猪伪狂犬病病毒疫苗组合物及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种猪伪狂犬病病毒疫苗组合物，该猪伪狂犬病病毒疫苗组合物含猪伪狂犬病病毒亚单位抗原，或含有重组新城疫病毒-猪伪狂犬病病毒载体。本发明还提供了该疫苗组合物的制备方法和应用。该疫苗组合物能有效预防猪伪狂犬病病毒相关疾病和由猪伪狂犬病病毒造成的感染的相关疾病。本发明猪伪狂犬病毒疫苗组合物中免疫原性抗原的组合可诱导产生协同的免疫效果，不仅免疫效果良好，还进一步降低了免疫使用量，降低了免疫成本。
【专利说明】猪伪狂犬病病毒疫苗组合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽用生物制品领域，具体地涉及猪伪狂犬病毒的疫苗组合物及其制备 方法，以及将所述免疫抗原用于制备预防和/或治疗与猪伪狂犬病毒相关疾病和由猪伪狂 犬病毒导致的感染的组合物的应用。
【背景技术】
[0002] 伪狂犬病，又称Aujeszky氏病，是由疱疹病毒科（Herpesviridae) α亚科中的猪 疱疫病毒I型（Suid herpesvirus lstrain)所引起的猪、牛、羊等多种家畜、家禽和野生动 物的一种以发热、奇痒（除猪外）及脑脊髓炎为主症的急性传染病。猪的伪狂犬病在我国 广泛存在，危害严重，是制约规模化猪场生产的主要疫病之一。它能引起妊娠母猪流产、死 胎或木乃伊胎和仔猪出现神经症状、麻痹，死亡率高。PRV具有较强的泛嗜性、神经嗜性及潜 伏感染特性，在外周神经系统可以长期潜伏感染，当潜伏病毒被激活变成有感染力的病毒， 被潜伏感染的宿主就会发病。
[0003] 猪PRV只有一个血清型，通常认为毒株的交叉保护力很强，但目前仍存在仔猪注 射商品化疫苗后发生典型猪伪狂犬病，例如长时间体温升高，精神沉郁，食欲减退，出现呼 吸道和/或神经症状。突出表现为任何年龄的猪都会感染，可在猪群水平传播，潜伏期短 (1?2天），发病率在10%?100%之间，发病猪死亡率在10%?100%之间（仔猪死亡率 可高达100% )，感染后可引起猪只高热（40?42°C，持续3日以上），呼吸困难，腹泻，喘， 咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，侧卧不起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而 死，并可引起种公猪精液质量下降，怀孕母猪流产（高达35% )，早产，死胎，弱仔（弱仔14 日龄前全部死亡）等繁殖障碍症状。现有技术的疫苗免疫猪只后不能完全抵抗野毒攻击， 依然会出现高热，精神沉郁，食欲下降或废绝等症状，感染率超过80 %，发病率超过30 %， 死亡率在10%?20%之间。现有技术还没有疫苗能够解决针对猪伪狂犬变异株引起的伪 狂犬病。
[0004] 本发明首次通过将猪伪狂犬病毒gB蛋白与gD蛋白组合使用，针对猪伪狂犬变异 株引起的伪狂犬病有着较好的保护作用，，通过免疫效力比较试验，意外发现，两种蛋白组 合使用，协同刺激机体免疫反应，有效降低了免疫剂量，大大降低了免疫成本。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种预防和/或治疗猪伪狂犬病毒感 染的疫苗组合物，该疫苗组合物包含两种猪伪狂犬病毒免疫保护性抗原和佐剂。本发明提 供的预防和/或治疗猪伪狂犬病毒感染的疫苗组合物包含的两种猪伪狂犬病毒免疫抗原 为gB蛋白与gD蛋白。
[0006] 本发明的第一方面是一种猪伪狂犬病病毒疫苗组合物，所述的疫苗组合物包括免 疫量的gB蛋白、gD蛋白和佐剂。
[0007] 作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的疫苗组合物中，所述的gB蛋白蛋白 序列为SEQ ID NO. 3 ;所述的gD蛋白蛋白序列为SEQ ID NO. 4。
