伪狂犬病毒疫苗的生产方法
【专利摘要】本发明公开了一种伪狂犬病毒疫苗的生产方法，包括以下步骤：（1）取传代细胞系细胞，经消化传代，以细胞生长液在细胞培养瓶中继续培养；（2）将毒种用细胞维持液稀释10倍，接种细胞单层，收获感染细胞毒液，即为生产用毒种；（3）取步骤（1）中已形成的细胞单层，经消化制备为细胞悬液，接种于生物反应器中，在生物反应器中加入微载体；（4）对细胞进行接毒操作，所接入毒种为步骤（2）中生产的毒种；（5）待微载体上细胞全部脱落，且溶解氧值呈明显上升趋势，将反应器内液体连同微载体一起收获，置与-20℃条件下反复冻融2次，去除微载体及细胞碎片，制得伪狂犬病毒疫苗。本发明生产周期短、产量大。
【专利说明】伪狂犬病毒疫苗的生产方法
【技术领域】
[0001]本发明实施例涉及一种伪狂犬病毒疫苗的生产方法，具体涉及一种利用生物反应器微载体细胞悬浮培养生产伪狂犬病毒疫苗的方法。
【背景技术】 [0002]目前，国内伪狂犬病毒的疫苗生产唯一依靠转瓶培养法实现。该传统工艺劳动强度大，耗时长、效率低，生产成本高；容易被环境污染；转瓶培养不同批次间的差异大；所需空间多；转瓶培养操作时被细菌或其它病毒污染可能性增大，因而致生产的疫苗或有质量隐患；转瓶培养时一旦发生污染，由于转瓶数量多，因而无害化处理难度大，涉及生物安全和公共卫生问题。另外，目前已经有利用生物反应器微载体培养狂犬病疫苗的报道，但尚没有利用生物反应器微载体生产伪狂犬病毒的报道。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于解决上述现有技术的缺陷，提供一种生产成本低、生产周期短的应用生物反应器微载体细胞培养生产伪狂犬病毒疫苗的方法。
[0004]为解决上述的技术问题，本发明采用以下技术方案:一种伪狂犬病毒疫苗的生产方法，包括以下步骤:
[0005](I)制苗用细胞的传代与培养:取细胞培养瓶中生长良好的传代细胞系细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液在细胞培养瓶中继续培养，培养温度为37°C，形成致密细胞单层时，用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养；
[0006](2)制苗用毒种的繁殖:将毒种用DMEM细胞培养基配制的细胞维持液稀释10倍，接种细胞单层，培养48~72小时，当细胞病变达75%以上时，收获感染细胞毒液，即为生产用毒种；
[0007](3)传代细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养:取步骤(1)中已形成的细胞单层，经EDTA-胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，按5X 105/mL~5X 106/mL的细胞密度接种于生物反应器中，在生物反应器中加入微载体，设定培养条件为:温度37V、pH6.8~7.6、溶氧30%~60%和搅拌速度30~60转/分钟；
[0008](4)制苗毒液的繁殖:当细胞达到5X 106/mL~5X 107/mL后进行接毒操作，所接入毒种为步骤(2)中生产的毒种，接毒前用含有10ug/mL胰酶的病毒培养液将长满细胞的微载体洗涤2~4次，设定培养条件为:温度37°C、pH6.8~7.6、溶氧30%~60%和搅拌速度30~60转/分钟；
[0009](5)伪狂犬病毒疫苗的收获:待微载体上细胞全部脱落，且溶解氧值呈明显上升趋势，将反应器内液体连同微载体一起收获，置与-20°C条件下反复冻融2次，然后经离心或过滤去除微载体及细胞碎片，即制得伪狂犬病毒疫苗。
[0010]在上述伪狂犬病毒疫苗的生产方法中，优选的是，步骤(1)中所述的传代细胞系为BHK-21细胞系、PK-15细胞系、IBRS-2细胞系、Marc-145细胞系、Vero细胞系或ST细胞系。[0011]在上述伪狂犬病毒疫苗的生产方法中，优选的是，所述生物反应器为能够自动控制温度、pH、溶氧和搅拌速度参数的生物反应器，所述生物反应器的容积为3L~3000L。
[0012]在上述伪狂犬病毒疫苗的生产方法中，优选的是，所述微载体为以交联葡聚糖为基质，用带有正电荷的N，N- 二乙氨乙基基团进行一定程度取代的Cytodex系列微载体。
