一种基于钯纳米颗粒可视化检测6-巯基嘌呤的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于纳米技术和仿生技术领域，具体的是涉及一种基于钯纳米颗粒可视化 检测6-巯基嘌呤的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 6-巯基嘌呤，又称巯嘌呤，为嘌呤类抗代谢型抗癌药物，在体内通过阻断次黄嘌呤 转变为腺嘌呤核苷酸及鸟嘌呤核苷酸而抑制核酸的合成，临床上主要用于治疗急性白血 病、绒毛膜上皮癌和恶性葡萄胎等[Cancer，1999,86(6)，1080-1086]。服用6-巯基嘌呤会产 生肝损伤和骨髓抑制等副作用。6-巯基嘌呤的活性因个体差异和血浆浓度而异 [Biosens .Bioelectron. 2013,41,844-847]，对用药病人进行药物浓度监测可以指导临床 合理用药且对于减少药物不良反应具有重要意义。因此，为了人类健康，建立一种廉价，高 敏感性，高选择性的6-巯基嘌呤检测方法至关重要。到目前为止，6-巯基嘌呤的检测方法有 电化学分析法、高效液相色谱法、质谱分析法、毛细管电泳法、拉曼光谱法、荧光光谱法等 [Biosens ·Bioelectron· 2013，41，844_847 ;J.Electroanal · Chem. 2012，665，63-69]。在这 些方法中，电化学分析法被广泛地报道且许多修饰电极用于6-巯基嘌呤的检测，但是它们 较差的重复性和复杂的电极修饰过程限制了他们在实际样品中的应用;虽然高效液相色谱 法、质谱分析法、毛细管电泳法和拉曼光谱法检测6-巯基嘌呤时具有选择性且灵敏，但是它 们需要昂贵的设备和有毒的溶剂且往往涉及复杂的样品预处理;于对荧光检测法来说，由 于没有分离功能导致选择性较低，所以它的应用有限[Biosens .Bioelectron. 2013,41， 844-847]〇
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种基于钯纳米颗粒可视化检测6-巯 基嘌呤的试剂盒。
[0004] 本发明的技术方案概述如下：
[0005] -种基于钯纳米颗粒可视化检测6-巯基嘌呤的试剂盒，包括：
[0006] 1)具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体；
[0007] 2)3,3'，5,5'_四甲基联苯胺-乙醇溶液；
[0008] 3)过氧化氢水溶液；
[0009] 4) pH为4.0磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液。
[0010] 3,3'，5,5'_四甲基联苯胺-乙醇溶液的浓度优选为l-50mM。
[0011] 过氧化氢水溶液的浓度优选为1-10M。
[0012] pH为4 · 0磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液的浓度优选为20-80mM〇
[0013] 其中，具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒是用下述方法制成：
[0014] 1)脱氧核苷酸的退火：
[0015] 将2.5-25(^1^2-20(^]\1的脱氧核苷酸水溶液、50-20(^1^5-201111口!1为3.0-9.0的磷 酸盐缓冲溶液加入1.5mL的离心管中并加入三蒸水使总体积为400yL，混匀;升温至90-100 °C，维持5-10min，降至室温；
[0016] 脱氧核苷酸的序列为
[0017] Gb，其中 b = 10-200;
[0018] Cc，其中 c = 10-200;
[0019] (GC)d，其中 d = 5-100;
[0020] (G2C)e，其中 e = 4_70;
[0021] (G3C)f，其中 f = 3_60;
[0022] (G4C)g，其中 g = 2_50;
[0023] (GC2)h，其中h = 4_70;，
[0024] (GC3)i，其中 i = 3-60;
[0025] (6〇4)」，其中」=2-50;
[0026] 2)钯纳米颗粒的制备：
[0027] 将8-16yL 200-400μΜ氯钯酸钠水溶液加入到步骤1)获得的退火的脱氧核苷酸水 溶液中，在20_30°C下混匀，静置0.5-4h，加入6-24yL 0.6-2.4mM还原剂水溶液，混匀，在20-30°C下静置10_15h，得到具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体。
[0028] 还原剂优选为硼氢化钠或二甲胺硼烷。
[0029] 具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒的制备中所使用的磷酸盐缓冲溶液优选为磷 酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液、磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液或磷酸二氢钠-磷酸缓 冲溶液。