[0008] 优选地，本发明提供的预防和/或治疗猪伪狂犬病毒感染的疫苗组合物包含的猪 伪狂犬病毒免疫抗原gB蛋白氨基酸序列如SEQ ID N0 :3所示。
[0009] 优选地，本发明提供的预防和/或治疗猪伪狂犬病毒感染的疫苗组合物包含的猪 伪狂犬病毒免疫抗原gB蛋白核苷酸序列如SEQ ID N0 :1所示。
[0010] 优选地，本发明提供的预防和/或治疗猪伪狂犬病毒感染的疫苗组合物包含的猪 伪狂犬病毒免疫抗原gD蛋白氨基酸序列如SEQ ID N0 :4所示。
[0011] 优选地，本发明提供的预防和/或治疗猪伪狂犬病毒感染的疫苗组合物包含的猪 伪狂犬病毒免疫抗原gD蛋白核苷酸序列如SEQ ID N0 :2所示。
[0012] 术语"gB蛋白"又称"gB糖蛋白"，
[0013] 术语"gD蛋白"又称"gD糖蛋白"，是猪伪狂犬病病毒进行感染必需的结构蛋白，是 成熟的病毒粒子囊膜表面的主要糖蛋白之一，也称为"gp50蛋白"。
[0014] 本发明提供的预防和/或治疗猪伪狂犬病毒感染的疫苗组合物包含的猪伪狂犬 病毒免疫抗原gB蛋白、gD蛋白还可以是与其功能衍生物基本相同的氨基酸序列的多肽。
[0015] 术语"佐剂"指加入到本发明的组合物中以增加组合物的免疫原性的物质。已知 的佐剂包括，但不限于：油佐剂，水溶性佐剂，铝盐佐剂，细胞因子佐剂。
[0016] 本发明所用术语"油佐剂"又称"油性佐剂"或"油乳佐剂"，是由包括植物油、动 物油、矿物油中的一种或几种组成，用于延缓免疫原在机体内的存留时间，使之持续缓慢释 放，增强巨噬细胞的吞噬与杀菌能力。
[0017] 本发明所用术语"水溶性佐剂"又称"水基佐剂"或"水佐剂"，是一种聚合物水溶 性分散体，用于提高水溶性疫苗的功效和安全性，可以由高分子量聚丙烯酸类合成聚合物 组成。
[0018] 本发明所用术语"铝盐佐剂"，又称"铝胶佐剂"或"铝佐剂"，包括氢氧化铝佐剂和 磷酸铝佐剂，其主要功能为缓释，但同时具有对免疫细胞的激活作用。将抗原和氢氧化铝或 磷酸铝混合注射，能够使抗原保存在注射部位，具有抗原缓释和非特异免疫刺激作用。
[0019] 本发明所用术语"细胞因子佐剂"，包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、 IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、INF- γ、GM-CSF、TNF- a、TNF- β、TCA-3 等，又称"细胞因子" 或"细胞素"，是活体宿主细胞分泌的通过扩散、细胞间接触或血液循环到达宿主其他细胞， 在体液中以极低浓度发挥作用的一类非免疫球蛋白、局部天然蛋白或糖蛋白，也是一类由 机体活化的免疫细胞和某些非免疫细胞产生、分泌，能调节细胞生长、分化，与造血、炎症反 应、免疫应答反应和创伤愈合等密切相关的高活性多功能小分子蛋白的统称，可以刺激或 抑制免疫功能，在免疫应答中促进细胞发育分化、调节细胞生理功能和细胞间信息传递，在 免疫系统中起着非常重要的调控作用。
[0020] 本发明实施例中使用了油佐剂中的一种206佐剂。
[0021] 适用于本发明的组合物的佐剂的量优选地是有效量。所述"有效量"是指佐剂在 同本发明抗原联合施用时在宿主中发挥它们的免疫学作用而言必须或足够的而不导致过 度副作用所必需量。待施用的佐剂的精确的量将根据因素如所用的成分和治疗的疾病的类 型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。
[0022] 在一个实施方式中，本发明提供一种治疗和/或预防猪伪狂犬病毒感染的疫苗组 合物，由猪伪狂犬病毒免疫抗原gB蛋白、gD蛋白和206佐剂组成。
[0023] 作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的疫苗组合物中，所述的gB蛋白含量 为 25-100μ g/ml ;gD 蛋白含量为 25-100μ g/ml。
[0024] 作为本发明的一种最优选实施方式，在本发明的疫苗组合物中，所述的gB蛋白含 量为50 μ g/ml ; gD蛋白含量为50 μ g/ml。
