个或多个另外的位置上包含另外的取代，其中所述另外的位置通过对应如SEQ ID NO:3所列的参考纤维二糖水解酶II(CBH2)的氨基酸序列编号。
3. 纤维素酶变体，其中所述变体是具有纤维素酶活性的成熟形式并在选自63, 77, 129 ，146, 147, 151，153, 157, 161，189, 194, 197, 203, 204, 208, 211，237, 239, 244, 247, 254, 277， 281，285, 288, 289, 294, 327, 339, 344, 356, 378, 382 和 405 的一个或多个位置上包含取代， 其中所述位置通过对应如SEQ ID NO: 3所列的参考纤维二糖水解酶II (CBH2)的氨基酸序 列编号，且其中当所述纤维素酶变体包含单个取代时，所述单个取代不是K/E，R/Q，N/D，Q/ E，D/N或E/Q取代。
4. 权利要求3的纤维素酶变体，其中所述变体在选自 (i) 由 5, 18, 19, 28, 30, 32, 35, 38, 79, 80, 89, 100, 102, 103, 104, 105, 111，117, 119, 12 1，125, 126, 133, 137, 138, 139, 140, 141，143, 150, 158, 162, 177, 180, 181，182, 185, 186, 188 ，190, 191，192, 193, 196, 201，207, 225, 226, 228, 229, 230, 233, 234, 236, 240, 243, 245, 251， 252, 258, 267, 268, 274, 292, 293, 303, 304, 306, 307, 313, 319, 322, 328, 331，338, 340, 346, 3 61，362, 363, 364, 365, 371，384, 394, 396, 400, 406, 407, 414, 417, 422, 427, 431，433, 436, 44 0, 441，443, 444, 445 和 447 组成的第一组；或 (ii) 由 94, 98, 107, 120, 134, 144, 147, 154, 178, 179, 206, 210, 214, 231，232, 266, 272， 275, 316, 323, 343, 360, 380, 381，386, 399, 410, 413, 416, 426,和 429 组成的第二组 的一个或多个另外的位置上包含另外的取代，其中另外的位置通过对应如SEQ ID N0:3所列的参考纤维二糖水解酶II(CBH2)的氨基酸序列编号。
5. 纤维素酶变体，其中所述变体是具有纤维素酶活性的成熟形式并在选自94, 98, 107 ，120, 134, 144, 147, 154, 178, 179, 206, 210, 214, 231，232, 266, 272, 275, 316, 323, 343, 360， 380, 381，386, 399, 410, 413, 416, 426,和429的一个或多个位置上包含取代，其中所述位置 通过对应如SEQ ID NO: 3所列的参考纤维二糖水解酶II (CBH2)的氨基酸序列编号，且其中 当纤维素酶变体包含单个取代时，所述单个取代不是V94E，P98L，E107Q，M120L，M134G，M134 L, M134V, L144G, L144R, L144S, T154A, A178V, L179C, V206L, S210L, S210R, T214M, T214Y, G23 IP, G231I, G231A, G231N, G231S, G231T, T232V, H266S, H266A, W272A, W272D, W272Y, N275L, S3 16P, V323L, V323N, V323Y, G360R, S380T, A381T, E399N, E399D, R413Y, R413P,和 A416G 之一。
6. 权利要求5的纤维素酶变体，其中所述变体在选自 (i) 由 5, 18, 19, 28, 30, 32, 35, 38, 79, 80, 89, 100, 102, 103, 104, 105, 111，117, 119, 12 1，125, 126, 133, 137, 138, 139, 140, 141，143, 150, 158, 162, 177, 180, 181，182, 185, 186, 188 ，190, 191，192, 193, 196, 201，207, 225, 226, 228, 229, 230, 233, 234, 236, 240, 243, 245, 251， 252, 258, 267, 268, 274, 292, 293, 303, 304, 306, 307, 313, 319, 322, 328, 331，338, 340, 346, 3 61，362, 363, 364, 365, 371，384, 394, 396, 400, 406, 407, 414, 417, 422, 427, 431，433, 436, 44 0, 441，443, 444, 445 和 447 组成的第一组，或 (ii) 由 63, 77, 129, 146, 147, 151，153, 157, 161，189, 194, 197, 203, 204, 208, 211，237， 239, 244, 247, 254, 277, 281，285, 288, 289, 294, 327, 339, 344, 356, 378, 382 和 405 组成的第 二组 的一个或多个另外的位置上包含另外的取代，其中另外的位置通过对应如SEQ ID NO:3所列的参考纤维二糖水解酶II(CBH2)的氨基酸序列编号。
