血浆游离dna文库的构建方法
【专利摘要】本发明提供了一种“少量DNA文库的构建方法”，首先对血浆游离DNA或片段化DNA进行末端修复，并同时对5’端进行磷酸化修饰，得到修复后DNA；之后直接与人工接头进行平末端连接，经纯化后得到较纯净的连接处带有缺口的含接头DNA；然后在PCR扩增之前使用PCR聚合酶进行缺口的修补，得到修补后完整的含接头DNA；再进行PCR扩增反应，产物纯化后得到最终高通量测序文库。本方法不仅简便、高效，减少了纯化步骤，降低了文库构建过程中DNA的损失，而且使用特定的接头及平末端的连接方式，有效地解决微量DNA文库构建过程中容易出现接头自连的问题；同时，扩增前修补缺口，保证扩增前有足够的完整的模板进行扩增反应。
【专利说明】血浆游离DNA文库的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及扩增前修补缺口的血浆DNA文库构建方法，特别是涉及可应用于无创 产前诊断的孕妇血浆中游离DNA文库构建方法。
【背景技术】
[0002] 根据医学统计，每年出生的新生儿中，约有2?3%罹患先天性疾病或出生缺陷， 造成了婴幼儿长期卧病、残障，甚至夭折，给社会和家庭带来巨大的负担。导致先天性疾病 或出生缺陷的原因主要有染色体异常、单基因遗传病、多基因遗传病、致畸胎因素等，其中 染色体异常占较大比例。在讲求优生保健的现代社会，如何防治先天性疾病或出生缺陷，成 为十分重要的课题。而产前诊断、及时发现、及时终止妊娠是预防遗传缺陷患儿出生的重要 手段。传统的产前诊断方法是通过羊水穿刺、绒毛活检以及胎儿脐带血检查直接获取胎儿 遗传物质来进行诊断，这些产前诊断技术都是侵入性的，有一定的风险，可能会造成胎儿损 伤、母体流产或宫内感染，甚至胎死宫内等，难以被广大孕妇和家庭所接受。
[0003] 1997年Lo等研究报道了孕妇血浆中有胎儿游离DNA的存在，后来有研究也报道 发现孕妇血浆中存在胎儿RNA，这些重大发现为无创产前诊断提供了新的可能。在孕妇外 周血中胎儿游离DNA占孕妇血浆总DNA的3%?30%，无创产前诊断就是指抽取孕妇外 周血，通过对孕妇外周血中游离胎儿DNA进行高通量测序，通过生物信息学分析来检测胎 儿是否患有21-三体综合征（唐氏综合征）、18-三体综合征（爱德华氏综合征）、13-三 体综合征（帕陶氏综合征）等染色体数目异常疾病，是产前诊断领域的一项新兴技术。与 侵入性产前诊断相比较，无创产前诊断具有安全性高、灵敏度高、特异性好、检测时间早、 快速等特点。
[0004] 目前，无创产前诊断过程中血浆游离DNA的文库构建一般是在提取孕妇血浆中的 游离DNA后，通过末端修复一纯化一加A-纯化一连接头一纯化一扩增一纯化等步骤来完 成。文库构建过程中，步骤繁琐，需经过多次纯化过程，会造成DNA的损失，同时在接头连接 的过程中会出现接头自连现象，致使文库构建效率低、质量差。或者通过末端修复并加A后 纯化、连接头后纯化、扩增、纯化等步骤来完成。虽然减少了纯化步骤，降低了DNA的损耗， 但是仍然有接头自连的问题难以解决。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在提供一种高通量测序文库的构建方法，以解决现有的少量DNA样本建 库，尤其是血浆游离DNA建库过程中DNA损耗及容易出现接头自连等问题。本方法不仅简 便、高效，减少了纯化步骤，降低了文库构建过程中DNA的损失，而且使用特定的接头及平 末端的连接方式，有效地解决微量DNA文库构建过程中容易出现接头自连的问题。同时，使 用特殊的文库扩增聚合酶，扩增前修补缺口，保证扩增前有足够的完整的模板进行扩增反 应。
[0006] -种少量DNA文库构建方法，采用下述顺序、方法步骤：
[0007] (1)对DNA片段进行末端修复成平端及5'端磷酸化，得到修复后DNA，
[0008] (2)修复后DNA直接与接头进行平末端连接，纯化，得到连接处带有缺口的含接头 DNA；
[0009] (3)使用PCR聚合酶进行缺口的修补，得到修补后完整的含接头DNA，
[0010] (4)PCR扩增，纯化，最终获得高通量测序文库。
[0011] 所述步骤⑵中的接头为接头A和接头B，接头A由SEQIDNOl和SEQIDN02等 摩尔量退火组合而成，所述接头B由SEQIDN03和SEQIDN04等摩尔量退火组合而成，
[0012] SEQIDNOl：