[0025] 本发明的组合物的成分或组分的量优选地是治疗有效量。所述治疗有效量是指在 组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分 和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年 龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。
[0026] 优选地，对于动物猪而言，本发明疫苗组合物gB蛋白抗原有效量为25-100 μ g/ ml ;gD蛋白抗原有效量为25-100 μ g/ml。
[0027] 更优选地，所述疫苗组合物gB蛋白抗原有效量为50 μ g/ml ;gD蛋白抗原有效量为 50 μ g/ml〇
[0028] 本发明的另一方面是一种猪伪狂犬病病毒疫苗组合物，所述的疫苗组合物包括重 组新城疫病毒-猪伪狂犬病病毒载体以及佐剂。
[0029] 作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的疫苗组合物中，所述的重组新城疫 病毒-猪伪狂犬病病毒载体包含一种或多种异源多核苷酸，其编码一种或多种猪伪狂犬病 病毒抗原、多肽或其变体，其中，所述的猪伪狂犬病病毒抗原包括gB蛋白、gD蛋白。
[0030] 术语"功能衍生物"指具有与完整蛋白/肽序列的生物活性基本类似的功能生物 活性的蛋白/肽序列。换言之，其优选地指当将所述功能衍生物施用于动物时，基本上保留 了激发免疫应答，如针对猪伪狂犬病毒株攻击的保护性反应的能力的多肽或其片段。
[0031] 术语"片段"指这样的多核苷酸序列，其是人工构建（例如通过化学合成）或通过 将天然产物裂解成多个小片段（使用限制性内切酶，或机械剪切）构建的本发明核酸的分 离的部分，或通过PCR、DNA聚合酶或本领域公知的任何其他聚合技术合成的核酸的部分， 或通过本领域技术人员公知的重组核酸技术在宿主细胞中表达的核酸部分。
[0032] 如本文一般理解和使用，"功能性片段"指编码与完整核酸序列的生物活性基本相 似的功能生物活性的核酸序列。换言之，在本发明的上下文中，其优选地指基本上保留了编 码这样的多肽/蛋白质能力的核酸或其片段，所述多肽/蛋白质当施用于动物时，激发针对 猪伪狂犬病毒攻击的免疫应答，和更优选地保护性反应。
[0033] 当指氨基酸序列时，"基本上相同"可以理解为本发明的多肽优选地具有这样的氨 基酸序列，其与SEQ ID NO :3-4中所示的序列的部分或全部具有至少70%同源性，或甚至 优选地80%同源性，或甚至更优选地90%同源性，或最优选地95%同源性。
[0034] 在本文中术语"同源性"还包括与参比序列相同或类似，同时提供任何氨基酸的简 单替换/修饰。可以用BLAST-P (基本局部排比检索工具），本领域技术人员公知的程序进 行该方面的同源性检索。对于相应的核酸序列，同源性涉及在本领域中已知的BLASTX和 BLASTN 程序。
[0035] 作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的疫苗组合物中，所述的猪伪狂犬病 病毒抗原gB蛋白为序列SEQ ID N0. 3编码的猪伪狂犬病病毒gB蛋白，述的猪伪狂犬病病 毒抗原gD蛋白为序列SEQ ID N0. 4编码的gD蛋白。
[0036] 所述"载体"意指重组DNA或RNA质粒、噬菌体或病毒，其包含要在体内或体外递 送至靶细胞的异源多核苷酸。异源多核苷酸可包含目的序列以用于预防或治疗的目的，可 选地，其为表达盒的形式。载体不需要能够在最终的靶细胞或受试者中复制。术语"载体" 包括用于克隆载体，也包括病毒载体。
[0037] 作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的疫苗组合物中所述的疫苗组合物， 其特征在于，所述的新城疫病毒为弱毒株，优选地，所新城疫病毒为新城疫病毒La Sota株。
