具有改善的表达、活性和/或稳定性的纤维素酶变体,及其用图
【专利说明】具有改善的表达、活性和/或稳定性的纤维素酶变体，及其 用途
[0001] 本申请是申请人于2010年6月3日提交的题为"具有改善的表达、活性和/或稳 定性的纤维素酶变体，及其用途"的中国专利申请201080024295. 6号的分案申请。
[0002] 关于在联邦赞助的研宄和研发中产生的发明的权利的陈述
[0003] 相关申请的交叉引用
[0004] 本申请要求2009年6月3日提交的美国临时申请号61/183,959的权益，其通过 引用全部整合到本文中。
[0005] 本发明是在政府资助下产生的，具有能源部授予的条件授予编号： DE-FC36-08G018078。政府对本发明享有一定权利。
[0006] I.领域
[0007] 本发明涉及酶，特别是纤维素酶变体。还描述了编码纤维素酶变体的核酸，包含纤 维素酶变体的组合物，鉴别其它有效的纤维素酶变体的方法，以及其使用方法。
[0008] II.背景
[0009] 纤维素和半纤维素是由光合作用产生的最丰富的植物材料。它们可以被多种微生 物（例如，细菌、酵母和真菌）降解并用作能源，所述微生物产生能够将多聚底物水解为单 体糖的胞外酶（Aro等人，J Biol Chem, 276:24309-24314, 2001)。由于不可再生来源途径 的限制，纤维素成为主要的可再生能量来源的可能性是极大的（Krishna等人，Bioresource Tech, 77:193-196, 2001)。通过生物学过程有效的利用纤维素是克服食物、饲料和燃料短缺 的一种方法（Ohmiya 等人，Biotechnol Gen Engineer Rev, 14:365-414, 1997) 〇
[0010] 纤维素酶是水解纤维素（β-1，4-葡聚糖或β D-糖苷连接），导致葡萄糖、 纤维二糖、纤维寡糖等形成的酶。纤维素酶传统上分为三大类：内切葡聚糖酶（EC 3.2. L 4) ( "EG"）、外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶（EC 3.2. L 91) ( "CBH"）和β-葡 糖苷酶（β -D-葡糖苷葡糖水解酶，EC 3. 2. L 21) ( "BG"）（Knowles等人，TIBTECH 5:255-261，1987 ;和 Schulein, Methods Enzymol, 160:234-243, 1988)。内切葡聚糖 酶主要作用在纤维素纤维的无定形部分上，而纤维二糖水解酶还能够降解结晶纤维素 (Nevalainen和Penttila，Mycota, 303-319, 1995)。因此，使结晶纤维素有效溶解需要纤维 素酶系统中存在纤维二糖水解酶（Suurnakki等人，Cellulose 7:189-209,2000)。β-葡糖 苷酶的作用是从纤维二糖、纤维寡糖和其他葡糖苷中释放出D-葡萄糖单元（Freer，J Biol Chem, 268:9337-9342, 1993)。
[0011] 已知多种细菌、酵母和真菌生产纤维素酶。一些真菌生产完整的纤维素酶系统，所 述系统能够降解结晶形态的纤维素，使得通过发酵可以方便的大量生产纤维素酶。由于许 多酵母，例如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)缺少水解纤维素的能力，因此丝状真 菌扮演了特殊的角色（参见例如，Wood 等人，Methods in Enzymology, 160:87-116, 1988)。
[0012] CBH、EG和BG的真菌纤维素酶分类可以进一步扩展至在每个分类中包括多个组 分。例如，已经从多种真菌来源中分离出多个CBH、EG和BG，包括里氏木霉（Trichoderma reesei)(也称为红褐肉座菌（Hypocrea jecorina))，其含有以下已知基因：两种CBHJP CBHI("CBHΓ'）和CBHII("CBH2"）；至少8种EG，即EGI、EGII、EGIII、EGIV、EGV、EGVI、 EGVII 和 EGVIII ;以及至少 5 种 BG，即 BG1、BG2、BG3、BG4 和 BG5。EGIV、EGVI 和 EGVIII 也 具有木葡聚糖酶的活性。
[0013] 为了将结晶纤维素有效转化为葡萄糖，需要完整的纤维素酶系统，其包括来自 CBH、EG和BG分类中的每种的组分，以及水解结晶纤维素时较不有效的分离组分（Filho等 人，Can J Microbiol, 42:1-5, 1996)。在来自不同分类的纤维素酶组分之间已观察到协同 关系。特别是EG类纤维素酶和CBH类纤维素酶协同的相互作用，更有效的降解纤维素。
[0014] 本领域已知出于增强去垢剂组合物的清洁能力、用作软化剂、用于改善棉织物的 触感和外观等目的，纤维素酶在处理纺织品时是有效的（Kumar等人，Textile Chemist and Colorist, 29:37-42, 1997)。已经描述了具有改善的清洁性能（美国专利号4, 435, 307 ;和 英国申请号2, 095, 275和2, 094, 826)的，和用于处理织物来改善纺织品的触感和外观（美 国专利号5, 648, 263、5, 691，178和5, 776, 757 ;英国申请号1，358, 599)的含纤维素酶的去 垢剂组合物。因此，在真菌和细菌中生产的纤维素酶已受到了极大关注。特别是，木霉属物 种（Trichoderma spp)(例如长枝木霉（Trichoderma Iongibrachiatum)或里氏木霉）的 发酵已表现出产生能够降解结晶形态的纤维素的完整纤维素酶系统。