[0013]在上述伪狂犬病毒疫苗的生产方法中，优选的是，所述微载体在使用前需清洗、灭菌，具体方法为:用PBS浸泡微载体过夜，然后用PBS清洗微载体3遍，再用PBS浸泡微载体，121°C蒸汽灭菌30分钟，微载体经清洗、灭菌处理后，加入到已灭菌的生物反应器中，用高糖型DMEM清洗，PBS为磷酸盐缓冲液，pH=7.4，与人体血液等渗，主要成分为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠以及氯化钾；DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，分为高糖型(低于4500mg/L)和低糖型(低于1000mg/L)。
[0014]在上述伪狂犬病毒疫苗的生产方法中，优选的是，所述EDTA-胰酶细胞分散液是由质量体积分数为0.25%的规格为1:250的胰酶、质量体积分数为0.02%的EDTA的Hank’s液组成，所述规格1:250胰酶为每克胰酶中含有250个活力单位的胰蛋白酶，Hank’s液是一种平衡盐溶液。
[0015]在上述伪狂犬病毒疫苗的生产方法中，优选的是，所述细胞生长液由重量分数90%~98%的DMEM液、重量分数2%~10%的牛血清及100~500单位/ml的抗菌素组成，所述细胞生长液pH为6.8~7.6。
[0016]在上述伪狂犬病毒疫苗的生产方法中，优选的是，所述步骤(4)中的病毒培养液为含有胰酶的DMEM液，且DMEM液中含有100~500单位/ml的抗菌素，所述病毒培养液pH为 6.8 ~7.6。
[0017]在上述伪狂犬病毒疫苗的生产方法中，优选的是，所述抗菌素为青霉素钠和硫酸链霉素的混合物。
`[0018]在上述伪狂犬病毒疫苗的生产方法中，优选的是，所述步骤(4)中的毒种接种量为0.01~0.5M0I, MOI指TCID50/cell,即病毒感染复数。
[0019]本发明的效果和优点如下:
[0020]1、本发明可以大大降低生产成本、占用场地小，不会受制于原料供应。
[0021]2、本发明生产周期短(每个生产周期仅需5~7天)，产量大，相比现有转瓶培养法所生产的伪狂犬病毒效价更高。
[0022]3、采用生物反应器进行疫苗生产，具有自动化程度高，减少人工，生产工艺简单稳定、易操作，易于快速扩大生产规模，质量易于实现均衡稳定。
[0023]4、本发明的方法生产疫苗，环境污染少且易于处理。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1是本发明方法的生产流程图。
【具体实施方式】
[0025]图1是本发明方法的生产流程图。
[0026]实施例一:(1)制苗用细胞的传代与培养:选择乳仓鼠肾(BHK-21)细胞系作为制苗用细胞。取细胞培养瓶中生长良好的BHK-21细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液(含0.25%胰酶(1:250),0.02%EDTA的Hank’s液)消化传代，以细胞生长液(含90%DMEM液、10%牛血清、各200单位/ml的青霉素钠和硫酸链霉素，pH为7.4)在细胞培养瓶中继续培养，培养温度为37°C，形成致密良好细胞单层时，用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养，其中生物反应器为能够自动控制温度、pH、溶氧和搅拌速度参数的适用于微载体悬浮培养的生物反应器；
[0027](2)制苗用毒种的繁殖:将毒种用DMEM细胞培养基配制的细胞维持液稀释10倍，接种生长良好的BHK-21细胞单层，培养55小时，随时观察细胞病变(CPE)，当细胞病变达75%以上时,收获感染细胞毒液,经鉴定合格后作为生产用毒种；
[0028](3) BHK-21细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养:取步骤(1)培养好的BHK-21细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，细胞计数后接种于生物反应器中，在生物反应器中加有微载体，设定培养温度37°C、pH7.4、溶氧50%、搅拌速度60转/分钟，进行反应器自动控制培养，其中生物反应器容积为75L ;微载体为Cytodex系列微载体，微载体在使用前，需清洗、灭菌，具体步骤为:1)称量Cytodexl微载体500g、使用20LPBS液浸泡过夜；2)用10LPBS液清洗3遍；3)加入10LPBS液浸泡微载体，121°C蒸汽灭菌三十分钟；
