下：
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[0010] 本发明根据33个主动脉夹层致病基因，设计能覆盖上述基因外显子及毗邻调控区 域的适用于超多重PCR的引物池，进而对样本基因组DNA进行超多重PCR扩增，扩增产物利用 高通量半导体测序技术进行测序，寻找致病突变，明确主动脉夹层的遗传学病因，为临床诊 断提供遗传学和分子生物学的理论依据。为此，本发明还提供以下技术方案：
[0011] 本发明还提供一种上述DNA文库在制备诊断试剂盒中的应用，所述试剂盒用于诊 断主动脉夹层。
[0012] 本发明还提供一种上述DNA文库在制备诊断装置中的应用，所述诊断装置用于诊 断主动脉夹层。优选的，所述诊断装置是测序芯片。
[0013] 进一步，所述应用包括下列步骤：
[0014] (1)提供受试者样本的基因组DNA;
[0015] (2)利用上述的DNA文库从Ion Torrent?高通量测序平台自动合成覆盖全部33个 致病基因的扩增引物文库，对目标区域进行超多重PCR扩增；
[0016] ⑶对步骤⑵得到的扩增产物进行酶切；
[0017] (4)对步骤(3)得到的酶切产物加 Barcode接头;优选的，所述Barcode接头来自于 高通量测序建库试剂盒；
[0018] (5)对步骤(4)得到的连接产物进行纯化；
[0019] (6)对步骤(5)得到的纯化产物用通用引物进行二次扩增;优选的，该通用引物来 自于高通量测序建库试剂盒；
[0020] (7)对步骤(6)得到的二次扩增产物进行片段选择及浓度测定，即建成患者目标区 域扩增文库；
[0021 ] (8)对步骤(7)所得到的文库经过油包水PCR扩增反应后，将待测序目的片段连接 于ISP珠子，得到反应液；
[0022] (9)将步骤(8)得到的包含ISP珠子的反应液点入芯片，上Ion Torrent?高通量测 序进彳丁测序；
[0023] (10)将步骤(9)得到的碱基序列信息进行生物信息学比对处理，得到与疾病相关 的突变位点；
[0024] (11)对步骤（10)得到的突变位点进行Sanger测序法验证。
[0025]优选的，所述样本来自受试者的外周血、体液、组织器官样本。
[0026] 更优选的，所述应用进一步用于指导治疗，例如:通过基因检测确诊的FBN1基因突 变Marfan综合征患者，应考虑定期行主动脉和心脏彩超随访，终生口服ARB类药物及倍他受 体阻滞剂等治疗，改善预后。
[0027] 本发明还提供一种诊断试剂盒，其中，所述试剂盒包括上述包含33个主动脉夹层 的致病基因的DNA文库。
[0028] 本发明还提供一种诊断装置，其中，所述装置包括上述包含33个主动脉夹层的致 病基因的DNA文库。优选的，所述装置为测序芯片。
[0029] 本发明提供一种使用上述DNA文库、诊断试剂盒或诊断装置对患者进行诊断的方 法，所述方法包括下列步骤：
[0030] (1)提供受试者样本的基因组DNA;
[00311 (2)利用上述的DNA文库从Ion Torrent?高通量测序平台自动合成覆盖全部31个 致病基因的扩增引物文库，对目标区域进行超多重PCR扩增；
[0032] (3)对步骤(2)得到的扩增产物进行酶切；
[0033] (4)对步骤(3)得到的酶切产物加 Barcode接头;优选的，所述Barcode接头来自于 高通量测序建库试剂盒；
[0034] (5)对步骤(4)得到的连接产物进行纯化；
[0035] (6)对步骤(5)得到的纯化产物用通用引物进行二次扩增，优选的，该通用引物来 自于高通量测序建库试剂盒；
[0036] (7)对步骤(6)得到的二次扩增产物进行片段选择及浓度测定，即建成患者目标区 域扩增文库；
[0037] (8)对步骤(7)所得到的文库经过油包水PCR扩增反应后，将待测序目的片段连接 于ISP珠子，得到反应液；
[0038] (9)将步骤(8)得到的包含ISP珠子的反应液点入芯片，上Ion Torrent?高通量测 序进彳丁测序；
[0039] (10)将步骤(9)得到的碱基序列信息进行生物信息学比对处理，得到与疾病相关 的突变位点；
[0040] (11)对步骤(10)得到的突