[0015] 虽然之前已描述过纤维素酶组合物，仍然需要新的和改良的纤维素酶组合物。改 良的纤维素组合物可用于家用去垢剂、纺织品处理、生物质转化和造纸。表现出改善的表 达、活性和稳定性的纤维素酶是特别令人感兴趣的。
[0016] III.概述
[0017] 本发明涉及酶，特别是纤维素酶变体。还描述了编码纤维素酶变体的核酸、包含纤 维素酶变体的组合物、鉴别其它有效的纤维素酶变体的方法，以及其使用方法。
[0018] 本发明提供了纤维素酶变体，其中所述变体是具有纤维素酶活性的成熟形式，并 在选自 5, 18, 19, 28, 30, 32, 35, 38, 79, 80, 89, 100, 102, 103, 104, 105, 111，117, 119, 121，12 5, 126, 133, 137, 138, 139, 140, 141，143, 150, 158, 162, 177, 180, 181，182, 185, 186, 188, 190 ，191，192, 193, 196, 201，207, 225, 226, 228, 229, 230, 233, 234, 236, 240, 243, 245, 251，252， 258, 267, 268, 274, 292, 293, 303, 304, 306, 307, 313, 319, 322, 328, 331，338, 340, 346, 361， 362, 363, 364, 365, 371，384, 394, 396, 400, 406, 407, 414, 417, 422, 427, 431，433, 436, 440， 441，443, 444, 445和447的一个或多个位置上包含取代，其中所述位置通过对应如SEQ ID N0:3所列的参考纤维二糖水解酶II (CBH2)的氨基酸序列编号。在一些实施方案中，在一 个或多个位置上的取代导致与参考CBH2相比具有改善的表达、活性和/或稳定性的纤维素 酶变体。在一些实施方案中，所述变体在选自（i)由63, 77, 129, 146, 147, 151，153, 157, 16 1，189, 194, 197, 203, 204, 208, 211，237, 239, 244, 247, 254, 277, 281，285, 288, 289, 294, 327 ，339, 344, 356, 378, 382 和 405 组成的第一组；或（ii)由 94, 98, 107, 120, 134, 144, 147, 15 4, 178, 179, 206, 210, 214, 231，232, 266, 272, 275, 316, 323, 343, 360, 380, 381，386, 399, 410 ，413, 416, 426和429组成的第二组的一个或多个另外的位置上包含另外的取代，其中另外 的位置通过对应如SEQ ID N0:3所列的参考纤维二糖水解酶II (CBH2)的氨基酸序列编号。 在一些实施方案中，在一个或多个位置上的取代选自1，2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9和10个位置。
[0019] 在另一个方面，本发明提供了纤维素酶变体，其中所述变体是具有纤维素酶活性 的成熟形式并在选自 63, 77, 129, 146, 147, 151，153, 157, 161，189, 194, 197, 203, 204, 208， 211，237, 239, 244, 247, 254, 277, 281，285, 288, 289, 294, 327, 339, 344, 356, 378, 382 和 405 的一个或多个位置上包含取代，其中所述位置通过对应如SEQ ID NO:3所列的参考纤维二 糖水解酶II (CBH2)的氨基酸序列编号，且其中当纤维素酶变体包含单个取代时，所述单个 取代不是K/E，R/Q，N/D，Q/E，D/N或E/Q取代。在一些实施方案中，在一个或多个位置上的 取代导致与参考CBH2相比具有改善的表达、活性和/或稳定性的纤维素酶变体。分离的纤 维素酶变体在选自（i)由 5, 18, 19, 28, 30, 32, 35, 38, 79, 80, 89, 100, 102, 103, 104, 105, 111 ，117, 119, 121，125, 126, 133, 137, 138, 139, 140, 141，143, 150, 158, 162, 177, 180, 181，182， 185, 186, 188, 190, 191，192, 193, 196, 201，207, 225, 226, 228, 229, 230, 233, 234, 236, 240, 2 43, 245, 251，252, 258, 267, 268, 274, 292, 293, 303, 304, 306, 307, 313, 319, 322, 328, 331，33 8, 340, 346, 361，362, 363, 364, 365, 371，384, 394, 396, 400, 406, 407, 414, 417, 422, 427, 431 ，433, 436, 440, 441，443, 444, 445 和 447 组成的第一组；或（ii)由 94, 98, 107, 120, 134, 144 ，147, 154, 178, 179, 206, 210, 214, 231，232, 266, 272, 275, 316, 323, 343, 360, 380, 381，386， 399, 410, 413, 416, 426,和429组成的第二组的一个或多个另外的位置上包含另外的取代， 其中另外的位置通过对应如SEQ ID NO:3所列的参考纤维二糖水解酶II (CBH2)的氨基酸 序列编号。在一些实施方案中，在一个或多个位置上的取代选自1，2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9和10 个位置。