[0030] 本发明的优点：
[0031] 利用本发明的试剂盒能方便地用于人血清和人尿中6-巯基嘌呤含量的测定，其具 有灵敏度高、选择性好、检测限低。
【附图说明】
[0032] 图1是实施例1中合成的具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒的透射电镜图；
[0033]图2是实施例1中过氧化氢水溶液浓度为125mM，3,3'，5,5'_四甲基联苯胺乙醇溶 液浓度分别为〇 · 015mM、0 · 06mM、0 · 08mM、0 · 125mM、0 · 165mM、0 · 25mM的动力学曲线图；
[0034]图3为图2的双倒数曲线图。
[0035]图4是实施例1中3,3'，5,5'-四甲基联苯胺乙醇溶液浓度为0.125mM，过氧化氢水 溶液浓度分别为15mM、30mM、50mM、75mM、1 OOmM、125mM、150mM的动力学曲线图；
[0036]图5为图4的双倒数曲线图。
[0037]图6为试验例1的标准工作曲线图；
【具体实施方式】
[0038]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0039] 下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但不对本发明 作任何限制。
[0040] 实施例1
[0041] -种具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
[0042] (1)脱氧核苷酸C1Q的退火：
[0043] 将25yL 20μΜ的脱氧核苷酸Cio水溶液、100yL 10mM pH为5.0的磷酸二氢钠 -磷酸氢 二钠缓冲溶液加入1.5mL的离心管中并加入三蒸水使总体积为400yL，混匀;升温至95°C，维 持5min，降至室温；
[0044] (2)钯纳米颗粒的制备：
[0045]将12yL 300μΜ氯钯酸钠水溶液加入到步骤（1)获得的退火的脱氧核苷酸水溶液 中，在25°C下混匀，静置2h，加入15yL 1.5mM二甲胺硼烷水溶液，混匀，在25°C下静置12h，得 到具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体。用透射电镜扫描获得平均粒径为4.8nm。（见图 1)
[0046] 检测：
[0047] 测定钯纳米颗粒的过氧化物酶活性：
[0048]在6个4mL比色皿中，均加入9yL实施例1获得的具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒 液体、750yL 10mM pH为4.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液、38.2yL 0.125M过氧化氢水 溶液后，再向 1-6 个比色皿中依次加入15yL的0.015mM、0.06mM、0.08mM、0.125mM、0.165mM、 0.25mM 3,3'，5,5'_四甲基联苯胺乙醇溶液，加入三蒸水使终体积为3000yL，混合反应 lOmin，采用紫外分光光度计扫描652nm处的吸收光谱，得到吸光度，通过Lineweaver-Burk 方程计算出其米氏常数。（见图2和图3)
[0049] 具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒表现出高的酶活性，对3，3 '，5，5 四甲基联苯 胺的Km值为0.051mM。
[0050] 在7个4mL比色皿中，均加入9yL实施例1获得的具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒 液体、750yL 10mM pH为4.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液、15yL 0.125mM 3,3'，5,5'_ 四甲基联苯胺乙醇溶液后，再向1-7个比色皿中依次加入38.2yL的15mM、30mM、50mM、75mM、 100mM、125mM、150mM过氧化氢水溶液，加入三蒸水使终体积为3000yL，混合反应lOmin，采用 紫外分光光度计扫描652nm处的吸收光谱，得到吸光度，通过Lineweaver-Burk方程计算出 其米氏常数。（见图4和图5)
[0051] 具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒表现出高的酶活性，对过氧化氢的Km值为 29.5mM〇
[0052] 实施例2
[0053] 一种具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
[005