[0038] 新城疫病毒La Sota株购自中国兽医药品监察所。
[0039] 本发明的另一方面是一种制备所述疫苗组合物的方法，所述的方法包括：1)制备 gB蛋白和gD蛋白抗原的步骤；以及2)按比例混合抗原，加入佐剂，乳化的步骤。
[0040] 本发明的另一个目的是提供一种治疗和/或预防猪伪狂犬病毒相关疾病或感染 的疫苗组合物的制备方法，包括：
[0041] (1)制备gB蛋白和gD蛋白抗原；
[0042] (2)按比例混合抗原，加入佐剂，乳化。
[0043] 抗原的制备可以通过本领域技术人员已知的多种方法进行，包括基因工程手段， 例如通过包含本发明多核苷酸的克隆或表达载体。术语"载体"涉及被设计用于转导/转 染一种或多种细胞类型的多核苷酸构建体。载体可以是，例如"克隆载体"，其被设计用于分 离、增殖和复制插入的核苷酸；"表达载体"，其被设计用于在宿主细胞中表达核苷酸序列； 或"病毒载体"，其被设计用于生产重组病毒或病毒样颗粒；或"穿梭载体"，其包含不只一 种类型的载体的性质。适合制备本发明猪伪狂犬病毒抗原的公众可获得的载体包括质粒、 腺病毒、杆状病毒、酵母杆状病毒、植物病毒、腺伴随病毒、反转录病毒、单纯疱疹病毒、α病 毒、慢病毒等，还可以获得构建这样的载体的方法。本发明猪伪狂犬病毒抗原的制备还包括 通过人工合成的方式来实现。
[0044] 本发明的另一方面是一种制备所述疫苗组合物的方法，其特征在于，所述的方法 包括：1)重组所述新城疫病毒基因组全长cDNA载体的步骤；2)重组表达所述新城疫病毒 NP、P、L基因表达载体的步骤；3)重组表达所述猪伪狂犬病病毒抗原基因到所述新城疫病 毒基因组全长cDNA重组载体的步骤；以及4)将所述表达所述猪伪狂犬病病毒抗原的新城 疫病毒基因组全长cDNA重组载体和表达所述新城疫病毒NP、P、L基因重组载体共同转染细 胞，进行病毒振救的步骤。
[0045] 作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的疫苗组合物制备方法中，转染细胞 为BHK细胞。也可选用本领域公知的培育新城疫病毒的其他细胞系细胞。
[0046] 本发明的另一方面是所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪伪狂犬病病毒 相关疾病或由猪伪狂犬病病毒导致的感染的药物中的应用。
[0047] 本发明的另一个目的在于提供包含猪伪狂犬病毒免疫抗原gB蛋白、gD蛋白或其 功能衍生物基本相同的氨基酸序列的多肽在用于预防和/或治疗猪伪狂犬病毒相关疾病 或感染的组合物和/或方法中的应用。
[0048] 术语"预防"指通过给予根据本发明的疫苗组合物抑制猪伪狂犬感染或推迟疾病 发作的所有行为。术语"治疗"指通过给予根据本发明的疫苗组合物使猪伪狂犬病病毒感 染引起的症状减轻或转好的所有行为。
[0049] 术语"保护性反应"意为在动物中预防猪伪狂犬病毒相关疾病或由猪伪狂犬病毒 导致的感染的发作或减轻存在的这样的疾病的严重性。
[0050] 本发明涉及的猪伪狂犬病毒多肽，其有利地激发动物中的保护性反应。具体地，本 发明涉及的多肽包含与其功能衍生物基本相同的氨基酸序列。
[0051] 本发明的另一个目的是提供一种疫苗组合物在制备治疗和/或预防猪伪狂犬病 毒相关疾病或感染的药物的应用。
[0052] 本文所用的术语"猪伪狂犬病病毒相关疾病"用于指由猪伪狂犬病毒感染引起的 疾病。它的例子包括发病仔猪表现出明显的神经症状、昏睡、呜叫、呕吐、拉稀、体温升高，一 旦发病，怀孕母猪可发生流产、产木乃伊胎儿或死胎或繁殖障碍，但不限于此。