[0020] 在另一个方面，本发明提供了纤维素酶变体，其中所述变体是具有纤维素酶活性 的成熟形式并在选自 94, 98, 107, 120, 134, 144, 147, 154, 178, 179, 206, 210, 214, 231，232， 266, 272, 275, 316, 323, 343, 360, 380, 381，386, 399, 410, 413, 416, 426,和 429 的一个或多 个位置上包含取代，其中所述位置通过对应如SEQ ID N0:3所列的参考纤维二糖水解酶 II (CBH2)的氨基酸序列编号，且其中当纤维素酶变体包含单个取代时，所述单个取代不是 V94E, P98L, E107Q, M120L, M134G, M134L, M134V, L144G, L144R, L144S, T154A, A178V, L179C, V 206L, S210L, S210R, T214M, T214Y, G231P, G231I, G231A, G231N, G231S, G231T, T232V, H266S, H266A, W272A, W272D, W272Y, N275L, S316P, V323L, V323N, V323Y, G360R, S380T, A381T, E399N ，E399D，R413Y，R413P,和A416G之一。在一些实施方案中，在一个或多个位置上的取代导 致与参考CBH2相比具有改善的表达、活性和/或稳定性的纤维素酶变体。在一些实施方 案中，所述变体在选自（i)由 5, 18, 19, 28, 30, 32, 35, 38, 79, 80, 89, 100, 102, 103, 104, 105 ，111，117, 119, 121，125, 126, 133, 137, 138, 139, 140, 141，143, 150, 158, 162, 177, 180, 181， 182, 185, 186, 188, 190, 191，192, 193, 196, 201，207, 225, 226, 228, 229, 230, 233, 234, 236, 2 40, 243, 245, 251，252, 258, 267, 268, 274, 292, 293, 303, 304, 306, 307, 313, 319, 322, 328, 3 31，338, 340, 346, 361，362, 363, 364, 365, 371，384, 394, 396, 400, 406, 407, 414, 417, 422, 4 27, 431，433, 436, 440, 441，443, 444, 445 和 447 组成的第一组，或（ii)由 63, 77, 129, 146 ，147, 151，153, 157, 161，189, 194, 197, 203, 204, 208, 211，237, 239, 244, 247, 254, 277, 281 ，285, 288, 289, 294, 327, 339, 344, 356, 378, 382 和 405 组成的第二组的一个或多个另外的 位置上包含另外的取代，其中另外的位置通过对应如SEQ ID N0:3所列的参考纤维二糖水 解酶II(CBH2)的氨基酸序列编号。在一些实施方案中，在一个或多个位置上的取代选自 1，2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 和 10 个位置。
[0021] 本发明还提供了纤维素酶变体，其中所述变体是具有纤维素酶活性的成熟形式并 在选自111，144, 154, 162,410和413的1至6个位置上包含取代，其中所述纤维素酶变体 包含：第111位的亮氨酸或丝氨酸；第144位的亮氨酸、谷氨酰胺或色氨酸；第154位的苏 氨酸、半胱氨酸或缬氨酸；第162位的酪氨酸或天冬酰胺；第410位的精氨酸或丝氨酸；和 第413位的丝氨酸、色氨酸或酪氨酸；其中所述位置通过对应如SEQ ID NO:3所列的参考纤 维二糖水解酶Π (CBH2)的氨基酸序列编号，且其中当纤维素酶变体包含单个取代时，所述 单个取代不是S413Y取代。
[0022] 本发明还提供了纤维素酶变体，其中所述变体是具有纤维素酶活性的成熟形式并 在选自98, 194, 313, 316, 384和443的1至6个位置上包含取代，其中所述纤维素酶变体包 含：第98位的脯氨酸或亮氨酸；第194位的赖氨酸、半胱氨酸或谷氨酸；第313位的丝氨酸 或苏氨酸；第316位的丝氨酸或脯氨酸；第384位的甘氨酸、半胱氨酸或谷氨酰胺；和第443 位的天冬酰胺或异亮氨酸；其中所述