[0029](4)制苗毒液的繁殖:培养后第三日观察微载体上细胞基本长满，且细胞计数结果为9.6X 106/ml后进行接毒操作，接毒前用含有10ug/ml胰酶的病毒培养液(病毒培养液配方为:不含血清，含有胰酶的DMEM液、加各200单位/ml的青霉素钠和硫酸链霉素，pH为
7.4)洗涤4次。接种量为0.1MOI，设定培养温度37°C、pH7.4、溶氧50%、搅拌速度60转/分钟，进行反应器自动控制培养，接毒后每隔一定时间取反应器中微载体，用显微镜观察细胞病变情况；
[0030](5)病毒液的收获:待微载体上细胞基本全部脱落，且溶解氧值呈明显上升趋势，将反应器内液体连同微载体一起收获，置与-20°C条件下反复冻融2次，然后经离心或过滤去除微载体及细胞碎片，即制得伪狂犬病毒疫苗，于-20°C冷冻保存备用。
[0031]对伪狂犬病毒疫苗进行检验:按《中华人民共和国兽药典》(2010年版)附录42、49页进行检验，无细菌、霉菌、支原体生长。收获的毒液进行病毒含量测定，计算TCID5tl,每0.1ml 病毒含量≥ 107.5TCLD500
[0032](6)配苗、分装及冻干:将检验合格的伪狂犬病毒疫苗与稳定剂按1:1比例混合，同时加入抗生素，充分摇匀，定量分装，分装后进行冷冻真空干燥后即得伪狂犬病毒疫苗成品O
[0033]成品检验:按《中华人民共和国兽药典》(2010年版)进行检验，符合“伪狂犬细胞活疫苗”的规定，每头份疫苗病毒含量≥IO3 7TCLD50o
[0034]实施例二:( I)制苗用细胞的传代与培养:选择猪肾(PK-15)细胞系作为制苗用细胞。取细胞培养瓶中生长良好的PK-15细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液(含0.25%胰酶(I:250),0.02%EDTA的Hank’s液)消化传代，以细胞生长液(含98%DMEM液、2%牛血清、各250单位/ml的青霉素钠和硫酸链霉素，pH为7.0)在细胞培养瓶中继续培养，培养温度为37°C，形成良好细胞单层时，用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养，其中生物反应器为能够自动控制温度、pH、溶氧和搅拌速度参数的适用于微载体悬浮培养的生物反应器；
[0035](2)制苗用毒种的繁殖:将毒种用DMEM细胞培养基配制的细胞维持液稀释10倍，接种生长良好的PK-15细胞单层，培养72小时，随时观察细胞病变(CPE)，当细胞病变达82%时,收获感染细胞毒液,经鉴定合格后作为生产用毒种；
[0036](3)PK-15细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养:取步骤(1)培养好的ΡΚ-15细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，细胞计数后接种于生物反应器中，在生物反应器中加有微载体，设定培养温度37°C、pH7.0、溶氧60%、搅拌速度60转/分钟，进行反应器自动控制培养，其中生物反应器容积为75L ;微载体为Cytodex系列微载体，微载体在使用前，需清洗、灭菌，具体步骤为:I)称量Cytodexl微载体500g、使用20LPBS液浸泡过夜；2)用IOLPBS液清洗3遍；3)加入IOLPBS液浸泡微载体，121°C蒸汽灭菌三十分钟；
[0037](4)制苗毒液的繁殖:培养后第三日观察微载体上细胞基本长满，且细胞计数结果为4.6X 107/ml后进行接毒操作，接毒前用含有10ug/ml胰酶的病毒培养液(病毒培养液配方为:不含血清，含有胰酶的DMEM液、加各200单位/ml的青霉素钠和硫酸链霉素，pH为
7.0)洗涤4次。接种量为0.1MOI，设定培养温度37°C、pH7.0、溶氧60%、搅拌速度60转/分钟，进行反应器自动控制培养，接毒后每隔一定时间取反应器中微载体，用显微镜观察细胞病变情况；
[0038](5)病毒液的收获:待微载体上细胞基本全部脱落，且溶解氧值呈明显上升趋势，将反应器内液体连同微载体一起收获，置与-20°C条件下反复冻融2次，然后经离心或过滤去除微载体及细胞碎片，即制得伪狂犬病毒疫苗，于-20°C冷冻保存备用。
[0039]对伪狂犬病毒疫苗进行检验:按《中华人民共和国兽药典》(2010年版)附录42、49页进行检验，无细菌、霉菌、支原体生长。收获的毒液进行病毒含量测定，计算TCID5tl,每0.1ml 病毒含量≥ 108.5TCLD500