[0053] 本文所用的术语"猪伪狂犬病病毒相关疾病"可以进一步用于指表现为任何年龄 的猪都会感染，可在猪群水平传播，潜伏期短（1?2天），发病率在10 %?100 %之间，发病 猪死亡率在10%?100%之间（仔猪死亡率可商达100% )，感染后可引起猪只商热（40? 42°C，持续3日以上），呼吸困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐， 侧卧不起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而死，并可引起种公猪精液质量下降，怀孕母猪流 产（高达35%)，早产，死胎，弱仔（弱仔14日龄前全部死亡）等繁殖障碍症状，但不限于 此。上述症状与现有技术中感染了普通猪伪狂犬病病毒后产生的症状差异在于：感染了后 会造成感染后成年猪（体重在50kg以上猪）可引起猪只高热（40?42°C，持续3日以上）， 呼吸困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，侧卧不起，角弓反张，泳 状划水，最后衰竭而死；新生及4周龄以内的仔猪突然发病，发生大批死亡，死亡率达90 % 以上；发病仔猪主要表现为体温上升达41°C以上，食欲废绝，伴有明显的神经症状和腹泻； 断奶前后仔猪主要为呼吸系统症状，表现呼吸困难、咳嗽、流鼻涕等。
[0054] 本发明具有以下突出的优点：
[0055] (1)本发明疫苗组合物可通过基因工程手段或人工合成手段对疫苗组合物的组分 进行大量合成表达，不仅耗时短，还可便于大规模生产；
[0056] (2)本发明猪伪狂犬病毒疫苗组合物中多免疫原性抗原的组合可诱导产生协同的 免疫效果，不仅免疫效果良好，还进一步降低了免疫使用量，降低了免疫成本；
[0057] (3)本发明疫苗组合物可有效保护猪只抵抗猪伪狂犬病毒的感染，提供了一种完 善预防和/或治疗猪伪狂犬病毒感染的途径，避免了传统活疫苗毒力返强及散毒风险的发 生，对于净化猪伪狂犬病毒有着积极的现实意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0058] 图1为gB基因 PCR扩增产物电泳结果，从左至右各泳道分别为：Marker DL5000、 gB基因 PCR扩增产物、抽提阴性对照PCR扩增产物、PCR阴性对照；
[0059] 图2为gD基因 PCR扩增产物电泳结果，从左至右各泳道分别为：Marker DL5000、 抽提阴性对照PCR扩增产物；3 :PCR阴性对照；4 :gD基因 PCR扩增产物；
[0060] 图3为pFastBac/HBM-TOPO-gB酶切鉴定结果，从左至右各泳道分别为：Marker DL5000 ;2-5 泳道：pFastBac/HBM-TOPO-gB Mlu I 和 Hind III酶切鉴定结果；
[0061] 图4为pFastBac/HBM-TOPO-gD酶切鉴定结果，从左至右各泳道分别为：Marker DL5000 ;2-4 泳道：pFastBac/HBM-TOPO-gD Mlu I 和 Hind III酶切鉴定结果；
[0062] 图5为Bacmid-gB和Bacmid-gD PCR鉴定结果，从左至右各泳道分别为：Marker DL5000、Bacmid-gB PCR 鉴定、Bacmid-gD PCR 鉴定、Bacmid PCR 阴性对照；
[0063] 图 6 为 vNDV-PRV-gB-gD 构建示意图。
[0064] 序列表中：
[0065] 序列1为PRV HN1201株gB蛋白的核苷酸序列；
[0066] 序列2为PRV HN1201株gD蛋白的核苷酸序列；
[0067] 序列3为PRV HN1201株gB蛋白的氨基酸序列；
[0068] 序列4为PRV HN1201株gD蛋白的氨基酸序列。
【具体实施方式】
[0069] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更 为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0070] 实施例1猪伪狂犬病毒gB、gD蛋白的制备
[0071] 1.猪伪狂犬病毒gB、gD基因的扩增