[0013] 5 ' -AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3 '
[0014] SEQIDN02 ：
[0015]5，-AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATC-3，，
[0016] SEQIDN03 ：
[0017] 5，-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACIIIIIIATC-3，，
[0018] SEQIDN04 ：
[0019] 5 '-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC T-3'，所述序列3中的六个碱基"IIIIII"表示测序平台多样品混合文库中的标签序列。
[0020] 所述测序平台为为illumina测序平台，所述"IIIIII"可以为任意六个碱基的随 机组合。
[0021] 所述碱基序列在illumina测序平台中可以为"ATCACG"，或者为"CGATGT"，或者 为"TTAGGC"，或者为"TGACCA"，或者为"ACAGTG"，或者为"GCCAAT"，或者为"CAGATC"，或 者为"ACTTGA"，或者为"GATCAG"，或者为"TAGCTT"，或者为"GGCTAC"，或者为"CTTGTA"。
[0022] 所述步骤（1)使用T4DNA聚合酶、大肠杆菌DNA多聚酶I大片段使DNA修复成平 末端。
[0023] 所述步骤（1)使用T4多核苷酸激酶使DNA平末端5'端磷酸化。
[0024] 所述DNA片段为血浆游离DNA，大小为100-250bp;或者为基因组DNA经超声破碎 为 100-250bp。
[0025] 本发明的文库构建方法，首先对血浆游离DNA或片段化DNA进行末端修复成平端， 并同时对5'端进行磷酸化修饰，得到修复后DNA;之后直接与人工接头进行平末端连接，得 到连接处带有缺口的含接头DNA;经纯化后得到较纯净的连接处带有缺口的含接头DNA;然 后在PCR扩增之前使用PCR聚合酶进行缺口的修补，得到修补后完整的含接头DNA;再进行 PCR扩增反应，得到扩增产物；纯化后得到最终高通量测序文库。
[0026] 本发明的文库构建方法，在进行DNA末端修复后不需进行纯化，利用修复体系直 接进行接头的连接，减少了纯化步骤造成的DNA损失；本发明的文库构建方法，使用的接头 只有一端是平末端，保证了与目的DNA连接的方向正确；使用的接头平末端未经过磷酸化 修饰，保证了连接反应时不会生成接头自连产物；本发明的文库构建方法，使用特殊的DNA 聚合酶进行连接处缺口的修补，保证PCR扩增前对连接处缺口进行完美修复。
[0027] 在高通量测序领域，文库构建好后，通常需要对文库进行质检。质检内容包括琼脂 糖凝胶电泳评估文库片段大小；采用实时荧光定量PCR评估文库浓度、是否有接头自连污 染。当文库浓度较低时，无法进行后续的高通量测序。当文库中含有自连的接头时，同样无 法进行高通量测序。以Hiseq2000为例，其要求文库浓度不低于2nM，且文库中没有自连的 接头污染。
[0028] 本发明的技术方案，通过采用修复末端后直接连接接头，减少了纯化步骤从而减 少了DM损失。本发明中所使用的单向平末端接头不进行磷酸化修饰，从而避免了文库构 建过程中产生的接头自连现象以及保证接头连接方向的正确。本发明中所使用的PCR聚 合酶在PCR反应前进行修补缺口的反应，保证了足够的完整的模板进行后续的PCR扩增 反应。
【专利附图】
【附图说明】
[0029] 图1示明了本发明的文库构建流程；
[0030] 图2示明了本发明实施例与对照例文库构建结果的电泳图；
[0031] 图3示明了本发明实施例文库实时荧光定量PCR质检熔解曲线图；
[0032] 图4示明了本发明对照例文库实时荧光定量PCR质检熔解曲线图；
[0033] 图5示明了本发明实施例与对照例文库实时荧光定量PCR质检熔解曲线对比 图。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。
[0035] 按照图1所示的文库构建流程进行构建的。所使用的接头序列为上述权利要求7 中所列序列。其中序列1与序列2等摩尔量退火组合成接头A，序列3与序列4等摩尔量退 火组合成接头B。
[0036] SEQIDNOl：
