血浆特定片段游离dna定量检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种血浆特定片段游离DNA定量检测试剂盒，包括以下组分：用于扩增长度分别为400bp、150bp的TP53基因片段的2个引物对，所述2个引物对的后向引物位点一致，通过前向引物确定所扩增的TP53基因片段的长度；用于扩增内参基因Beta-actin的1个引物对；胎儿基因组DNA。本发明试剂盒在荧光定量PCR技术基础上引入了校准系统，以胎儿基因组DNA为背景DNA，看家基因Beta-actin为内参基因，抑癌基因TP53为目的基因，针对抑癌基因TP53不同长度片段设计扩增引物，采用实时荧光定量PCR法同步扩增Beta-actin基因和TP53基因不同长度片段，可定量检测血浆中特定片段大小的游离DNA含量。
【专利说明】血浆特定片段游离DNA定量检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于分析【技术领域】，涉及一种DNA检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]外周血游离DNA是指外周血中游离于细胞外的部分降解了的机体内源性DNA。其来源主要有三个:细胞凋亡、坏死、分泌。
[0003]1989年，STROUN等对肿瘤患者血液游离DNA进行研究时发现其具有肿瘤细胞DNA的一些特征，因而提出肿瘤患者血液游离DNA可能源自肿瘤细胞。5年后研究者在肿瘤患者的血浆和血清中检测到了癌基因突变，对其进行光谱分析后发现与原发肿瘤相一致。现已证实，肿瘤患者血液中，具有肿瘤生物学特征的DNA主要源于肿瘤细胞坏死和凋亡后自然散发或者在增生活跃时自动释放。另有文献报道，癌变人群血浆中游离100~400bp大小的DNA片段浓度明显高于正常人，可以作为癌症筛查的标志物。
[0004]但现有技术中，尚未见对血浆中特定大小片段的游离DNA进行定量检测的方法。虽然有文献报道，可通过实时荧光定量检测技术检测人基因组中某一个看家基因来对外周血中游离DNA进行定量检测，但由于外周血中DNA片段大小分布多样，这种检测技术并不能获得其中某一特定大小DNA片段的相关信息。
【发明内容】
[0005]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种血浆特定片段游离DNA定量检测试剂盒，可以对与肿瘤发展密切相关的血浆中特定片段大小的游离DNA进行定量检测，结果准确、特异、灵敏。
[0006]经研究，本发明提供如下技术方案:
[0007]1.血浆特定片段游离DNA定量检测试剂盒，包括以下组分:
[0008]用于扩增长度分别为400bp、150bp的TP53基因片段的2个引物对；所述2个引物对的后向引物位点一致，通过前向引物确定所扩增的TP53基因片段的长度；
[0009]用于扩增内参基因Beta-actin的I个引物对；
[0010]胎儿基因组DNA。
[0011]优选的，所述用于扩增长度分别为400bp、150bp的TP53基因片段的2个引物对序列分别如 SEQ ID N0.2 和 SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.6 所示。
[0012]优选的，所述用于扩增内参基因Beta-actin的I个引物对序列分别如SEQ IDN0.7 和 SEQ ID N0.8 所示。
[0013]本发明研究发现，肿瘤患者血浆中150_400bp DNA片段在血浆总游离DNA中的相对含量百分比明显高于健康人群，差异显著，因此，测定血浆中150-400bp DNA片段的浓度可以作为肿瘤筛查的有效手段之一。上述血浆特定片段游离DNA定量检测试剂盒中包括用于扩增长度分别为400bp和150bp的TP53基因片段的2个引物对。以胎儿基因组DNA为背景DNA，看家基因Beta-actin为内参基因，采用实时荧光定量PCR法同步扩增Beta-actin基因和TP53基因不同长度片段，可以分别获得血浆中400bp DNA片段与150bp DNA片段的浓度，然后用150bp DNA片段的浓度减去400bp DNA片段的浓度可获得150_400bp DNA片段的浓度，从而进行肿瘤筛查。