7. 权利要求1-6中任一项的纤维素酶变体，其中所述在一个或多个位置上的取代选自 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11，12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21，22, 23, 24 和 25 个位置。
8. 纤维素酶变体，其中所述变体是具有纤维素酶活性的成熟形式并在选自 111，144, 154, 162, 410和413的1至6个位置上包含取代，其中所述纤维素酶变体包含： 第111位的亮氨酸或丝氨酸； 第144位的亮氨酸、谷氨酰胺或色氨酸； 第154位的苏氨酸、半胱氨酸或缬氨酸； 第162位的酪氨酸或天冬酰胺； 第410位的精氨酸或丝氨酸；和 第413位的丝氨酸、色氨酸或酪氨酸； 其中所述位置通过对应如SEQ ID NO: 3所列的参考纤维二糖水解酶II (CBH2)的氨基 酸序列编号，且其中当纤维素酶变体包含单个取代时，所述单个取代不是S413Y取代。
9. 维素酶变体，其中所述变体是具有纤维素酶活性的成熟形式并在选自 98, 194, 313, 316, 384和443的1至6个位置上包含取代，其中所述纤维素酶变体包含： 第98位的脯氨酸或亮氨酸； 第194位的赖氨酸、半胱氨酸或谷氨酸； 第313位的丝氨酸或苏氨酸； 第316位的丝氨酸或脯氨酸； 第384位的甘氨酸、半胱氨酸或谷氨酰胺； 和第443位的天冬酰胺或异亮氨酸； 其中所述位置通过对应如SEQ ID NO: 3所列的参考纤维二糖水解酶II (CBH2)的氨基 酸序列编号，且其中当纤维素酶变体包含单个取代时，所述单个取代不是P98L取代、K194E 取代和S316P取代之一。
10. 纤维素酶变体，其中所述变体是具有纤维素酶活性的成熟形式并在选自 153, 161，203, 233, 422和444的1至6个位置上包含取代，其中所述纤维素酶变体包含： 第153位的精氨酸或谷氨酰胺； 第161位的天冬酰胺、丙氨酸或色氨酸； 第203位的精氨酸或组氨酸； 第233位的脯氨酸或天冬氨酸； 第422位的谷氨酰胺或缬氨酸；和 第443位的脯氨酸或谷氨酰胺； 其中所述位置通过对应如SEQ ID NO: 3所列的参考纤维二糖水解酶II (CBH2)的氨基 酸序列编号，且其中当纤维素酶变体包含单个取代时，所述单个取代不是R153Q取代。
11. 纤维素酶变体，其中所述变体是具有纤维素酶活性的成熟形式并在选自 98, 111，144, 313, 316, 413和422的1至7个位置上包含取代，其中所述纤维素酶变体包含： 第98位的脯氨酸或亮氨酸； 第111位的亮氨酸或丝氨酸； 第144位的亮氨酸或色氨酸； 第313位的丝氨酸或苏氨酸； 第316位的丝氨酸或脯氨酸； 第413位的丝氨酸或色氨酸；和 第422位的谷氨酰胺或缬氨酸； 其中所述位置通过对应如SEQ ID N0:3所列的参考纤维二糖水解酶II (CBH2)的氨 基酸序列编号，且其中当纤维素酶变体包含单个取代时，所述单个取代不是P98L取代和 S316P取代之一。
12. 纤维素酶变体，其中所述变体包含第98位的谷氨酰胺，和选自T138C、S316P、 S343Q、Q362I、S386C、C400S和S406P的取代，其中所述位置通过对应如SEQ ID N0:3所列 的参考纤维二糖水解酶II (CBH2)的氨基酸序列编号。
13. 纤维素酶变体，其包含第138位的半胱氨酸，和选自S316P、S343Q、Q362I、S386C、 C400S和S406P的取代，其中所述位置通过对应如SEQ ID N0:3所列的参考纤维二糖水解酶 II(CBH2)的氨基酸序列编号。
14. 纤维素酶变体，其包含第316位的脯氨酸，和选自S343Q、Q362I、S386C、C400S 和S406P的取代，其中所述位置通过对应如SEQ ID N0:3所列的参考纤维二糖水解酶I I(CBH2)的氨基酸序列编号。
15. 纤维素酶变体，其包含第343位的谷氨酰胺，和选自03621、5386(：、〇4005和5406? 的取代，其中所述位置通过对应如SEQ ID NO: 3所列的参考纤维二糖水解酶II (CBH2)的氨 基酸序列编号。
16. 纤维素酶变体，其包含第362位的异亮氨酸，和选自S386C、C400S和S406P的取代， 其中所述位置通过对应如SEQ ID NO: 3所列的参考纤维二糖水解酶II (CBH2)的氨基酸序 列编号。
17. 纤维素酶变体，其包含第386位的半胱氨酸，和选自C400S和S406P的取代，其中所 述位置通过对应如SEQ ID NO: 3所列的参考纤维二糖水解酶II (CBH2)的氨基酸序列编号。