[0040](6)配苗、分装及冻干:将检验合格的伪狂犬病毒疫苗与稳定剂按1:1比例混合，同时加入抗生素，充分摇匀，定量分装；分装后进行冷冻真空干燥后即得伪狂犬病毒疫苗成品O
[0041]成品检验:按《中华人民共和国兽药典》(2010年版)进行检验，符合“伪狂犬细胞活疫苗”的规定，每头份疫苗病毒含量> 103_ 7TCLD5tlt5。
[0042]实施例三:(1)制苗用细胞的传代与培养:选择猴肾(Marc-145)细胞系作为制苗用细胞。取细胞培养瓶中生长良好的Marc-145细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液(含0.25%胰酶(1:250),0.02%EDTA的Hank’s液)消化传代，以细胞生长液(含94%DMEM液、6%牛血清、各100单位/ml的青霉素钠和硫酸链霉素，pH为6.8)在细胞培养瓶中继续培养，培养温度为37°C，形成良好细胞单层时，用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养，其中生物反应器为能够自动控制温度、pH、溶氧和搅拌速度参数的适用于微载体悬浮培养的生物反应器；
[0043](2)制苗用毒种的繁殖:将毒种用DMEM细胞培养基配制的细胞维持液稀释10倍，接种生长良好的Marc-145细胞单层，培养60小时，随时观察细胞病变(CPE)，当细胞病变达85%时,收获感染细胞毒液,经鉴定合格后作为生产用毒种；
[0044](3)Marc_145细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养:取步骤(1)培养好的Marc-145细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，细胞计数后接种于生物反应器中，在生物反应器中加有微载体，设定培养温度37°C、pH6.8、溶氧50%、搅拌速度50转/分钟，进行反应器自动控制培养，其中生物反应器容积为75L ;微载体为Cytodex系列微载体，微载体在使用前，需清洗、灭菌，具体步骤为:I)称量Cytodexl微载体500g、使用20LPBS液浸泡过夜；2)用IOLPBS液清洗3遍；3)加入IOLPBS液浸泡微载体，121°C蒸汽灭菌三十分钟；
[0045](4)制苗毒液的繁殖:培养后第三日观察微载体上细胞基本长满，且细胞计数结果为9.0X 106/ml后进行接毒操作，接毒前用含有10ug/ml胰酶的病毒培养液(病毒培养液配方为:不含血清，含有胰酶的DMEM液、加各100单位/ml的青霉素钠和硫酸链霉素，pH为6.8)洗涤4次。接种量为0.3M0I，设定培养温度37°C、pH6.8、溶氧50%、搅拌速度60转/分钟，进行反应器自动控制培养，接毒后每隔一定时间取反应器中微载体，用显微镜观察细胞病变情况；
[0046](5)病毒液的收获:待微载体上细胞基本全部脱落，且溶解氧值呈明显上升趋势，将反应器内液体连同微载体一起收获，置与_20°C条件下反复冻融2次，然后经离心或过滤去除微载体及细胞碎片，即制得伪狂犬病毒疫苗，于-20°C冷冻保存备用。
[0047]对伪狂犬病毒疫苗进行检验:按《中华人民共和国兽药典》(2010年版)附录42、49页进行检验，无细菌、霉菌、支原体生长。收获的毒液进行病毒含量测定，计算TCID5tl,每0.1ml 病毒含量≥ 108.3TCLD500
[0048](6)配苗、分装及冻干:将检验合格的伪狂犬病毒疫苗与稳定剂按1:1比例混合，同时加入抗生素，充分摇匀，定量分装；分装后进行冷冻真空干燥后即得伪狂犬病毒疫苗成品O
[0049]成品检验:按《中华人民共和国兽药典》(2010年版)进行检验，符合“伪狂犬细胞活疫苗”的规定，每头份疫苗病毒含量> 103_ 7TCLD5tlt5。
[0050]在本说明书中所谈到的“一个实施例”、“另一个实施例”、“实施例”、等，指的是结合该实施例描述的具体特征、结构或者特点包括在本申请概括性描述的至少一个实施例中。在说明书中多个地方出现同种表述不是一定指的是同一个实施例。进一步来说，结合任一实施例描述一个具体特征、结构或者特点时，所要主张的是结合其他实施例来实现这种特征、结构或者特点也落在本发明的范围内。
[0051]尽管这里参照本发明的多个解释性实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本申请公开、附图和权利要求的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变型和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。