[0072] 在生长良好的PK15细胞上接种PRV HN1201病毒或其不同代次的培养物，该不同 代次的培养物为5-35代以内的培养物，收获病毒后用TAKARA公司MiniBEST Viral RNA/ DNA Extraction Kit Ver. 3· 0试剂盒提取PRV基因组DNA。取1 μ 1基因组DNA作为模板， 分别利用gB、gD特异性引物：
[0073] gBSF:5， CTAGGGGGCGTCGGGGTCCTCGT 3' 和
[0074] gBSR:5; ATGCCCGCTGGTGGCGGTCTTTGG3;
[0075] gDSFj' ATGCTGCTCGCAGCGCTATTGGC 3，和
[0076] gDSR:5，CTACGGACCGGGCTGCGCTTTTAG3，
[0077] 进行PCR扩增，利用 TAKARA 的高保真酶PrimeSTAR?HS DNA Polymerase with 6〇81^€61^8扩增条件为：941：3111丨11;981：108,681：3111丨11，30。7(3168 ;681：5111丨11，？〇?产物 命名为 gB。gD 扩增条件为：94°C 3min ;98°C 10s，68°C lmin，30cycles ;68°C 5min。PCR 产 物命名为gD。
[0078] 2.重组Bacmid的获取及鉴定
[0079] 将高保真酶扩增获得的PCR产物gB和gD分别克隆至pFastBac/HBM-TOPO 载体（购自Invitrogen公司，货号A11339)，克隆体系如下：PCR产物gB 4μ1，Salt 8〇1111:;[011(盐溶液）1以1，1'0?0￥6。1:01'1以1，共6以1。混合均勻，室温孵育51]1；[11，转化0116 ShotR Machl?TlR感受态细胞，涂布氨苄青霉素抗性平板，分别挑取单克隆鉴定gB、gD基因 的插入方向，插入方向正确的质粒送Invitrogen公司测序，鉴定gB、gD序列的正确性。测 序正确的质粒分别命名为 pFastBac/HBM-T0P0-gB，pFastBac/HBM-T0P0-gD。
[0080] 分别将 pFastBac/HBM-T0P0-gB、pFastBac/HBM-T0P0-gD 质粒转化 DHlOBac 感受 态细胞，pFastBac/HBM-T0P0-gB、pFastBac/HBM-T0P0-gD分别和感受态细胞中的穿梭质粒 Bacmid进行转座，用 Invitrogen 的PureLink HiPure Plasmid DNA Miniprep Kit提取获得 的重组质粒，并用pUCM13Forward/pUCM13Reverse引物分别鉴定gB、gD的插入，阳性Bacmid 分别命名为 Bacmid-gB、Bacmid-gD。
[0081] 3.转染获得重组杆状病毒
[0082] 按照 Invitrogen 公司 Bac-to-Bac ΗΒΜ Τ0Ρ0 Secreted Expression System 的说 明书提供的方法进行。6孔板每孔铺8X105个sf9细胞，待细胞贴壁后按照Cellfectinll转 染试剂的说明书进行转染：分别稀释8以1〇611^〇1:;[1111和]^8 1^〇111(1-813 0嫩到10〇4 1 SF-900 II培养基中，Vortex混匀，混合稀释后的DNA与稀释后的Cellfectin II (总体积? 210 μ 1)，混合均匀室温孵育15?30min，一滴滴加到细胞中。转染后72h待出现细胞病变 后，收集细胞培养上清，记为P0代重组病毒vBac-gB。P0代重组病毒vBac-gB感染sf9细 胞，经3代扩大培养后，获得的P3代vBac-gB用于重组蛋白表达。
[0083] 同样按上述转染方法，将Bacmid-gD DNA进行转染，收获的重组病毒记为P0代 vBac-gD。P0代重组病毒vBac-gD感染sf9细胞，经3代扩大培养后，获得的P3代vBac-gD 用于重组蛋白表达。
[0084] 4.重组杆状病毒感染High-five细胞获得重组蛋白
