一种测定血浆中游离化合物浓度、logD和化合物蛋白结合率的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种同时测定血浆中游离化合物浓度、log D和化合物蛋白结合率的 方法。 技术背景
[0002] 随着人类基因组学、蛋白组学、组合化学、计算机等学科的迅速发展，为化合物的 筛选提供了成千上万的新模型、新祀点、新技术，推动化合物筛选研究的高度发展。化合物 筛选是从合成或天然产物化合物中对可能作为的候选化合物进行初步的药理活性筛选过 程。化合物筛选中，需要对大量的候选化合物进行理化性质分析，如溶解度、渗透系数、化合 物蛋白结合率、log D和log P的测定。其中化合物的亲脂性是化合物的一个重要的理化 性质，它与化合物在体内的吸收、分布、代谢、排泄、毒理学特性，甚至和血脑屏障渗透性W 及化合物的清除都有重要的关系。化合物的油水分配系数通常被用作表征化合物亲脂性的 参数，其定义为化合物在正辛醇和水之间的分配系数的对数，即log D。
[0003] 目前，测定化合物油水分配系数的方法很多，包括摇瓶法、色谱法、抑值度量法、固 定化人工膜和透析管法，其中，经典方法为摇瓶法，常用方法为色谱法。摇瓶法是最简单和 常用的方法，但在测定中需消耗大量的有机试剂，不利于环保，而且该种方法费事、费力，要 求样品有较高的纯度和良好的稳定性。另外，在实验震摇过程过程中，有机相和水相易产生 乳化现象，导致两相在分离时不彻底而出现错误的结果。测定油水分配系数的色谱法，包括 薄层色谱法、反相高效液相方法、亲水反应色谱法、逆流色谱法和微乳电动色谱法。色谱法 是基于建立一系列已知油水分配系数实验值的化合物的色谱系统的关系模型。该些方法的 共同特点是，该些测定方法能够准确测定具有相似官能团或者属于同系列的化合物的油水 分配系数。然而，当没有结构相同的化合物时，该方法得到的结果往往不准确。
[0004] 2006年包建民教授的课题组提出了中空纤维膜液相微萃取方法测定化合物的油 水分配系数（Guo Y G,化ang J, Liu D N,化 H F. Determination of n-〇ctanol-water partition coefficients by hollow-fiber membrane solvent microextraction coupled with HPLC，Anal. Bioanal^ical Chem. 386 (7-8)，2193-2198 (2006) ?)，该方法可臥直接测 定化合物的油水分配系数。
[0005] 同时，化合物蛋白结合率的测定是化合物筛选和新药临床评价中非常重要的内容 之一，它密切关系到化合物的药理作用强度。如果化合物的蛋白结合率较高，在血液中的半 衰期长而副作用少；如果化合物的蛋白结合率低，在血液中的半衰期短体内消除快，作用维 持时间短。常用化合物蛋白结合率的测定方法有平衡透析法、超滤法、微透析、亲和色谱法、 高效分子排阻色谱法、毛细管电泳法、光谱法、核磁共振法、质谱法、固相微萃取法和中空纤 维膜液相微萃取法等。该些化合物蛋白结合测定方法各有优缺点，其中中空纤维膜液相微 萃取法是一种新型的，集采样、萃取和浓缩于一体的样品前处理技术，已经初步应用于化合 物蛋白结合的测定。
[0006] 2005 年"Tat jana Trtic ' -Petrovic 教授的课题组（Trtid-F*clrovi6 T,化nssonb J A. Determination of drug - protein binding using supported liquid membrane extraction under equilibrium conditions. J. Chromatogr. B 814 (2), 375-384(2005).) 采用中空纤维膜液相微萃取法成功测定利多卡因、罗嗽卡因、丙胺卡因、布比卡因等化合物 蛋白结合特性。该方法简单、快速、廉价，是测定化合物蛋白结合特性的新型技术，但是该技 术不能直接测定血浆中游离化合物浓度和蛋白结合率。2006年包建民教授的课题组（化 H, Guan J, James J. Bao. A hollow fiber solvent microextraction approach to measure 化ug - protein binding. Anal. Sci. 22 (12)，1565-1569 (2006).)用中空纤维膜液-液微萃 取法测定氨化可的松的蛋白结合率，该方法适用于给体相的体积很大而接受相体积较小， 即有机相的萃取不影响化合物蛋白结合的可逆平衡。而且该方法对高蛋白结合率化合物的 测定结果较准确，但是无法同时测定血浆中的游离化合物浓度及log D。因此亟需一种可W 同时测定血浆中游离化合物浓度、log D和蛋白结合率，并且给体相的体积和接受相体积的 大小不影响测定结果的技术。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种易于操作、快速、准确测定血浆中 游离化合物浓度和log D的方法。
[000引本发明的第二个目的是提供一种测定化合物蛋白结合率的方法。
[0009] 本发明的技术方案概述如下：
