适合用于产生能够水解纤维素物质 的酶。培养运用本领域已知方法，在含有碳源、氮源和无机盐的合适的营养培养基中发生。 本领域已知适合生长和纤维素酶生产的合适的培养基、温度范围和其他条件。作为非限制 性的例子，通过里氏木霉生产纤维素酶的正常温度范围是24°C到28°C。
[0116] 通常，全纤维素酶制品以发酵生产的样子使用，不进行或极少进行回收和/或纯 化。例如，一旦纤维素酶由细胞分泌到细胞培养基中，就可以使用含有纤维素酶的细胞培养 基。在一些实施方案中，全纤维素酶制品含有发酵物质的未分级分离的成分，包括细胞培养 基、细胞外酶和细胞。可选地，全纤维素酶制品可用任何方便的方法加工，如，通过沉淀、离 心、亲和、过滤或本领域已知的任何其他方法。在一些实施方案中，全纤维素酶制品例如可 以被浓缩，然后不经进一步纯化而被使用。在一些实施方案中，全纤维素酶制品含有降低细 胞活力或杀死细胞的化学剂。在一些实施方案中，使用本领域已知方法裂解或透化处理细 胞。
[0117] III.分子生物学
[0118] 在一个实施方案中，本发明提供了变体cbh2基因在丝状真菌中功能性的启动子 的控制下表达。因此，本发明依赖于重组遗传性领域中的常规技术（参见例如，Sambrook 等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual，第 2 版，1989 ;Kriegler, Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual, 1990;和 Ausubel 等人编著，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY1Greene Publishing and Wiley-IntersciencejNew York, 1994)〇
[0119] 突夺cbh2核酸序列的方法
[0120] 本发明考虑了任何本领域已知可导入突变的方法。
[0121] 本发明涉及变体CBH2的表达、纯化和/或分离，以及用途。这些酶优选的通过重组 方法制备，使用来自红褐肉座菌的cbh2基因。可以使用进行或不进行纯化的发酵培养基。
[0122] 在从红褐肉座菌中分离和克隆cbh2基因后，使用本领域已知的其它方法，例如定 点诱变，产生与表达的CBH2变体中取代氨基酸对应的取代、添加或缺失。同样，定点诱变和 在DNA水平向表达蛋白质中掺入氨基酸改变的其它方法是本领域已知的（Sambrook等人， 见上文；和Ausubel等人，见上文）。
[0123] 通过多种本领域已知的方法制备编码红褐肉座菌CBH2的氨基酸序列变体的DNA。 这类方法包括但不限于通过对较早制备的编码红褐肉座菌CBH2的DNA进行定点（或寡核 苷酸-介导的）诱变、PCR诱变和盒诱变来制备。
[0124] 定点诱变是制备取代变体的优选方法。该技术是本领域普遍已知的（参见例如， Carter 等人，Nucleic Acids Res. 13:4431-4443 (1985)和 Kunkel 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488(1987))。简而言之，在进行DNA的定点诱变中，通过首先将编码目的突变 的寡核苷酸与此类起始DNA的单链杂交，来改变起始DNA。在杂交后，使用DNA聚合酶合成 完整的第二链，使用杂交的寡核苷酸作为引物，并使用起始DNA的单链作为模板。因此，将 编码目的突变的寡核苷酸掺入到所获得的双链DNA中。
[0125] PCR诱变也适合制造起始多肽（即，红褐肉座菌CBH2)的氨基酸序列变体。参 见 Higuchi，在 PCR Protocols，第 177-183 页（Academic Press,1990);和 Vallette 等 人，Nuc. Acids Res. 17:723-733 (1989)。还参见例如 Cadwell 等人，PCR Methods and Applications，第2卷，28-33 (1992)。简而言之，当使用少量模板DNA作为PCR的起始材料 时，可以使用与模板DNA的对应区域的序列轻微差异的引物来产生相对大量的特定DNA片 段，所述片段仅在引物不同于模板的位置与模板序列不同。
[0126] 制备变体的另一种方法，盒诱变，是基于Wells等人，Gene 34:315-323(1985)描 述的技术。起始材料是包含待突变的起始多肽DNA的质粒（或其它载体）。鉴别了起始DNA 中待突变的密码子。在鉴别的突变位点的每一侧必须有独特的限制性内切核酸酶位点。如 果不存在此类限制性位点，可以使用上述寡核苷酸-介导的诱变方法，在起始多肽DNA的合 适位置导入它们来产生它们。在这些位点切割质粒DNA来将其线性化。使用标准程序合成 双链寡核苷酸，所述双链寡核苷酸编码在限制性位点之间含有目的突变的DNA序列，其中 两条寡核苷酸链是分别合成的，然后使用标准技术将所述链杂交在一起。该双链寡核苷酸 被称为盒。该盒被设计为具有与线性化质粒的末端相容的5'和3'末端，使其可以直接连 接到质粒中。现在，所述质粒含有突变DNA序列。
[0127] 可选的或另外的，可以确定编码变体CBH2的目的氨基酸序列，并可以合成产生编 码此类氨基酸序列变体的核酸序列。
[0128] 如此制备的变体CBH2可以进行进一步修饰，通常依赖于纤维素酶的预期用途。此 类修饰可以涉及氨基酸序列的进一步改变，与异源多肽融合和/或共价修饰。
