一种从母体血浆中分离富集游离胎儿dna的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种从母体血浆中分离富集游离胎儿DNA的方法，属于生物技术领 域。
【背景技术】
[0002] 在我国，每年新生儿出生缺陷多达80万至120万，尽早进行产检筛查和针对是最 有效的应对措施，然而目前常规的针对方法皆为有创兴方法，对胎儿和孕妇都有一定的危 险性，因此发展新的无创性产前诊断具有重要的临床意义。1997年Lo等发现在孕妇血浆中 存在少量的游离胎儿DNA(cffDNA)，使得开发母体血浆用于安全无创产前诊断（NIPD)成为 可能。
[0003] 然而孕妇外周血中cffDNA含量极少，仅为血浆总游离DNA的19%左右，并且与大 量的母体血浆游离DNA混杂在一起，给cffDNA的检测和分离造成了极大的困难，如何从孕 妇外周血中高效富集cffDNA已经成为研究的焦点。
[0004] 目前，从母体血浆中分离游离胎儿DNA的方法有电泳分离法和磁珠分离法，但是 由于游离的无细胞胎儿DNA含量极低，实际上很难用电泳分离法等分离不同大小的DNA片 段，电泳法还会损失样本，造成污染，而磁珠分离法则较昂贵，回收率也不高。
[0005] 需要寻找一种有效、简便、成本低廉的游离胎儿DNA分离方法。
【发明内容】
[0006] 为解决上述问题，本发明提供了一种从含DNA的样品中富集分离游离胎儿DNA的 方法。
[0007] 本发明从含DNA的样品中富集游离胎儿DNA的方法，包括如下步骤：
[0008] (1)离心样品，取上清；
[0009] (2)每1ml上清中加入结合缓冲液A0. 8~1ml、细胞裂解液50~150μ 1，混匀，在 25°C~65°C条件下放置20~60min ;
[0010] (3)将步骤（2)处理后的样品加入到二氧化硅结合柱上，离心，先用洗涤缓冲液B 洗脱；
[0011] (4)再用选择性洗涤缓冲液C洗脱，收集洗脱液；
[0012] (5)每1ml洗脱液中加入结合缓冲液A0. 8~1ml，混匀，在25°C~65°C条件下放 置 20 ~60min ;
[0013] (6)重复步骤（3);
[0014] (7)用洗涤缓冲液D洗脱，再用洗脱缓冲液E洗脱，收集洗脱液，即可。
[0015] 其中，结合缓冲液A包含如下成分：
[0016] 硫氰酸胍 100~140g Ο.ΙΜΤι??Ι? 酸 80 ~120ml 0.2M EDTA 溶液 20~24ml Triton X-100 2~3g;
[0017] 洗涤缓冲液B包含如下成分：
[0018] 硫氰酸胍 100~140g
[0019] 0· IMTris 盐酸 80 ~120ml ;
[0020] 选择性洗涤缓冲液C由缓冲液B与5M NaCl溶液以1: (2~4) v/v的比例混合而 成；
[0021] 洗涤缓冲液D为含（5~15)mMNaCl的（50%~90% )的乙醇溶液；
[0022] (50%~90% )的乙醇溶液：是指乙醇溶液的浓度为50%~90% (v/v)。
[0023] 洗脱缓冲液E包含如下成分：
[0024] 0· 005 ~0· 015MTris_ 盐酸
[0025] 0· 0005 ~0· 0015M EDTA。
[0026] 二氧化娃结合柱是二氧化娃核酸结合柱（Qiagen, QIAamp Mini Spin Columns51304)。
[0027] 步骤（I)中，所述离心的方法为：将样品在1800~2000g、4°C条件下离心10min， 将上清再在15000~16000g、4°C条件下离心10~15min，即可。优选地，前一次离心的条 件是：1900g、4°C离心10min ;后一次离心的条件是：16000g、4°C离心10min。
[0028] 步骤（2)中，每1ml上清中加入结合缓冲液AO. 9ml，细胞裂解液100μ 1。;混匀后， 在60°C放置30min
[0029] 步骤（3)中，所述离心是在13000rpm离心1~2min。
[0030] 步骤（3)中，用缓冲液B洗脱的方法是：加入750μ 1洗涤缓冲液B，13000rpm离心 lmin，弃去收集管，换上新的收集管。
[0031] 步骤（5)中，每1ml洗脱液中加入结合缓冲液A0. 9ml，混匀，在60°C放置30min。
[0032] 步骤（7)中，用洗涤缓冲液D洗脱的方法是：加入洗涤缓冲液D，13000rpm离心1~ 2min〇
[0033] 步骤（7)中，用洗涤缓冲液E洗脱的方法是：加入洗涤缓冲液E，静置5分钟， 13000rpm 离心 lmin。
[0034] 所述结合缓冲液A包含如下成分：