[0037] 5 ' -AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3 '
[0038] SEQIDN02 ：
[0039] 5, -AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATC-3，，
[0040] SEQIDN03 ：
[0041]5，-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACIIIIIIATC-3，，
[0042] SEQIDN04 ：
[0043] 5，-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA TCT-3'，所述序列3中的六个碱基"IIIIII"表示测序平台多样品混合文库中的标签序 列。
[0044] 下面实施例所使用样品为正常人血浆游离DNA。使用市售试剂盒进行血浆游离 DNA抽提。DNA使用Qubit荧光计进行定量。
[0045]1、对照例：血浆DNA文库构建
[0046] 1)样本及试剂
[0047] 取Qubit定量后的血浆游离DNA5ng，使用市售高通量测序文库构建试剂盒进行 文库构建。
[0048] 2)对血浆游离DNA进行末端修复及加dATP
[0049] 反应体系如下： DNA 55.5ui 丨'ti?1丨末端修M及加Aftf浞介 3MI
[0050] iU代末端修Si及加A反应Buffer6.5ui总体积65ul
[0051] 反应条件：混匀后20°C孵育30分钟。65°C孵育30分钟。
[0052] 3)接头连接
[0053] 反应体系如下： 少骤2)反应体系 65讀 ι}?饵连接反丨SiI5ul
[0054] lU色连接接头 2.5ul Ilifi!连接反应増强剂 Iul 总体积83.5ul
[0055] 反应条件：混匀后20°C孵育15分钟。
[0056] 在上述3)的体系中加入3ul市售试剂盒中酶进行酶切。
[0057] 反应条件：混匀后37°C孵育15分钟。
[0058] 对上述产物进行磁珠纯化。操作流程按照AmpureXPBeads纯化说明书进行。
[0059] 4)PCR扩增
[0060] 反应体系如下： 步骤3)冋收产物 23磁 Γ|?售2XPCR反应混合物 25ul
[0061] il/ffliidexUKIlIui tl/售通.)UPCR^丨物 ω 总体积50ul
[0062] 反应条件：98°C预变性30秒；然后98°C变性10秒，65°C30秒，72°C30秒，共10 个循环；最后72 °C延伸5分钟。
[0063] 对上述产物进行磁珠纯化。操作流程按照AmpureXPBeads纯化说明书进行。
[0064] 对步骤4)中的PCR纯化产物进行Qubit定量。
[0065] 2、实施例：血浆DNA文库构建
[0066] 1)样本及试剂
[0067] 取Qubit定量后的血浆游离DNA5ng，使用市售相关试剂进行文库构建。
[0068] 2)对血浆游离DNA进行末端修复及5'端磷酸化修饰
[0069] 反应体系如下：
[0070] DNA 25ul
[0071] 市售末端修复反应混合物 IOul
[0072] 总体积 35ul
[0073] 反应条件：混匀后20°C孵育30分钟。70°C孵育15分钟使酶失活。
[0074] 3)接头连接
[0075] 反应体系如下： 步骤2)反故体系 35ul 办忾快速连接bufTer(2X) SOui
[0076] 丨丨评丨快速迮接酶（25U/ul) Sul 接头ASui 接头BSul
[0077] 总体积 100ul
[0078] 反应条件：混匀后20°C孵育15分钟。65°C20分钟使酶失活。
[0079] 对上述产物进行磁珠纯化。操作流程按照AmpureXPBeads纯化说明书进行。
[0080] 4)修复缺口及PCR扩增
[0081] 反应体系如下： :步骤3)纯化产物 34.5ul 电售反应Buffer(5X) IOul
[0082] 丨丨jff_PCR扩增_ (5U/ul) 0.5ul 办售文库扩增⑴物混合物（IOX)Sui总体积5(M
[0083] 反应条件：72°C孵育15分钟，修补缺口；95°C预变性3分钟；95°C变性15秒，58°C 退火15秒，72°C延伸30秒，共10个循环；最后72°C延伸1分钟。
[0084] 对上述产物进行磁珠纯化。操作流程按照AmpureXPBeads纯化说明书进行。
