猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种猪伪狂犬病病毒基因缺失株、及其制备的疫苗组合物，以及制备 方法和应用，属于动物病毒学领域。
【背景技术】
[0002] 伪狂犬病，又称Aujeszky氏病，是由疱瘆病毒科（Herpesviridae) α亚科中的猪 疱瘆病毒I型（Suid herpesvirus Istrain)所引起的猪、牛、羊等多种家畜、家禽和野生动 物的一种以发热、奇痒（除猪外）及脑脊髓炎为主症的急性传染病。猪的伪狂犬病在我国 广泛存在，危害严重，是制约规模化猪场生产的主要疫病之一。它能引起妊娠母猪流产、死 胎或木乃伊胎和仔猪出现神经症状、麻痹，死亡率高。PRV具有较强的泛嗜性、神经嗜性及潜 伏感染特性，在外周神经系统可以长期潜伏感染，当潜伏病毒被激活变成有感染力的病毒， 被潜伏感染的宿主就会发病。
[0003] 最近的研宄报道称猪伪狂犬病发生了新的特点，突出表现为任何年龄的猪都会感 染，可在猪群水平传播，潜伏期短（1~2天），发病率在10%~100%之间，发病猪死亡率 在10%~100%之间（仔猪死亡率可高达100% )，感染后可引起猪只高热（40~42°C， 持续3日以上），呼吸困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，侧 卧不起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而死，并可引起种公猪精液质量下降，怀孕母猪流 产（高达35%)，早产，死胎，弱仔（弱仔14日龄前全部死亡）等繁殖障碍症状。现有技 术的疫苗免疫猪只后不能完全抵抗野毒攻击，依然会出现高热，精神沉郁，食欲下降或废 绝等症状，感染率超过80%，发病率超过30%，死亡率在10%~20%之间。例如彭金美 等.猪伪狂犬病病毒新流行株的分离鉴定及抗原差异性分析.中国预防兽医学报，2013， 35(1) :1-4;童武等.免疫后发病仔猪中伪狂犬病毒的分离和鉴定.中国动物传染病学 报，2013, 21 (3) : 1-7 ;Yu et al. , Pathogenic Pseudorabies Virus, China, 2012. Emerging infectious Diseases. 2014, 20(I):102-104 ；An et al. , Pseudorabies virus variant in Bartha-K61-vaccinated pigs, China, Emerging infectious Diseases. 2013. 19(11)： 1749-1755)，现有技术还没有疫苗能够解决针对猪伪狂犬变异株引起的伪狂犬病。
[0004] 中国专利申请CN103756977A公开了猪伪狂犬病gE和gl基因缺失病毒株 PRV-ZJ011G株（保藏号为CGMCCNo. 7957)以及使用其制备的灭活前病毒含量为IO6 tlTCID5ci 的疫苗，以该疫苗免疫5头45日龄健康仔猪可以获得100%保护，但由于猪伪狂犬病毒疫苗 弱毒的活疫苗能够在体内一直增殖从而产生细胞免疫和体液免疫，该专利申请未能成功提 供一种针对伪狂犬新毒株的减毒活疫苗。
[0005] 中国专利申请CN103981153A公开了伪狂犬病病毒双荧光标记缺失病毒的构建， 公开了一种缺失了 gE基因、gl基因、US9基因和TK基因四种伪狂犬病病毒基因，通过同源 重组在上述要缺失基因的部位分别插入GFP基因和RFP基因作为标记物，但其是利用该基 因缺失株作为抗原载体，没有公开其本身是否具有免疫活性作用，而且伪狂犬病毒共有70 中以上基因片段，该基因缺失株的毒性如何也是未知的。