[0014]进一步，所述血浆特定片段游离DNA定量检测试剂盒还包括以下组分:用于扩增长度分别为大于400bp、100bp、60bp的TP53基因片段的3个引物对；所述3个引物对与用于扩增长度分别为400bp、150bp的TP53基因片段的2个引物对的后向引物位点一致，通过前向引物确定所扩增的TP53基因片段的长度。
[0015]优选的，所述用于扩增长度分别为大于400bp、100bp、60bp的TP53基因片段的3个引物对序列分别如 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.4 和 SEQ ID N0.6、SEQ IDN0.5 和 SEQ ID N0.6 所示。
[0016]上述血浆特定片段游离DNA定量检测试剂盒包括用于扩增长度分别为大于400bp、400bp、150bp、100bp、60bp的TP53基因片段的5个引物。以胎儿基因组DNA为背景DNA,看家基因Beta-actin为内参基因，采用实时荧光定量PCR法同步扩增Beta-actin基因和TP53基因不同长度片段，可以分别获得血浆中大于400bp DNA片段、400bp DNA片段、150bp DNA片段、10bp DNA片段、60bp DNA片段的浓度，然后用150bp DNA片段的浓度减去400bp DNA片段的浓度可获得150-400bp DNA片段的浓度，用10bp DNA片段的浓度减去150bp游离DNA片段的浓度可获得100-150bp DNA片段的浓度，用60bp DNA片段的浓度减去10bp DNA片段的浓度可获得60-100bp DNA片段的浓度，从而对血浆中特定片段大小的游离DNA进行定量检测。
[0017]本发明的有益效果在于:本发明试剂盒在荧光定量PCR技术基础上引入了校准系统，以胎儿基因组DNA为背景DNA，看家基因Beta-actin为内参基因，抑癌基因TP53为目的基因，针对抑癌基因TP53不同长度片段设计扩增引物，采用实时荧光定量PCR法同步扩增Beta-actin基因和TP53基因不同长度片段，可定量检测血浆中特定片段大小的游离DNA含量。其中，以胎儿基因组DNA为背景DNA，能够有效去除反应体系的误差和干扰；以Beta-actin基因为内参基因，与TP53基因不同长度片段在同一体系内同步扩增，二者的扩增无相互干扰，特异性好，获得的Cp值可以用来校准扩增体系产生的误差。本发明试剂盒实现了与肿瘤密切相关的血浆中特定大小游离DNA片段的定量检测，排除了其他片段DNA的影响，对肿瘤的筛查、疗效判断、预后等都具有重要意义，其检测灵敏度达到Ing/mL，批间重复性和稳定性达到三类医疗器械注册的要求。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明:
[0019]图1为标准曲线。
[0020]图2为Beta-actin基因扩增曲线。
[0021]图3为TP53基因扩增曲线。
[0022]图4为Beta-actin基因与TP53基因同时扩增图。
[0023]图5为加入胎儿基因组作为背景DNA的样品扩增效果。
[0024] 图6为未加入胎儿基因组作为背景DNA的扩增效果。
【具体实施方式】
[0025]下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。
[0026]由于TP53基因作为一种抑癌基因存在于所有类型的癌细胞中，因此，本发明选择TP53基因作为目的基因。针对其DNA序列，分别设计不同引物进行不同长度DNA片段(长度分别为大于400bp、400bp、150bp、100bp、60bp)的扩增与定量检测。引物设计方法为:固定后向引物位点，通过前向引物确定DNA扩增片段的大小。优选的引物序列如下:
[0027]前向引物:TP53-D400F:5’ -ACACCACTGTGCTCCAGCCT-3，(SEQ ID N0.1)；
[0028]TP53-400F:5，-GTTCACTTGTGCCCTGACTTTC-3，(SEQ ID N0.2)；
[0029]TP53-150F:5，-CTGCTCAGATAGCGATGGTGAGCAG-3，(SEQ ID N0.3)；