[0085] 分别将P3代重组杆状病毒vBac-gB、vBac-gD接种High-five细胞（购自 Invitrogen，货号B85502)。在500ml三角瓶中悬浮培养High-five细胞，至细胞密度达 到7. OX 105cell/ml后，按照1M0I的量接种病毒，感染后72h收取细胞培养上清。利用 Millipore的切向流过滤系统将体积浓缩为原来体积的1/10。用1% (体积比）的Triton X-100(购自sigma，货号T8787)灭活杆状病毒，SDS-PAGE光密度法测定蛋白含量为 200 μ g/ml。
[0086] 实施2猪伪狂犬病毒疫苗组合物的制备
[0087] 取实施例1制备的gB和gD蛋白，缓缓加入到佐剂中，加的过程中不断用转速为 800rpm乳化机搅拌12min，混匀，4°C保存，即为猪伪狂犬病毒的疫苗组合物。具体配比见表 1〇
[0088] 表1猪伪狂犬病毒疫苗组合物成分配比 [0089]
【权利要求】
1. 一种猪伪狂犬病病毒疫苗组合物，其特征在于，所述的疫苗组合物包括免疫量的gB 蛋白、gD蛋白和佐剂。
2. 根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的gB蛋白蛋白序列为SEQ ID NO. 3 ;所述的gD蛋白蛋白序列为SEQ ID NO. 4。
3. 根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的gB蛋白含量为25-100 μ g/ ml ;gD 蛋白含量为 25-100μ8/πι1。
4. 一种猪伪狂犬病病毒疫苗组合物，其特征在于，所述的疫苗组合物包括重组新城疫 病毒-猪伪狂犬病病毒载体以及佐剂。
5. 根据权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的重组新城疫病毒-猪伪狂犬 病病毒载体包含一种或多种异源多核苷酸，其编码一种或多种猪伪狂犬病病毒抗原、多肽 或其变体，其中，所述的猪伪狂犬病病毒抗原包括gB蛋白、gD蛋白。
6. 根据权利要求5所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的猪伪狂犬病病毒抗原gB蛋 白为序列SEQ ID NO. 3编码的猪伪狂犬病病毒gB蛋白，述的猪伪狂犬病病毒抗原gD蛋白 为序列SEQ ID NO. 4编码的gD蛋白。
7. 根据权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的新城疫病毒为弱毒株，优选 地，所新城疫病毒为新城疫病毒La Sota株。
8. -种制备权利要求1-3任一项所述疫苗组合物的方法，其特征在于，所述的方法包 括： 1) 制备gB蛋白和gD蛋白抗原的步骤；以及 2) 按比例混合抗原，加入佐剂，乳化的步骤。
9. 一种制备权利要求4-7任一项所述疫苗组合物的方法，其特征在于，所述的方法包 括： 1) 重组所述新城疫病毒基因组全长cDNA载体的步骤； 2) 重组表达所述新城疫病毒NP、P、L基因表达载体的步骤； 3) 重组表达所述猪伪狂犬病病毒抗原基因到所述新城疫病毒基因组全长cDNA重组载 体的步骤；以及 4) 将所述表达所述猪伪狂犬病病毒抗原的新城疫病毒基因组全长cDNA重组载体和表 达所述新城疫病毒NP、P、L基因重组载体共同转染细胞，进行病毒振救的步骤。
10. 根据权利要求1-7任一项所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪伪狂犬病病 毒相关疾病或由猪伪狂犬病病毒导致的感染的药物中的应用。
【文档编号】A61K39/245GK104248757SQ201410519314
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2014年9月30日 优先权日:2014年9月30日
【发明者】田克恭, 孙进忠, 张超林, 张许科 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司