[0010] 一种测定血浆中游离化合物浓度和log D的方法，包括如下步骤：
[0011] (1)用浓度为0. 02-0. 3M、pH为7. 4的磯酸缓冲溶液配制溶质为化合物和血浆的溶 液5mL为给体相，所述给体相中化合物的浓度为0. 2-100 y g/mL、血浆体积浓度为10-50%， 将给体相放入容器中，于37°C水浴锅中解育0. 5-2小时；
[0012] (2)将50-100 uL正辛醇注入到一端已密封的中空纤维膜内腔中，加热将中空纤 维膜的开口端密封；向透析袋内加入0. 5mL抑=7. 4的浓度为0. 02-0. 3M的磯酸缓冲溶 液，将两端封闭的中空纤维膜和透析袋放入步骤（1)获得的溶液中，萃取75-300分钟使平 衡；
[0013] (3)取出透析袋内液体，用HPLC分析缓冲溶液中化合物的浓度巧]d，该浓度相当 于平衡时血浆中游离化合物浓度；取出中空纤维膜内液体，用HPLC分析平衡时正辛醇中化 合物浓度巧]。，计算血浆中化合物的log D ;
[0014] log D的计算方法为式I ;
[0015]
【主权项】
1. 一种测定血浆中游离化合物浓度和logD的方法，其特征是包括如下步骤： (1) 用浓度为〇. 02-0. 3M、pH为7. 4的磷酸缓冲溶液配制溶质为化合物和血浆的溶液 5mL为给体相，所述给体相中化合物的浓度为0. 2-100yg/mL、血浆体积浓度为10-50%， 将给体相放入容器中，于37°C水浴锅中孵育0. 5-2小时； (2) 将50-100yL正辛醇注入到一端已密封的中空纤维膜内腔中，加热将中空纤维膜 的开口端密封；向透析袋内加入〇. 5mLpH= 7. 4的浓度为0. 02-0. 3M的磷酸缓冲溶液， 将两端封闭的中空纤维膜和透析袋放入步骤（1)获得的溶液中，萃取75-300分钟使平衡； (3) 取出透析袋内液体，用HPLC分析缓冲溶液中化合物的浓度[D]d，该浓度相当于平 衡时血浆中游离化合物浓度；取出中空纤维膜内液体，用HPLC分析平衡时正辛醇中化合物 浓度[D]a，计算血衆中化合物的logD; logD的计算方法为式I:
式I。
2. 根据权利要求1所述的一种测定血浆中游离化合物浓度和logD的方法，其特征是 所述透析袋的截留分子量为7000-10000。
3. 根据权利要求1所述的一种测定血浆中游离化合物浓度和logD的方法，其特征是 所述中空纤维膜的材质为聚偏氟乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯或聚碳酸纤维素。
4. 一种测定化合物蛋白结合率的方法，其特征是包括如下步骤： (1) 用浓度为〇. 02-0. 3M、pH为7. 4的磷酸缓冲溶液配制溶质为化合物和血浆的溶液 5mL为给体相，所述给体相中化合物的浓度为0. 2-100yg/mL、血浆体积浓度为10-50%， 将给体相放入容器中，于37°C水浴锅中孵育0. 5-2小时； (2) 将50-100yL正辛醇注入到一端已密封的中空纤维膜内腔中，加热将中空纤维膜 的开口端密封；向透析袋内加入〇. 5mLpH= 7. 4的浓度为0. 02-0. 3M的磷酸缓冲溶液， 将两端封闭的中空纤维膜和透析袋放入步骤（1)获得的溶液中，萃取75-300分钟使平衡； (3) 取出透析袋内液体，用HPLC分析缓冲溶液中化合物的浓度[D]d，该浓度相当于平 衡时血浆中游离化合物浓度；取出中空纤维膜内液体，用HPLC分析平衡时正辛醇中化合物 浓度[D]a，计算，得到化合物蛋白结合率； 化合物蛋白结合率的计算方法为式II:
式II; 其中CPB%为化合物蛋白结合率，[V]d为平衡时给体相与透析袋内溶液总体积；[V] 3为 平衡时中空纤维膜内正辛醇体积；[DP]为化合物蛋白结合浓度；[VL为给体相初始体积； [D] ^为给体相中化合物初始浓度。
5. 根据权利要求4所述的一种测定化合物蛋白结合率的方法，其特征是所述透析袋的 截留分子量为7000-10000。
6. 根据权利要求4所述的一种测定化合物蛋白结合率的方法，其特征是所述中空纤维 膜的材质为聚偏氟乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯或聚碳酸纤维素。
【专利摘要】本发明公开了一种测定血浆中游离化合物浓度、log？D和化合物蛋白结合率的方法，测定血浆中游离化合物浓度和log？D的方法，步骤：(1)用磷酸缓冲溶液配制含化合物和血浆的给体相，孵育；(2)将正辛醇注入到中空纤维膜内；向透析袋内加入磷酸缓冲溶液，将中空纤维膜和透析袋放入步骤(1)获得的溶液中，萃取使平衡；(3)取出透析袋内液体，用HPLC分析缓冲溶液中化合物的浓度[D]d，该浓度相当于平衡时血浆中游离化合物浓度；取出中空纤维膜内液体，用HPLC分析平衡时正辛醇中化合物浓度[D]a，计算血浆中化合物的log？D；本发明分析速度快、需要的生物样品量少，灵敏、操作简便、成本低、不需要昂贵的仪器，环保。
【IPC分类】G01N30-02, G01N30-06
【公开号】CN104569206
【申请号】CN201510017619
【发明人】李优鑫, 包建民, 宝贵荣
【申请人】天津大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月14日