专利名称:应用生物反应器工业化生产伪狂犬病疫苗的方法
技术领域：
本发明属于兽用生物制品技术领域：
，具体涉及一种应用生物反应器工业化生产伪 狂犬病疫苗的方法。
背景技术：
猪伪狂犬病(Pseudorabies，Pr)，是由疱疹病毒科猪疱疹病毒I型伪狂犬病毒引 起的传染病。我国将其列为二类动物疫病。伪狂犬病已呈世界流行，在我国也广泛存在，许 多规模化养猪场均使用伪狂犬病疫苗来预防和控制该病。
目前伪狂犬病疫苗的生产主要是采用传统的转瓶工艺，即伪狂犬病毒接种已形成 单层的细胞，培养后一次性收获病毒液。但是每个转瓶均是独立的细胞培养单元，每瓶细胞 的质量、病毒产量和滴度都不同，导致疫苗批间差异大，而且操作劳动强度大，生产效率低， 隐性污染引起的高内毒素等缺点，已经越来越不适应当前疫苗大规模生产的要求。
专利公开号为CN101695573A的专利申请，公开了一种应用利用传代细胞源生产 伪狂犬病活疫苗的方法，其传代细胞为ST细胞、PK-15和IBRS-2细胞，生产工艺为转瓶工 艺；专利公开号为CN101695572 A的专利申请，公开了一种应用生物反应器生产伪狂犬活 疫苗的方法，其生物反应器为TideCell固定床微载体生物反应器。但是利用搅拌式生物反 应器，采用逐级放大的倒罐式操作技术，进行细胞的高密度培养以制备疫苗，未见报道。
发明内容
本发明的目的为了克服伪狂犬病疫苗现有生产工艺的缺陷，提供了一种应用生物 反应器工业化生产伪狂犬病疫苗的方法，其优点是设备占地面积小、生产规模大；培养速度 快、生产效率高；生产机械化，易于自动控制；培养设备密闭，不易污染；副产物少，疫苗的 副反应小；生产的病毒液效价高，与传统的转瓶工艺相比，收获的病毒液滴度提高了 0. 5 1. 5个IogTCID5ciAil，疫苗质量稳定。
本发明的技术方案为
—种应用生物反应器工业化生产伪狂犬病疫苗的方法，其特征在于包括如下步 骤(1)用微载体培养制苗用细胞将微载体和生物反应器经灭菌后，接种制苗用细胞，进 行培养，待微载体上的细胞形成致密的单层，接种伪狂犬病毒，并继续培养，使病毒繁殖，所 述的制苗用细胞为对伪狂犬病病毒毒株敏感的细胞，且为猪睾丸细胞系(ST)、猪肾细胞系 (PK-15)细胞或乳仓鼠肾细胞(BHK-21) ； (2)每天按时取样观察细胞病变情况，待细胞病变 达到80%以上时，停止培养，收获病毒液制得伪狂犬病活疫苗；或将收获的病毒液灭活后 制成灭活疫苗。
病毒的接种量为0. 001 IMOI。
所述的生物反应器设定参数为pH 6. 5 7. 8、温度33 37°C、溶氧30 80%、 搅拌速度30 lOOrpm。考虑到细胞培养的最适条件，优选的pH 7. 0 7. 4、细胞培养阶段 温度设定37°C，病毒培养阶段温度设定35°C、溶氧50%、搅拌速度30 lOOrpm。[0010]所述的微载体为Cytodex系列微载体，微载体的使用密度为2 25g/L。
所述的生物反应器为搅拌式生物反应器。
所述的生物反应器容积为14 150L。制苗用细胞可采用14L 40L或14L 40L 150L逐级放大的培养模式，即通过胰酶将14L生物反应器培养的细胞消化下来，作为 种子细胞接种到40L的生物反应器，再将40L的反应器内培养的细胞消化下来作为种子细 胞接种到150L生物反应器，如此形成生物反应器之间的逐级放大培养过程，从而避免了单 纯的用转瓶培养种子细胞而容易造成污染和增加劳动强度的缺陷；或，直接用14L、40L或 150L生物反应器培养病毒。
所述的生物反应器的培养采用批式、流加或灌注培养的方式，灌注的速率根据细 胞的密度以每天0. 5 4个工作体积。
伪狂犬病毒可以是制苗用的强毒株，用来制备灭活苗；也可以是制苗用弱毒株，制 备弱毒活疫苗。