[0035] 硫氰酸胍 120g 0.1 MTris.故酸 100mL 0.2M EDTA 溶液 22ml Triton X-100 2.6g；
[0036] 所述结合缓冲液A的pH为7· 2~7· 6,优选为7· 4。
[0037] 所述细胞裂解液是浓度为20mg/ml的蛋白酶K溶液。
[0038] 所述洗涤缓冲液B包含如下成分：
[0039] 硫氰酸胍 120g
[0040] 0· IMTris 盐酸 100mL
[0041] 所述洗涤缓冲液B的pH为6. 2~6. 6,优选为6. 4。
[0042] 所述选择性洗涤缓冲液C由缓冲液B与5M NaCl溶液以1: 3v/v的比例混合而成。
[0043] 所述洗涤缓冲液D为含IOmM NaCl的70 %乙醇溶液。
[0044] 所述洗脱缓冲液E包含如下成分：
[0045] 0· OOlMTris-盐酸
[0046] 0· 0001M EDTA。
[0047] 所获得的DNA片段长度为75bp~500bp。
[0048] DNA片段长度主要为IOObp~300bp。
[0049] 本发明方法能从母体血浆中有效富集低含量的游离胎儿DNA，方法简单，实用，有 效，适合用于多个样品的同时处理，无需酚-氯仿等对人体有害的物质，获得的游离胎儿 DNA纯度高，可直接用于下游的PCR、实时荧光定量PCR和测序等，具有较好的应用前景。
[0050] 样品可以是新鲜或冷冻的血浆。起始样本体积为600μ 1~3ml，洗脱体积为 10 μ 1~100 μ 1。本发明方法获得的DNA片段长度为75bp~500bp，主要富集片段长度为 100~300bp的游离DNA。
[0051] 本发明方法无需酚-氯仿提取，只需将核酸特异地结合于二氧化硅膜结合柱上， 并通过缓冲液洗涤步骤后完全除去二价阳离子和蛋白质等PCR抑制剂，再次洗涤后，再分 步获得洗脱液，用洗脱液C获得<500bp的小片段DNA，再次过柱纯化，洗涤去除杂质后，最后 洗脱，可获得富集的游离胎儿DNA，并可最大限度去除母体背景的DNA干扰。
[0052] 该技术方法包括2个循环提取过程，共7个步骤（裂解，结合，洗涤，部分洗脱，再 结合，洗涤，洗脱）。
[0053] 技术路线图如附图1所示。
[0054] 具体的技术步骤如下：
[0055] 1.血浆处理方法
[0056] 低速-高速两步离心法获得无细胞血浆
[0057] (1)将刚获得的BD采血管（EDTA全血，<2hr)在4°C，1900Xg离心10min ;
[0058] (2)轻轻吸取上清液于15ml锥底形离心管中，切勿接触到上清液与下层的界面膜 状物；
[0059] (3)再在4°C，16000Xg离心10min，该步骤可进一步去除细胞碎片及其附着于上 的核酸；
[0060] (4)小心转移上清液于新的保存管中，勿接触或扰动底部的沉淀物；
[0061] (5)血浆即可用于提取核酸或置于-80°C长期储存备用，使用前在室温解冻，但 忌再次冻存。
[0062] 2.提取步骤
[0063] (1)裂解
[0064] 在生物流体中，自由循环的核酸通常被结合到蛋白质或笼罩在囊泡上，需要以一 种有效的裂解步骤，以释放核酸，选择性地结合到二氧化硅核酸结合柱上。
[0065] (2)结合
[0066] 通过结合缓冲液A，可形成高盐及合适的pH条件，确保核酸选择性结合到的二氧 化硅核酸结合柱上。
[0067] (3)洗涤
[0068] 通过洗涤缓冲液B，核酸仍然与膜结合，而蛋白质，二价阳离子等杂质、残留污染物 被有效冲走。
[0069] (4)选择性洗脱
[0070] 通过选择性洗脱缓冲液C，膜上结合的<500bp的小片段核酸被洗脱下来。
[0071] (5)再结合
[0072] 收集步骤（4)的洗脱液，与等体积的结合缓冲液A混合，小片段DNA被重新吸附于 二氧化硅结合柱上。
[0073] (6)再洗涤
[0074] 同步骤3。
[0075] (7)洗脱
[0076] 使用缓冲液D洗脱；
[0077] 使用洗脱缓冲液E，将膜上结合的小片段DNA洗脱下来。洗脱体积20-100μ 1，可 低至1〇μ 1，低洗脱体积可以获得高浓度的DNA，用于后续定量PCR，测序等下游应用，可增 加检测灵敏度。
[0078] (8)制备的无细胞游离DNA，24小时以内使用贮存在2_8°C下，长期需贮存 于-15°C~-30°C。
[0079] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容做进一步地详细说 明。但不应理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要求书 的内容所实现的技