[0030]TP53-100F:5，-GGTTGCCCAGGGTCCCCAGGCCTCT-3，(SEQ ID N0.4)；
[0031]TP53-60F:5，-CTCAGCATCTTATCCGAGTGGAA-3’ (SEQ ID N0.5)；
[0032]后向引物:TP53-R:5’ -TGTTTCTGTCATCCAAATACTCCA-3’ (SEQ ID N0.6)。
[0033]其中，TP53-D400F和TP53-R用于扩增长度大于400bp的TP53基因片段；TP53-400F和TP53-R用于扩增长度为400bp的TP53基因片段；TP53_150F和TP53-R用于扩增长度为150bp的TP53 基因片段；TP53-100F和TP53-R用于扩增长度为10bp的TP53基因片段；TP53-60F和TP53-R用于扩增长度为60bp的TP53基因片段。
[0034]同时，选择看家基因Beta-actin为内参基因，并设计内参引物序列如下:
[0035]前向引物:ACTB-F:5’ -TACCACTGGCATCGTGATGGAC-3’ (SEQ ID N0.7)；
[0036]后向引物:ACTB-R:5’ -CATGATGGAGTTGAAGGTAGTTTCG-3’ (SEQ ID N0.8)。
[0037]取胎儿基因组DNA，梯度稀释后作为DNA标准品，其浓度通过Nanodrop分光光度计测定。向25ul PCR反应体系中加入5ul上述DNA标准品作为DNA模板，以ACTB-F和ACTB-R为引物，用罗氏荧光定量PCR仪(Roche LightCycler480)进行荧光定量检测。PCR反应体系具体为:13 μ I mix (包含 10XPCR buffer2 μ 1、SYBR Green 饱和性染料 I μ 1、5U/μ I TaqDNA polymerase0.2μ lU5mM MgCl22 μ 1、1mM dNTP0.5 μ I 和 ddH207.3 μ 1，其中 10XPCRbuffer 包含 10-40mM Tris-Cl、50_200mM 氯化钾、0-5.0mM 二硫苏糖醇(DTT) ,0-1.0mM乙二胺四乙酸二钠钙(EDTA)、0-20vol%乙基苯基聚乙二醇(Nonidet) P-40、0_2.0vol %吐温 20 (Tween20)、30_70vol % 甘油和稳定剂(pH7.0-10.0))，1mM ACTB-F0.5 μ 1，1mMACTB-R0.5 μ 1，5 μ I DNA 模板(lOng/ μ I 血浆 DNA2 μ I 和 lng/ μ I 胎儿基因组 DNA3 μ I)，ddH206 y I。PCR反应程序为:变性阶段:95°C 3min ;扩增阶段:95°C 10s，60。。30s，共40个循环；溶解阶段:55-90°C，每0.2°C采集一次荧光。以Cp值为纵坐标，DNA模板浓度为横坐标，绘制标准曲线，如图1。标准曲线方程为:Y = -1.36471ηχ+32.327，R2 = 0.9951 ;x代表血浆DNA浓度，Y代表Cp值。
[0038]取外周血样品，分离血浆，提取血浆DNA，加入胎儿基因组DNA作为背景DNA，采用实时荧光定量PCR法同步扩增Beta-actin基因与TP53基因不同长度片段，定量检测血浆特定片段游离DNA的浓度。PCR反应体系具体为:13μ I mix(包含10XPCR buffer2y 1、SYBR Green 饱和性染料 I μ 1、5U/μ I Taq DNA polymerase0.2 μ lU5mM MgCl22 μ 1、1mMdNTP0.5 μ I 和 ddH207.3 μ 1，其中 10XPCR buffer 包含 10_40mM Tris-Cl、50_200mM 氯化钾、0-5.0mM 二硫苏糖醇(DTT) ,0-1.0mM乙二胺四乙酸二钠钙(EDTA)、0_20vol %乙基苯基聚乙二醇(Nonidet)P-40、0-2.0vol % 吐温 20 (Tween20)、30_70vol % 甘油和稳定剂(pH7.0-10.0)),1mM ACTB-F0.5 μ I,1mM ACTB-R0.5 μ I,1mM TP53-D400F0.5 μ I,1mMTP53-400F0.5 μ I,1mM TP53-150F0.5 μ I,1mM TP53-100F0.5 μ I,1mM TP53-60F0.5 μ 1，1mM TP53-R0.5 μ 1，5μ I DNA 模板(lOng/μ I 血浆 DNA2 μ I 和 lng/μ I 胎儿基因组Ε)ΝΑ3μ 1)，ddH203 y I。