[0129] IV. cbh2 核酸和 CBH2 多肽
[0130] A.夺体cbh2_塑核酸
[0131] SEQ ID NO: 1显示了野生型cbh2的核酸序列。本发明涵盖了编码本文所述的变体 纤维素酶的核酸分子。核酸可以是DNA分子。
[0132] 在将编码CBH2变体的DNA序列克隆到DNA构建体中后，使用DNA转化微生物。用 于表达根据本发明的变体CBH2目的的待转化微生物可以有利的包括源自木霉属物种的菌 株。因此，用于制备根据本发明的变体CBH2纤维素酶的优选模式包括用DNA构建体转化木 霉属物种宿主细胞，所述构建体至少包含编码一部分或全部变体CBH2的DNA片段。DNA构 建体通常可以与启动子功能性连接。然后，转化的宿主细胞生长在表达目的蛋白质的条件 下。然后，可以将目的的蛋白质产物纯化至基本同质。
[0133] 然而，实际上，编码变体CBH2的给定DNA的最佳表达载体可以不同于红褐肉座菌。 因此，在与变体CBH2的来源生物具有系统发生相似性的转化宿主中表达蛋白质可以是最 有利的。在可选的实施方案中，可以使用黑曲霉（Aspergillus niger)作为表达载体。关 于使用黑曲霉的转化技术的描述，参见WO 98/31821，其公开文本通过引用全文整合到本文 中。
[0134] 因此，仅出于示例的目的提供曲霉属物种表达系统的本说明，它们作为表达本发 明的变体CBH2的一个选择。然而，本领域技术人员可以倾向于根据需要在不同宿主细胞中 表达编码变体CBH2的DNA，应该理解，在确定最佳表达宿主时应该考虑变体CBH2的来源。 此外，本领域技术人员能够利用本领域可获得的工具，通过常规技术选择特定基因的最佳 表达系统。
[0135] B.夺体CBH2多肽
[0136] 本发明的变体CBH2具有源自前体CBH2的氨基酸序列的氨基酸序列。通过取代、缺 失或插入前体氨基酸序列一个或多个氨基酸，CBH2变体的氨基酸序列不同于前体CBH2氨 基酸序列。在优选的实施方案中，前体CBH2是红褐肉座菌CBH2。在实施例2(SEQ ID N0:3) 中显示了红褐肉座菌CBH2的成熟氨基酸序列。因此，本发明涉及这样的CBH2变体，所述变 体含有等价于红褐肉座菌CBH2的特定鉴别残基的位置上的氨基酸残基。如果与红褐肉座 菌CBH2中的该残基的特定残基或部分同源（即，在初级或三级结构中位置对应）或功能类 似，则CBH2同源物的残基（氨基酸）与红褐肉座菌CBH2的残基是等价的（即，具有相同或 相似的功能性能力而化学的或结构性的结合、反应或相互作用）。如本文中使用的，编号意 在与成熟CBH2氨基酸序列（SEQ ID N0:3)的编号的相对应。
[0137] 比对氨基酸序列来确定同源性优选的使用"序列比较算法"来确定。可以通过 例如 Smith & Waterman，Adv.Appl. Math. 2:482(1981)的局部同源性算法；Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443(1970)的同源性比对算法；Pearson & Lipman, Proc. Nat'I Acad. Sci. USA 85:2444(1988)的搜索相似性方法，通过这些算法的计算机化运 用（GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA，在 Wisconsin Genetics Software Package 中， Genetics Computer Group, 575Science Dr. ,Madison, Wis.)或者通过视觉观察（visual inspection)，来执行用于比较的优化的序列比对，视觉观察可以使用绘图包，例如 Chemical Computing Group, Montreal Canada 的 Μ0Ε〇
[0138] 适合确定序列相似性的算法的实例是BLAST算法，描述在Altschul等人，J. Mol. Biol. 215:403-410(1990)中。用于实施BLAST分析的软件可通过国立生物技术信息中心 (www. ncbi. nlm. nih. gov)公开获得。该算法涉及首先鉴别高分序列对（HSP)，这是通过在 查询序列中鉴别短的字节长度W，当所述字节与数据库序列中相同长度的字节比对时，匹 配或者满足一定的正阈值分数T。这些初始的相邻字节命中作为寻找含有它们的较长HSP 的起始点发挥作用。沿着比较的两条序列中任一向两个方向扩展字节命中，只要可以增加 累积比对分数。当：累积比对分数从达到的最大值下降量X ;累积分数达到0或更低；或者 达到任一条序列的末端时，停止字节命中的延伸。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵 敏度和速度。BLAST程序使用的缺省值为：字节长度（W)为11，BL0SUM62打分矩阵（参见 Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915(1989))比对（B)为 50,期望值 (E)为10, M' 5, Ν' 4,以及比较两条链。