本发明采用生物反应器微载体培养技术进行细胞的高密度培养，生产伪狂犬病 疫苗，与传统的转瓶生产工艺相比，自动化控制程度高，生产可实时监控；节省人力，降低 成本；生产用地少，规模易于扩大；生产的病毒滴度高，批间差异小，产品质量稳定，副反应
图Ia为细胞接种后池的微载体细胞图片。
图Ib为细胞接种后5d的微载体细胞图片。
图Ic为细胞接毒后病变的微载体细胞图片。
图2为细胞生长曲线。
具体实施方式
以下是本发明一个具体的实施方案，以进一步的阐述本发明，但不能解释为限制 本发明的范围。
实施例一生物反应器美国NBS公司14L和40L生物反应器，生物反应器设定参 数为pH 7. 2、温度37°C、溶氧50%、搅拌速度30 IOOrpm ；
微载体通用电气医疗集团生命科学部Cytodexl ；
伪狂犬病毒Bartha_K61株；
细胞生长液含体积浓度为8%小牛血清的DMEM(北京清大天一生物技术有限公 司)；
病毒维持液含体积浓度为小牛血清的DMEM(北京清大天一生物技术有限公 司)；
细胞培养分别在14L生物反应器内，按照10g/L的浓度加入Cytodex-Ι，水化后， 用pH7. 4的磷酸盐缓冲液PBS淘洗几遍，灭菌，接种ST细胞，进行培养；每天定时取样观察 细胞生长情况，进行细胞计数，测定葡萄糖的消耗，当细胞的密度达到1. 5 X 106/ml时，开始 灌注，灌注的速度依据细胞的密度、葡萄糖的消耗以每天0. 5 4个工作体积，以维持细胞 的生长，培养4d，细胞的密度达到6 X 106/ml。[0027]微载体培养的放大待14L生物反应器细胞的密度达到6X 106/ml，将长满细胞的 微载体收集到特定密闭容器中，用含质量浓度为0. 02% EDTA的pH7. 4的磷酸盐缓冲液PBS 缓冲液清洗细胞两次，加入37°C预热的含质量浓度为0. 02% EDTA、质量浓度为0. 25%胰酶 的胰酶消化液，消化lOmin，排出多余的胰酶溶液，加入细胞生长液，终止残余胰酶的消化， 启动容器搅拌使其充分分散消化的细胞，然后将消化分散的细胞悬液接种到40L的生物反 应器，按照上述的培养方法进行培养。
病毒繁殖当40L生物反应器细胞的密度达到7X 106/ml，排出细胞生长液并更换 成病毒维持液，按照0. 05M0I接种伪狂犬病毒；接毒后他开始灌注培养，以维持病毒繁殖所 必需的营养物质，同时收获病毒液，待细胞病变达到80%以上时，停止培养，测定病毒含量 为9. 41ogTCID5(1/ml，将收获的病毒液置于2 8°C中，或保存在_20°C。
制备疫苗将上述收获的病毒液按病毒液与冻干保护剂的体积比为1 2加入质 量浓度为5%蔗糖脱脂乳冻干保护剂，制备成冻干活疫苗。
实施例二 生物反应器美国NBS公司14L和40L生物反应器，生物反应器设定参 数为pH 7. 2、温度37°C、溶氧50%、搅拌速度30 IOOrpm ；
微载体=Cytodexl (通用电气医疗集团生命科学部)；
伪狂犬病毒鄂A强毒株
细胞生长液含体积浓度为8%小牛血清的DMEM/F12(北京清大天一生物技术有 限公司)；
病毒维持液含体积浓度为小牛血清的DMEM/F12(北京清大天一生物技术有 限公司)；
细胞培养分别在14L生物反应器内，按照10g/L的浓度加入Cytodexl，水化后， 用pH7. 4的磷酸盐缓冲液PBS淘洗几遍，灭菌，接种ST细胞，进行培养；每天定时取样观察 细胞生长情况，进行细胞计数，测定葡萄糖的消耗，当细胞的密度达到1. 5 X 106/ml时，开始 灌注，灌注的速度依据细胞的密度、葡萄糖的消耗以每天0. 5 4个工作体积，以维持细胞 的生长，培养4d，细胞的密度达到6 X 106/ml。
微载体培养的放大待14L生物反应器细胞的密度达到6X 106/ml，将长满细胞的 微载体收集到特定密闭容器中，用含质量浓度0. 02% EDTA的pH7. 2的磷酸盐缓冲液PBS缓 冲液清洗细胞两次，加入37°C预热的含质量浓度0. 02% EDTA、质量浓度0. 25%胰酶的胰酶 消化液，消化8min，排出多余的胰酶溶液，加入细胞生长液，终止残余胰酶的消化，启动容器 搅拌使其充分分散消化的细胞，然后将消化分散的细胞悬液接种到40L的生物反应器，按 照上述的培养方法进行培养。