[0085] 对步骤4)中的PCR纯化产物进行Qubit定量。
[0086] 3、检测：文库质检
[0087] 1)配制2%琼脂糖胶。对对照例和实施例中的两个文库各取IOOng进行琼脂糖胶 电泳鉴定。DNAmarker使用TAKARADL1000marker5ul。鉴定结果如图2所示，图2从左 至右依次为TAKARADL1000marker、实施例文库、对照例文库。从图2可知，本发明的实施 例文库与对照例文库主带（300bp左右）均较明显。
[0088] 2)通过实时荧光定量PCR进一步检测对照文库与实验文库是否有接头污染。对照 例和实施例中的两个文库各取Iul，使用KAPABI0SYSTEMS公司的高通量测序文库定量试 剂盒进行检测。检测结果如图3-图5所示，图4显示对照例文库有少许自连接头污染（熔 解曲线温度82°C处），而本发明的实施例文库无任何自连接头污染。
[0089] 从以上描述中可以看出，上述实施例通过使用本发明的方法构建的血浆游离DNA 文库，从根本上避免了高通量测序文库构建容易出现自连接头污染的现象，提高了文库质 量。
[0090]以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明。凡在本发明的精神和 原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1. 一种血浆游离DNA文库构建方法，采用下述顺序、方法步骤： (1) 对DNA片段进行末端修复成平端及5'端磷酸化，得到修复后DNA， (2) 修复后DNA直接与接头进行平末端连接，纯化，得到连接处带有缺口的含接头 DNA ； (3) 使用PCR聚合酶进行缺口的修补，得到修补后完整的含接头DNA， (4) PCR扩增，纯化，最终获得高通量测序文库。
2. 根据权利要求1所述的构建方法，所述步骤（2)中的接头为接头A和接头B，所述 接头A由SEQ ID N01和SEQ ID N02等摩尔量退火组合而成，所述接头B由SEQ ID N03和 SEQ ID N04等摩尔量退火组合而成， SEQ ID N01 ： 5 ' -AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3 ' SEQ ID N02 ： 5' -AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATC-3'， SEQ ID N03 ： 5' -AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACIIIIIIATC-3'， SEQ ID N04 ： 5, -CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3,，所 述序列3中的六个碱基"IIIIII"为测序平台多样品混合文库中的标签序列。
3. 根据权利要求2所述的构建方法，所述测序平台为为illumina测序平台，所述 " IIIIII "可以为任意六个碱基的随机组合。
4. 根据权利要求3所述的构建方法，所述六个碱基序列在illumina测序平台中为 "ATCACG"，或者为 "CGATGT"，或者为 "TTAGGC"，或者为 "TGACCA"，或者为 "ACAGTG"，或者 为 "GCCAAT"，或者为 "CAGATC"，或者为 "ACTTGA"，或者为 "GATCAG"，或者为 "TAGCTT"， 或者为"GGCTAC"，或者为"CTTGTA"。
5. 根据权利要求1所述的构建方法，所述步骤（1)使用T4DNA聚合酶、大肠杆菌DNA多 聚酶I大片段使DNA修复成平末端。
6. 根据权利要求1所述的构建方法，所述步骤（1)使用T4多核苷酸激酶使DNA平末端 5'端磷酸化。
7. 根据权利要求1所述的构建方法，所述PCR聚合酶为市售DNA聚合酶。
8. 根据权利要求1所述的构建方法，所述DNA片段为血浆游离DNA，大小为100-250bp ; 或者为基因组DNA经超声破碎为100-250bp。
【文档编号】C40B50/06GK104357918SQ201410690349
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月25日 优先权日:2014年11月25日
【发明者】王永利, 吕悦心, 刘玉瑛, 陈初光 申请人:北京阅微基因技术有限公司