【权利要求】
1.一种伪狂犬病毒疫苗的生产方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)制苗用细胞的传代与培养:取细胞培养瓶中生长良好的传代细胞系细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液在细胞培养瓶中继续培养，培养温度为37°C，形成细胞单层时，用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养； (2)制苗用毒种的繁殖:将毒种用DMEM细胞培养基配制的细胞维持液稀释10倍，接种细胞单层，培养48~72小时，当细胞病变达75%以上时，收获感染细胞毒液，即为生产用毒种； (3)传代细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养:取步骤(1)中已形成的细胞单层，经EDTA-胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，按5X 105/mL~5X 106/mL的细胞密度接种于生物反应器中，在生物反应器中加入微载体，设定培养条件为:温度37°C、pH6.8~7.6、溶氧30%~60%和搅拌速度30~60转/分钟； (4)制苗毒液的繁殖:当细胞达到5X106/mL~5X10VmL后进行接毒操作，所接入毒种为步骤(2)中生产的毒种，接毒前用含有10ug/mL胰酶的病毒培养液将长满细胞的微载体洗涤2~4次，设定培养条件为:温度37°C、pH6.8~7.6、溶氧30%~60%和搅拌速度30~60转/分钟； (5)伪狂犬病毒疫苗的收获:待微载体上细胞全部脱落，且溶解氧值呈明显上升趋势，将反应器内液体连同微载体一起收获，置与-20°C条件下反复冻融2次，然后经离心或过滤去除微载体及细胞碎片，即制得伪狂犬病毒疫苗。
2.根据权利要求1所述伪狂犬病毒疫苗的生产方法，其特征在于，步骤(1)中所述的传代细胞系为BHK-21细胞系、PK-15细胞系、IBRS-2细胞系、Marc-145细胞系、Vero细胞系或ST细胞系。
3.根据权利要求1所述伪狂犬病毒疫`苗的生产方法，其特征在于，所述生物反应器为能够自动控制温度、pH、溶氧和搅拌速度参数的生物反应器，所述生物反应器的容积为3L ~3000L。
4.根据权利要求1所述伪狂犬病毒疫苗的生产方法，其特征在于，所述微载体为以交联葡聚糖为基质，用带有正电荷的N，N- 二乙氨乙基基团进行取代的Cytodex系列微载体。
5.根据权利要求4所述伪狂犬病毒疫苗的生产方法，其特征在于，所述微载体在使用前需清洗、灭菌，具体方法为:用PBS浸泡微载体过夜，然后用PBS清洗微载体3遍，再用PBS浸泡微载体，121°C蒸汽灭菌30分钟，微载体经清洗、灭菌处理后，加入到已灭菌的生物反应器中，用高糖型DMEM清洗。
6.根据权利要求1所述伪狂犬病毒疫苗的生产方法，其特征在于，所述EDTA-胰酶细胞分散液是由质量体积分数为0.25%的规格为1:250的胰酶、质量体积分数为0.02%的EDTA的Hank’s液组成，所述规格1:250胰酶为每克胰酶中含有250个活力单位的胰蛋白酶。
7.根据权利要求1所述伪狂犬病毒疫苗的生产方法，其特征在于，所述细胞生长液由重量分数90%~98%的DMEM液、重量分数2%~10%的牛血清及100~500单位/ml的抗菌素组成，所述细胞生长液pH为6.8~7.6。
8.根据权利要求1所述伪狂犬病毒疫苗的生产方法，其特征在于，所述步骤(4)中的病毒培养液为含有胰酶的DMEM液，且DMEM液中含有100~500单位/ml的抗菌素，所述病毒培养液pH为6.8~7.6。
9.根据权利要求7或8所述伪狂犬病毒疫苗的生产方法，其特征在于，所述抗菌素为青霉素纳和硫Ife链霉素的混合物。
10.根据权利要求1所述伪狂犬病毒疫苗的生产方法，其特征在于，所述步骤(4)中的毒种接种量为0.01 ~0.5MOI。
【文档编号】A61P31/22GK103550772SQ201310529245
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月31日 优先权日:2013年10月31日
【发明者】徐宏军, 胡来根, 任丽, 张奕强, 岳丰雄 申请人:成都天邦生物制品有限公司