[0006] Chun-Hua Wang 等公开了（Chun-Hua Wang，Jin Yuan，Hua-Yang Qin，et al，A novel gE-deleted pseudorabies virus (PRV) provides rapid and complete protection from lethal challenge with the PRV variant emerging in Bartha-K61_vaccinated swine population in China，Vaccine 32(2014)3379 - 3385)给 6 周龄仔猪注射 PRVTJ-gElf活疫苗对仔猪获得100%保护，且没有发热的情况出现。但本领域技术人员所 知，猪伪狂犬活疫苗的毒力跟仔猪年龄大小相关，而且根据本领域常规经验，6周龄仔猪安 全的疫苗对于7日龄的仔猪可能会不安全。由于活疫苗会在猪群内传播，因此只对6周龄 仔猪安全的疫苗无法保证在临床使用，现有技术需要对7日龄仔猪安全并且能预防新发生 的猪伪狂犬病毒变异株的活疫苗。
【发明内容】
[0007] 为解决现有技术的不足，本发明提供了一种活的减毒猪伪狂犬病毒株，用于防治 变异伪狂犬病毒引起的猪狂犬病。
[0008] 本发明主要目的在于提供一种猪伪狂犬病毒弱毒株，其中，所述猪伪狂犬病毒弱 毒株为gI/gE/llK/28K蛋白失活的猪伪狂犬病毒株，优选地，所述伪狂犬病毒株为伪狂犬 变异株。
[0009] gI/gE/llK/28K蛋白失活可使用本技术领域的公知方式，包括其基因缺失表达上 述蛋白的功能性片段的核苷酸序列，其基因整个ORF缺失，或者其基因缺失、删除或添加一 个或多个核苷酸使其不能正常表达功能蛋白或表达的蛋白不具有其原有的功能，或功能极 弱。
[0010] 作为本发明的一种实施方式，本发明提供一种缺失gI/gE/llK/28K基因的伪狂犬 病毒基因工程弱毒株。
[0011] 作为本发明的一种实施方式，所述猪伪狂犬病毒弱毒株基因组中gI/gE/llK/28K 整个ORF缺失。
[0012] 作为本发明的一种实施方式，所述伪狂犬变异株为gE蛋白序列为SEQ ID NO. 5或 与其序列同源性为95%以上的毒株；优选地，所述的猪伪狂犬变异株为经分离的所述猪伪 狂犬病毒变异株当重现所述猪伪狂犬病毒变异株感染时，免疫了现有技术中基因缺失伪狂 犬弱毒疫苗后依然会造成猪出现高热，精神沉郁，食欲下降或废绝症状的毒株；更优选地， 所述的猪伪狂犬变异株为当重现所述猪伪狂犬病毒变异株感染时，免疫了现有技术中缺失 gE、TK和gl基因中的一个及一个以上基因的伪狂犬弱毒疫苗后所述猪依然感染猪伪狂犬 病，并且所述猪伪狂犬病毒变异株具备具有使9-10日龄仔猪精神沉郁和食欲下降的毒株。
[0013] 最优选的是伪狂犬变异株包括但不限于猪伪狂犬病毒HN1201株（Pseudorabies virus, strain HN1201)(保藏号为CCTCC NO. V 201311;保藏于中国典型培养物保藏 中心；保藏地址为中国武汉?武汉大学，保藏日期为2013年5月20日），JS-2012株 (童武，张青占，郑浩等，免疫后发病仔猪中伪狂犬病毒的分离和鉴定[J].中国动物传 染病学报2013, 21 (3) : 1-7);猪伪狂犬HeNl株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCCN0. 6656，公开于专利申请CN102994458A ; NVDC-PRV-BJ 株、NVDCPRV-HEB 株和 NVDC-PRV-SD 株（Xiuling Yu, Zhi Zhou, Dongmei Hu, et al. Pathogenic PseudorabiesVirus, China, 2012EmergingInfectious Diseases, www.cdc.gov/eid ol. 20, No. I, January 2014。猪伪狂犬病毒 HN1202 株（Pseudorabies virus, strain HN1202)(保藏号为CCTCC NO. V 201335;保藏于中国典型培养物保藏中心； 保藏地址为中国武汉?武汉大学，保藏日期为2013年8月26日），PRV TJ strain(PRV TJ)株，公开于 ChinaChun-Hua Wang Jin Yuanl, Hua-Yang Qinl, et al, A nov