18. 权利要求1的纤维素酶变体，其包含第400位的丝氨酸和第406位的脯氨酸。
19. 纤维素酶变体，其中所述变体是具有纤维素酶活性的成熟形式并在选自 98, 111，182, 291，316, 362和400的1至7个位置上包含取代，其中所述纤维素酶变体包含： 第98位的脯氨酸、亮氨酸或谷氨酰胺； 第111位的亮氨酸或丝氨酸； 第182位的天冬酰胺或色氨酸； 第291位的丝氨酸或谷氨酸； 第316位的丝氨酸或脯氨酸； 第362位的谷氨酰胺、异亮氨酸或亮氨酸；和 第400位的半胱氨酸或丝氨酸； 其中所述位置通过对应如SEQ ID NO:3所列的参考纤维二糖水解酶II (CBH2)的氨 基酸序列编号，且其中当纤维素酶变体包含单个取代时，所述单个取代不是P98L取代和 S316P取代之一。
20. 权利要求19的纤维素酶变体，其中所述变体还包含L439P取代或I74S取代。
21. 权利要求1-20中任一项的纤维素酶变体，其中所述变体来源于选自红褐肉座菌 CBH2、康宁肉座菌（Hypocrea koningii)CBH2、特异腐质霉（Humicola insolens)CBH2、解纤 维素醋弧菌（Acremonium cellulolyticus)CBH2、二抱蘑葫（Agaricus bisporus)CBH2、尖 镜抱（Fusarium osysporum)EG、黄抱原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium)CBH2、 埃默森篮状菌（Talaromyces emersonii)CBH2、褐色嗜热裂抱菌（Thermobifida.fusca)6B/ E3CBH2、褐色嗜热裂抱菌（Thermobifida fusca)6A/E2EG和奠肥纤维单胞菌（Cellulomonas fimi)CenA EG的亲本纤维素酶。
22. 权利要求1-21中任一项的纤维素酶变体，其中所述变体来源于这样的亲本纤维素 酶，所述亲本纤维素酶的氨基酸序列与SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:12 和 SEQ ID N0:13 的成员至少 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同。
23. 权利要求1-22中任一项的纤维素酶变体，其中所述变体是分离的。
24. 包含权利要求1-23中任一项的纤维素酶变体的组合物。
25. 权利要求24的组合物，其中所述组合物富含纤维素酶变体。
26. 编码权利要求1-22中任一项的纤维素酶变体的分离的核酸。
27. 表达载体，其包含与调控序列有效连接的权利要求26的分离的核酸。
28. 包含权利要求27的表达载体的宿主细胞。
29. 产生纤维素酶变体的方法，其包括在合适的条件下在培养基中培养权利要求28的 宿主细胞以产生所述纤维素酶变体。
30. 包含权利要求29的宿主细胞和培养基的组合物。
31. 包含权利要求29的培养基上清中的纤维素酶变体的组合物。
32. 权利要求24的组合物，还包含至少一种其它的酶，所述酶选自枯草杆菌蛋白酶、中 性金属蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖 酶、木聚糖酶、氧化酶和过氧化物酶。
33. 清洁或织物护理的方法，其包括将包含织物的表面或物品与权利要求24或32的组 合物接触。
34. 织物去球（depilling)和表面光洁处理（surface finish)的方法，其包括将包含 织物的表面或物品与权利要求24或32的组合物接触。
35. 将生物质转化为糖的方法，其包括将所述生物质与权利要求24或32的组合物接 触。
36. 生产燃料的方法，其包含：将生物质组合物与包含权利要求1-22中任一项的纤维 素酶变体的酶促组合物接触来生产糖溶液；和在足以生产燃料的条件下培养含发酵微生物 的糖溶液。
【专利摘要】本发明涉及纤维素酶变体。特别是本发明涉及具有改善的表达、活性和/或稳定性的纤维素酶变体。还描述了编码纤维素酶变体的核酸，包含所述纤维素酶变体的组合物，及其使用方法。
【IPC分类】C12N9-42, C12N1-19, C12N1-15, C12N15-81, C11D3-386, C12N15-80, C12N15-56, C12N11-18, C12P19-00, C12P7-06
【公开号】CN104862293
【申请号】CN201510187939
【发明人】W·埃赫勒, R·R·博特, B·鲍尔, J·卡斯皮, D·A·埃斯特尔, F·格德戈伯, R·W·J·霍姆斯, T·卡佩尔, B·凯莱曼, S·克拉利, 利斯豪特 J·范, 斯蒂格特 坦斯 S·范, L·华莱士, G·沃格特恩坦茨, M·桑德格伦, I·尼古拉耶夫
【申请人】丹尼斯科美国公司
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2010年6月3日
【公告号】CA2764094A1, CN102803482A, CN102803482B, EP2438164A1, US8679816, US20120135500, US20140302585, WO2010141779A1