PCR反应程序为:变性阶段:95°C 3min ;扩增阶段:95 °C 1s,600C 30s，共40个循环；溶解阶段:55-90°C，每0.2°C采集一次荧光。获得Cp值，通过标准曲线计算得到血浆中大于400bp、400bp、150bp、100bp、60bp游离DNA片段的浓度。然后，用150bp游离DNA片段的浓度减去400bp游离DNA片段的浓度可以获得150_400bp游离DNA片段的浓度，用10bp游离DNA片段的浓度减去150bp游离DNA片段的浓度可以获得100-150bp游离DNA片段的浓度，用60bp游离DNA片段的浓度减去10bp游离DNA片段的浓度可以获得60-100bp游离DNA片段的浓度。
[0039]图2为Beta-actin基因扩增曲线。图3为TP53基因扩增曲线。图4为Beta-actin基因与TP53基因同时扩增图。从图2、图3和图6可以看出，以Beta-actin基因为内参基因，与TP53基因不同长度片段在同一体系内同步扩增，二者的扩增无相互干扰，特异性好，获得的Cp值可以用来校准扩增体系产生的误差。
[0040]图5为加入胎儿基因组作为背景DNA的样品扩增效果。图6为未加入胎儿基因组作为背景DNA的扩增效果。从图5和图6可以看出，以胎儿基因组DNA为背景DNA，能够有效去除反应体系的误差和干扰。
[0041]Gene Science公司的统计数显示，当血衆中游离DNA浓度大于25ng/ml时，70.8%会发展为癌症患者。本发明采用上述引物和检测方法，对400例健康人群、198例肠癌患者、298例胃癌患者、200例乳腺癌患者血浆中特定大小的游离DNA片段进行了定量检测。结果见表1。
[0042]表1血浆中特定大小游离DNA片段的定量检测结果
【权利要求】
1.血浆特定片段游离DNA定量检测试剂盒，其特征在于，包括以下组分: 用于扩增长度分别为400bp、150bp的TP53基因片段的2个引物对；所述2个引物对的后向引物位点一致，通过前向引物确定所扩增的TP53基因片段的长度； 用于扩增内参基因Beta-actin的I个引物对； 胎儿基因组DNA。
2.如权利要求1所述的血浆特定片段游离DNA定量检测试剂盒，其特征在于，所述用于扩增长度分别为400bp、150bp的TP53基因片段的2个引物对序列分别如SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.6 所示。
3.如权利要求1或2所述的血浆特定片段游离DNA定量检测试剂盒，其特征在于，还包括以下组分: 用于扩增长度分别为大于400bp、100bp、60bp的TP53基因片段的3个引物对；所述3个引物对与用于扩增长度分别为400bp、150bp的TP53基因片段的2个引物对的后向引物位点一致，通过前向引物确定所扩增的TP53基因片段的长度。
4.如权利要求3所述的血浆特定片段游离DNA定量检测试剂盒，其特征在于，所述用于扩增长度分别为大于400bp、100bp、60bp的TP53基因片段的3个引物对序列分别如SEQ IDN0.1 和 SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.4 和 SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6 所示。
5.如权利要求1所述的血浆特定片段游离DNA定量检测试剂盒，其特征在于，所述用于扩增内参基因Beta-actin的I个引物对序列分别如SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示。
【文档编号】C12Q1/68GK104073554SQ201410174787
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年4月28日 优先权日:2014年4月28日
【发明者】王弢, 乐飚, 李宗飞, 张利清, 张丽 申请人:江苏至真生物医药科技有限公司