[0139] 然后，BLAST算法实施两条序列之间的相似性统计学分析（参见例如，Karlin & Altschul, Proc. Nat' I. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993))。BLAST 算法提供的一种相似 性测量是最小总概率（P(N))，其提供了在两条核苷酸或氨基酸序列之间的匹配可以偶然发 生的概率的指示。例如，如果在测试氨基酸序列与蛋白酶氨基酸序列的比较中，最小总概率 低于约0. 1，更优选的低于约0. 01，最优选的低于约0. 001，则认为氨基酸序列与蛋白酶是 相似的。
[0140] 出于本发明的目的，可以通过本领域已知的计算机程序适当的确定同一性的 程度，例如在 GCG 程序包（Program Manual for the Wisconsin Package，第 8 版，1994 年 8 月,Genetics Computer Group,575 Science Drive, Madison, ffis. , USA 53711) (Needleman，S.B.和 Wunsch，C.D·，（1970) ,Journal of Molecular Biology, 48, 443-45)中 提供的GAP，使用具有下列设定的GAP用于多核苷酸序列比较：GAP生成罚分为5. 0, GAP延 伸罚分为〇. 3。
[0141] 可以使用里氏木霉CBH2和其他纤维素酶之间的结构比对来鉴别在具有中等至 高度同源性的其他纤维素酶中的等价/对应位置，所述同源性例如与里氏木霉CBH2 (SEQ ID N0:3)约 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、 87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或者甚至 99% 的同 源性。获得结构比对的一种方法是使用来自GCG包的Pile Up程序，使用空位罚分的缺 省值，即空位生成罚分为3. 0,空位延伸罚分为0. 1。其他结构比对方法包括疏水簇分析 (Gaboriaud 等人，FEBS Letters, 224:149-155, 1987)和反向联系（reverse threading) (Huber 和 Torda，Protein Science,7:142-149, 1998)〇
[0142] 如图I提供了成熟形态的各种参照纤维素酶的示例性比对。参照纤维素酶包括： 红褐肉座菌（也称为里氏木霉）CBH2(SEQ ID N0:3)、康宁肉座菌CBH2(SEQ ID N0:4)、特 异腐质霉CBH2(SEQIDN0:5)、解纤维素醋弧菌CBH2(SEQIDN0 :6)、二孢蘑菇CBH2(SEQ ID NO: 7)、尖镰孢EG (SEQ ID NO: 8)、黄孢原毛平革菌CBH2 (SEQ ID NO: 9)、埃默森篮状菌 CBH2(SEQIDN0:10)、褐色嗜热裂孢菌6B/E3CBH2(SEQIDN0:11)、褐色嗜热裂孢菌6A/E2 EG(SEQ ID NO: 12)和粪肥纤维单胞菌 CenA EG(SEQ ID NO: 13)。使用 ClustalW 和 MUSCLE 多序列比对算法比对序列。表1提供了矩阵，其显示图1的序列比对的纤维素酶百分比同 一性。
[0143] 表1.纤维素酶百分比同一性矩阵
[0144] *
[0145]
【主权项】
1. 纤维素酶变体，其中所述变体是具有纤维素酶活性的成熟形式并在选自5, 18, 19, 2 8, 30, 32, 35, 38, 79, 80, 89, 100, 102, 103, 104, 105, 111，117, 119, 121，125, 126, 133, 137, 13 8, 139, 140, 141，143, 150, 158, 162, 177, 180, 181，182, 185, 186, 188, 190, 191，192, 193, 196 ，201，207, 225, 226, 228, 229, 230, 233, 234, 236, 240, 243, 245, 251，252, 258, 267, 268, 274， 292, 293, 303, 304, 306, 307, 313, 319, 322, 328, 331，338, 340, 346, 361，362, 363, 364, 365, 3 71，384, 394, 396, 400, 406, 407, 414, 417, 422, 427, 431，433, 436, 440, 441，443, 444, 445 和 447的一个或多个位置上包含取代，其中所述位置通过对应如SEQ ID NO:3所列的参考纤维 二糖水解酶II (CBH2)的氨基酸序列编号。
2. 权利要求1的纤维素酶变体，其中所述变体在选自 (i) 由 63, 77, 129, 146, 147, 151，153, 157, 161，189, 194, 197, 203, 204, 208, 211，237, 2 39, 244, 247, 254, 277, 281，285, 288, 289, 294, 327, 339, 344, 356, 378, 382 和 405 组成的第 一组；或 (ii) 由 94, 98, 107, 120, 134, 144, 147, 154, 178, 179, 206, 210, 214, 231，232, 266, 272， 275, 316, 323, 343, 360, 380, 381，386, 399, 410, 413, 416, 426 和 429 组成的第二组 的一