病毒繁殖当40L生物反应器细胞的密度达到7X 106/ml，排出细胞生长液并更换 成病毒维持液，按照0. 05M0I接种伪狂犬病毒；接毒后他开始灌注培养，以维持病毒繁殖所 必需的营养物质，同时收获病毒液，待细胞病变达到80%以上时，结束培养，测定病毒含量 为9. 01ogTCID5(1/ml，将收获的病毒液置于2 8°C中，或保存在_20°C。
制备疫苗将上述收获的病毒液灭活后，按抗原和油佐剂1 1比例加入油佐剂， 乳化配制成灭活疫苗。油佐剂的配制为94% (V/V)白油、6% (V/V) ^Span-80,2% (g/V) 硬脂酸铝。
权利要求
1.一种应用生物反应器工业化生产伪狂犬病疫苗的方法，其特征在于包括如下步骤 (1)用微载体培养制苗用细胞将微载体和生物反应器经灭菌后，接种制苗用细胞，进行 培养，待微载体上的细胞形成致密的单层，接种伪狂犬病毒，并继续培养，使病毒繁殖，所 述的制苗用细胞为对伪狂犬病病毒毒株敏感的细胞，且为猪睾丸细胞系(ST)、猪肾细胞系 (PK-15)或乳仓鼠肾细胞系(BHK-21) ； (2)待细胞病变达到80%以上时，停止培养，收获病 毒液制得伪狂犬病活疫苗；或将收获的病毒液灭活后制成灭活疫苗。
2.根据权利要求
1所述应用生物反应器工业化生产伪狂犬病疫苗的方法，其特征在 于病毒的接种量为0. 001 IMOI。
3.根据权利要求
1所述应用生物反应器工业化生产伪狂犬病疫苗的方法，其特征在 于所述的生物反应器设定参数为pH 6. 5 7. 8、温度33 37°C、溶氧30 80%、搅拌速 度 30 lOOrpm。
4.根据权利要求
1 3之一所述应用生物反应器工业化生产伪狂犬病疫苗的方法，其 特征在于所述的微载体为Cytodex系列微载体，微载体的使用密度为2 25g/L。
5.根据权利要求
1 4之一所述应用生物反应器工业化生产伪狂犬病疫苗的方法，其 特征在于所述的生物反应器为搅拌式生物反应器。
6.根据权利要求
1 5之一所述的应用生物反应器工业化生产伪狂犬病疫苗的方法， 其特征在于所述的生物反应器容积为14 150L ；或，制苗用细胞经过14L 40L或14L 40L 150L逐级放大培养后，于40L或150L生物反应器培养伪狂犬病毒；或，直接用14L、 40L或150L的生物反应器培养病毒。
7.根据权利要求
1 6之一所述应用生物反应器工业化生产伪狂犬病疫苗的方法，其 特征在于所述的生物反应器的培养采用批式、流加或灌注培养的方式，灌注的速率根据细 胞的密度为每天0. 5 4个工作体积。
专利摘要
本发明涉及一种应用生物反应器工业化生产伪狂犬病疫苗的方法，包括如下步骤(1)将微载体和生物反应器经灭菌后，接种制苗用细胞，进行培养，待微载体上的细胞形成致密的单层，接种伪狂犬病毒，并继续培养，使病毒繁殖；(2)待细胞病变达到80％以上时，停止培养，收获病毒液制得伪狂犬病疫苗。本发明采用生物反应器微载体培养技术进行细胞的高密度培养，生产伪狂犬病疫苗，与传统的转瓶生产工艺相比，自动化控制程度高，生产可实时监控；节省人力，降低成本；生产用地少，规模易于扩大；生产的病毒滴度高，批间差异小，产品质量稳定，副反应小。
文档编号C12R1/93GKCN102038946SQ201010282142
公开日2011年5月4日 申请日期2010年9月15日
发明者刘汉平, 李伟, 温文生, 漆世华, 王桢桢, 秦红刚, 肖敏 申请人:武汉中博生物股份有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan