伪狂犬病毒、伪狂犬病疫苗及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了狂犬病毒、伪狂犬病疫苗及其制备方法。其中，伪狂犬病毒以保藏号CGMCC?No.8057保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该伪狂犬病毒具有较强的毒力，免疫原性好，毒价较高，利用该伪狂犬病毒生产的疫苗安全性好，免疫保护期长。
【专利说明】伪狂犬病毒、伪狂犬病疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及伪狂犬病毒和伪狂犬病疫苗及其制备方法。【背景技术】
[0002]伪狂犬病(PorcinePseudorabies)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus, PRV)引起的发生在多种家畜和野生动物体内的一种急性传染病，以发热、奇痒、脑脊髓炎为主要发病症状。伪狂犬病最早在1813年发生于英国的牛群中。Aujeszky、Schmiedhoffer和Sangirg相继发现并分离出PRV。成年猪常表现为隐性感染，妊娠母猪感染后可引起流产、死胎以及呼吸系统疾病症状，无奇痒。新生仔猪感染后除了出现神经症状外，还可侵害消化系统。本病呈世界性分布。猪既是本病原的原发感染宿主，又是病毒的长期贮存者和排毒者，在伪狂犬病的传播上起着重要作用。伪狂犬病给猪养殖业造成的危害仅次于猪瘟。
[0003]20世纪60年代以后，据报道，由于强毒株的出现，该病现已遍及欧洲、东南亚、南美洲、中美洲及非洲等50多个国家和地区，仅芬兰、挪威等少数国家仍无伪狂犬病的报道。我国周边一些国家如泰国、韩国、日本、菲律宾、老挝、马来西亚、新加坡、越南等均有伪狂犬病的流行。伪狂犬病的传播和蔓延，给养殖业造成了巨大损失，全世界每年因伪狂犬病造成的经济损失高达数十亿美元，因此该病引起了世界各国的高度重视。
[0004]到目前为止，已有北京、河南、上海、广东、广西、江苏、江西、福建、浙江、安徽、四川、陕西、甘肃、黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、台湾等20多个省(市)、自治区和香港特区报道发现了该病。PR在中国主要为地方性流行，特别对种猪场和集约化猪场危害严重，目前该病在我国的流行仍在不断地蔓延扩大，已经造成了严重的经济损失，成为影响我国畜牧业特别是猪养殖业发展的重要制约因素。
[0005]鉴于上述，生产一种安全性及免疫原性好，且免疫保护期长的伪狂犬病疫苗是预防和控制伪狂犬病的一种行之有效的方法。
【发明内容】
[0006]本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的目的在于提出一种伪狂犬病毒和伪狂犬病疫苗及其制备方法。
[0007]在本发明的第一方面，本发明提出了一种伪狂犬病毒，根据本发明的实施例，该伪狂犬病毒以保藏编号CGMCC N0.8057保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，根据本发明的具体实施例，所述的伪狂犬病毒是从经过正常免疫的患有猪伪狂犬病的病猪体内筛选分离得到，其毒价TCID5tl为107 5/ml，因此，所述的伪狂犬病毒株毒性好，具有良好的免疫原性，可作为灭活疫苗生产毒株及检验毒种。
[0008]在本发明的第二方面，本发提出了上述伪狂犬病毒在制备伪狂犬病疫苗中的用途，在本发明一个实施例中，根据伪狂犬病毒交叉免疫保护试验证明，所述的伪狂犬病毒具有很好的交叉免疫保护作用。因此利用该伪狂犬病毒生产伪狂犬病疫苗，可以有效提高伪狂犬病疫苗的免疫原性，从而进一步提高伪狂犬病疫苗安全性及免疫保护期。[0009]在本发明的第三方面，本发明提出了一种伪狂犬病疫苗，根据本发明的实施例，该伪狂犬病疫苗包括灭活的伪狂犬病毒以及佐剂。从而有效提高伪狂犬病疫苗的免疫原性，进一步提高伪狂犬病疫苗安全性及免疫保护期。
[0010]根据本发明的实施例，本发明的上述实施例的伪狂犬病疫苗还包括如下附加技术特征:
[0011]根据本发明的一个实施例，所述的伪狂犬病疫苗是通过β-丙内酯灭活的，由此可以有效提高伪狂犬病疫苗的免疫原性，同时可以进一步提高伪狂犬病疫苗安全性及免疫保护期。
[0012]根据本发明的一个实施例，所述的伪狂犬病疫苗所采用的佐剂为MARC0L52。从而有效提高伪狂犬病疫苗的免疫原性，进一步提高伪狂犬病疫苗安全性及免疫保护期。
[0013]根据本发明一个实施例，在所述的伪狂犬病疫苗中，所述伪狂犬病毒与所述佐剂的比例为(2:3)~(2:4)，由此可以提高伪狂犬病疫苗的免疫原性，同时可以进一步提高伪狂犬病疫苗安全性及免疫保护期。
[0014]在本发明的第四方面，本发明提出了一种制备伪狂犬病疫苗的方法，根据本发明的实施例，该方法包括对所述的伪狂犬病毒进行灭活，以便获得经过灭活的伪狂犬病毒；以及将所述经过灭活的伪狂犬病毒与佐剂混合，以便获得所述伪狂犬病疫苗。由此，可以有效提高伪狂犬病疫苗的免疫原性，从而进一步提高伪狂犬病疫苗安全性及免疫保护期。
[0015]根据本发明的一个实施例，本发明上述实施例的制备伪狂犬病疫苗的方法还包括如下附加技术特征:
[0016]根据本发明的一个实施例，在对所述伪狂犬病毒进行灭活之前，包括按照下列步骤获得伪狂犬病毒培养液:将所 述伪狂犬病毒接种于形成有ST细胞层的培养容器中，并在35.5~37.5摄氏度下进行培养，收集所获得的细胞培养物；将所述细胞培养物进行冻融裂解，以便获得裂解混合物；分离所述裂解混合物的上清液，以便获得所述伪狂犬病毒培养液。根据本发明的实施例，所述的ST细胞指的是猪睾丸细胞。所述的ST细胞层是在浓度为5%~10%的新生牛血清的DMEM培养基中培养获得。由此，有效的提高伪狂犬病疫苗的免疫原性，从而进一步提高伪狂犬病疫苗安全性及免疫保护期。
[0017]根据本发明一个实施例，对所述伪狂犬病毒进行灭活包括:在4摄氏度下，利用终浓度为1:3000的β -丙内酯对伪狂犬病毒培养液进行灭活处理24小时；以及在37摄氏度下，使所述丙内酯发生水解，以便获得含有灭活伪狂犬病毒的溶液。由此，提高伪狂犬病疫苗的免疫原性，从而进一步提高伪狂犬病疫苗安全性及免疫保护期。
[0018]根据本发明一个实施例，将所述经过灭活的伪狂犬病毒与佐剂混合包括:将含有灭活伪狂犬病毒的溶液与MARC0L52白油佐剂按照体积比为2:3进行混合乳化，以便获得所述伪狂犬病疫苗。由此，提高伪狂犬病疫苗的免疫原性，从而进一步提高伪狂犬病疫苗安全性及免疫保护期。
[0019]本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
【具体实施方式】
[0020]本发明是基于发明人的下列发现而完成的:发明人分离了一株伪狂犬病毒，该病毒在经过灭活后可以用作制备猪伪狂犬病疫苗，用于防止猪感染伪狂犬病。
[0021]在本发明的一个方面，本发明提出了一种伪狂犬病毒，根据本发明的实施例，该伪狂犬病毒以保藏编号CGMCC N0.8057保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，根据本发明的一个实施例，伪狂犬病毒是从经过正常免疫的患有猪伪狂犬病的病猪体内筛选分离得到，其毒价TCID5tl为107_ 5/ml，因此，分离得到的伪狂犬病毒株毒性好，具有良好的免疫原性，可作为灭活疫苗生产毒株及检验毒种，根据本发明一个实施例，伪狂犬病毒交叉免疫保护试验证明，该伪狂犬病毒具有很好的交叉免疫保护作用。因此可以利用该伪狂犬病毒生产伪狂犬病疫苗，有效提高伪狂犬病疫苗的免疫原性，从而进一步提高伪狂犬病疫苗安全性及免疫保护期。
[0022]在本发明的另一方面，本发提出了上述伪狂犬病毒在制备伪狂犬病疫苗中的用途，在本发明一个实施例中，根据伪狂犬病毒交叉免疫保护试验证明，所述的伪狂犬病毒具有很好的交叉免疫保护作用。因此利用该伪狂犬病毒生产伪狂犬病疫苗，可以有效提高伪狂犬病疫苗的免疫原性，从而进一步提高伪狂犬病疫苗安全性及免疫保护期。
[0023]在本发明的再一方面，本发明提出了一种伪狂犬病疫苗，根据本发明的实施例，该伪狂犬病疫苗包括灭活的伪狂犬病毒以及佐剂。根据本发明的实施例，该伪狂犬病疫苗的免疫持续期至少可以维持6个月，从而有效提高伪狂犬病疫苗的免疫原性，进一步提高伪狂犬病疫苗安全性及免疫保护期。根据本发明的实施例，该伪狂犬病疫苗可在2摄氏度-8摄氏度下保存12个月，从而有效提高伪狂犬病疫苗的免疫原性，进一步提高伪狂犬病疫苗安全性及免疫保护期。
[0024]根据本发明的一个实施例，可以采用的灭活剂种类并不受特别限制，只要可以有效破坏伪狂犬病毒的核酸结构即可，但不破坏伪狂犬病毒的免疫原结构。根据本发明一个实施例，所采用的灭活剂为丙内酯，丙内酯可以有效破坏伪狂犬病毒的DNA结构，进而达到灭活伪狂犬病毒的目的。但丙内酯并不破坏伪狂犬病毒的衣壳蛋白，进而保护了伪狂犬病毒的免疫原性。由此，进一步提高了伪狂犬病疫苗的免疫原性，安全性及免疫保护期。
[0025]根据本发明的一个实施例，所采用的灭活剂丙内酯终浓度并不受特别限制，只要能够有效灭活伪狂犬病毒即可。根据本发明一个实施例，所采用的丙内酯的终浓度为1:3000。由此，有效提高伪狂犬病疫苗的免疫原性，安全性及免疫保护期。
[0026]根据本发明的一个实施例，伪狂犬病疫苗所采用的佐剂为MARC0L52。从而有效提高伪狂犬病疫苗的免疫原性，进一步提高伪狂犬病疫苗安全性及免疫保护期。根据本发明实施，所采用的佐剂的种类并不受特别限制，只要可以有效增强伪狂犬病毒抗原表面面积，并能延长伪狂犬病毒抗原在体内保留时间，使伪狂犬病毒抗原与淋巴系统细胞有充分接触时间，从而保证接种伪狂犬病疫苗后，可以产生充足的抗体，进而保护机体免受伪狂犬病毒的伤害。根据本发明的一个实施例，发明人意外发现，采用MARC0L52白油佐剂效果优于其他佐剂。由此，提高制备伪狂犬病疫苗的安全性、免疫原性及免疫保护期。
[0027]根据本发明一个实施例，在所述的伪狂犬病疫苗中，所述伪狂犬病毒与所述佐剂的比例为(2:3)~(2:4)，从而提高伪狂犬病疫苗的免疫原性，进一步提高伪狂犬病疫苗安全性及免疫保护期。
[0028] 在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备伪狂犬病疫苗的方法，根据本发明的实施例，该方法包括对伪狂犬病毒进行灭活，以便获得经过灭活的伪狂犬病毒；以及将经过灭活的伪狂犬病毒与佐剂混合，以便获得伪狂犬病疫苗。由此，有效提高伪狂犬病疫苗的免疫原性，从而进一步提高伪狂犬病疫苗安全性及免疫保护期。
[0029]根据本发明的一个实施例，在对伪狂犬病毒进行灭活之前，包括按照下列步骤获得伪狂犬病毒培养液:将伪狂犬病毒接种于形成有ST细胞层的培养容器中，并在35.5~37.5摄氏度下进行培养，收集所获得的细胞培养物；将细胞培养物进行冻融裂解，以便获得裂解混合物；分离裂解混合物的上清液，以便获得伪狂犬病毒培养液。根据本发明的具体实施例，ST细胞指的是猪睾丸细胞。ST细胞层是在浓度为5%~10%的新生牛血清的DMEM培养基中培养获得。由此，有效的提高伪狂犬病疫苗的免疫原性，从而进一步提高伪狂犬病疫苗安全性及免疫保护期。根据本发明一个实施例，在伪狂犬病毒接种于ST细胞单层之前，先将伪狂犬病毒稀释至浓度为0.3%，接种后，在35.5~37.5摄氏度下进行培养30分钟，使得伪狂犬病毒充分吸附于ST细胞。从而有利于得到毒价高的伪狂病毒培养液，进而提高制备伪狂犬病疫苗的安全性及免疫保护期。
[0030]根据本发明的一个实施例，对所述伪狂犬病毒进行灭活的条件并不受特别限制，根据本发明的具体实施例，可以在4摄氏度下，利用终浓度为1:3000的β-丙内酯对伪狂犬病毒培养液进行灭活处理24小时；以及在37摄氏度下，使所述β -丙内酯发生水解，以便获得含有灭活伪狂犬病毒的溶液。由此，提高伪狂犬病疫苗的免疫原性，从而进一步提高伪狂犬病疫苗安全性及免疫保护期。
[0031]根据本发明的一个实施例，当有75%~80%的ST细胞出现细胞病变时，收集所获得的细胞培养物。细胞病变指的是ST细胞单层出现空洞，细胞变圆、聚集、溶解和脱落。从而有利于得到毒价高的伪狂犬病毒培养液，进而获得优异性能的伪狂犬病疫苗。根据本发明一个实施例，所获得的细胞培养物经过冻融，以便得到细胞毒液。根据本发明的实施例，冻融次数并不受特别限制，只要可以将ST细胞充分裂解即可。根据本发明的实施例，分离裂解混合物的上清液的方式并不受特别限制，只要可以有效将含有伪狂犬病毒的细胞毒液与细胞残余碎片物分离即可。 用连续流离心的方式分离裂解混合物，从而有利于得到毒价高的伪狂犬病毒培养液，从而进一步提高所获得的伪狂犬病疫苗的免疫原性，及安全性。
[0032]根据本发明的一个实施例，所采用的灭活剂丙内酯终浓度并不受特别限制，只要可以有效灭活伪狂犬病毒即可。根据本发明的具体实施例，所采用的丙内酯的终浓度为1:3000。由此可以有效提高伪狂犬病疫苗的免疫原性，安全性及免疫保护期。根据本发明的实施例，灭活剂灭活的时间及温度并不受特别限制，只要可以有效破坏伪狂犬病毒的核酸结构即可。根据本发明具体实施例，在4摄氏度下灭活伪狂犬病毒的培养液24小时，以便得到充分灭活的伪狂犬病毒的培养液。由此，有效提高伪狂犬病疫苗的免疫原性，安全性及免疫保护期。
[0033]根据本发明的一个实施例，经过灭活的伪狂犬病毒的培养液置于37摄氏度水浴中，使β_丙内酯水解，从而有效提高伪狂犬疫苗的安全性。根据本发明的具体实施例，在水浴中水解的时间并不受特别限制，只要可以使得伪狂犬病毒的培养中的丙内酯充分水解即可，由于丙内酯本身对机体有伤害，但其水解产物对机体并无危害。所以灭活伪狂犬病毒之后将丙内酯充分水解，可以有效降低伪狂犬疫苗接种动物后产生不良的副反应。由此，进一步提高伪狂犬疫苗的安全性。根据本发明一个实施例，在伪狂犬病毒的培养液中整个灭活过程中，需要不间断搅拌伪狂犬病毒培养液。从而进一步提高伪狂犬病毒培养液的灭活效果，从而进一步提高伪狂犬病疫苗的安全性。
[0034]根据本发明的一个实施例，取部分经过灭活的伪狂犬病毒培养液，接种于ST细胞单层培养器中，经过盲传三代，若无细胞病变，及表明伪狂犬病毒培养液灭活完全。
[0035]根据本发明一个实施例，将经过灭活的伪狂犬病毒与佐剂混合包括:将含有灭活伪狂犬病毒的溶液与MARC0L52白油佐剂按照体积比为2:3进行混合乳化，以便获得伪狂犬病疫苗。由此，提高伪狂犬病疫苗的免疫原性，从而进一步提高伪狂犬病疫苗安全性及免疫保护期。
[0036]根据本发明实施，所采用的佐剂的种类并不受特别限制，只要可以有效增强伪狂犬病毒抗原表面面积，并能延长伪狂犬病毒抗原在体内保留时间，使伪狂犬病毒抗原与淋巴系统细胞有充分接触时间，从而保证接种伪狂犬病疫苗后，可以产生充足的抗体，进而保护机体免受伪狂犬病毒的伤害。根据本发明的一个实施例，发明人意外发现，米用MARC0L52白油佐剂效果优于其他佐剂。由此，可以显著提高制备伪狂犬病疫苗的安全性、免疫原性及免疫保护期。
[0037]下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
[0038]实施例1伪狂犬病毒株获得及特性鉴定
[0039]取江苏某猪场发病猪的脑组织，剪碎研磨，用无菌生理盐水1:5稀释，置于离心管中反复冻融3次，3000转/mi n离心30min，取病料上清液经0.22 μ m微孔滤膜过滤，经ST细胞培养、病毒毒力测定、血清中和试验和PCR鉴定，证实为猪伪狂犬病病毒，命名为伪狂犬病病毒SH株。
[0040]实施例2制备伪狂犬病疫苗
[0041]1、将ST细胞接种于含有5%~10%的新生牛血清的DMEM培养基中培养，当ST细胞长满单层时，取按实施例1分离获得的伪狂犬病毒接种于含有ST细胞单层的培养器中。
[0042]2、将按实施例1分离获得的伪狂犬病毒稀释至百分浓度为0.3%，将稀释后的伪狂犬病毒液接种于含有ST细胞单层的培养器中。在37摄氏度下条件下控制细胞吸附伪狂犬病毒30分钟，然后加入含2%的新生牛血清DMEM的细胞维持液于37摄氏度下继续培养。培养36~48h，显微镜下观察，当75%~80%细胞病变时，收获细胞培养物。将收获的细胞培养物反复冻融3次，以便得到裂解混合物。
[0043]3、离心分离裂解混合物，以便获得伪狂犬病毒上清液。取上清液细胞毒液测定毒价，按每头份病毒含量为TCID5(l106_5/ml时为合格,将合格的细胞毒液置于灭菌容器内，加入终浓度为1:3000的β-丙内酯，在4摄氏度下灭活24小时，然后置于37摄氏度的水浴中水解2小时，灭活期间不断搅拌，获得灭活后的病毒液。
[0044]4、将灭活后的病毒液用DMEM液1:10稀释后，接种生长致密的ST细胞培养板(6孔)，接种量为每孔0.1mlo另外每孔加入含2%小牛血清的DMEM液2ml，同时设立阴性对照孔，37摄氏度下培养，观察细胞病变(CPE )。盲传3代，如果无细胞病变(CPE )则表明灭活完全。
[0045]5、将检验合格的细胞毒液与MARC0L52白油佐剂按照2:3混合乳化，得到伪狂犬病疫苗。[0046]在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。[0047]尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
【权利要求】
1.一种伪狂犬病毒,其以保藏号CGMCC N0.8057保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.权利要求1所述的伪狂犬病毒在制备伪狂犬病疫苗中的用途。
3.一种伪狂犬病疫苗，其特征在于，包含: 灭活的权利要求1所述的伪狂犬病毒；以及 佐剂。
4.根据权利要求3所述的伪狂犬病疫苗，其特征在于，所述伪狂犬病毒是被β-丙内酯灭活的。
5.根据权利要求3所述的伪狂犬病疫苗，其特征在于，所述佐剂为MARCOL52。
6.根据权利要求3所述的伪狂犬病疫苗，其特征在于，所述伪狂犬病毒与所述佐剂的比例为(2:3)~(2:4)。
7.一种制备伪狂犬病疫苗的方法，其特征在于，包括: 对权利要求1所述的伪狂犬病毒进行灭活，以便获得经过灭活的伪狂犬病毒；以及 将所述经过灭活的伪狂犬病毒与佐剂混合，以便获得所述伪狂犬病疫苗。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在对所述伪狂犬病毒进行灭活之前，包括按照下列步骤获得伪狂犬病毒培养液:. 将所述伪狂犬病毒接种于形成有ST细胞层的培养容器中，并在35.5~37.5摄氏度下进行培养； 收集所获得的细胞培养物； 将所述细胞培养物进行冻融裂解，以便获得裂解混合物；以及 分离所述裂解混合物的上清液，以便获得所述伪狂犬病毒培养液。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，对所述伪狂犬病毒进行灭活包括: 在4摄氏度下，利用终浓度为1:3000的β-丙内酯对伪狂犬病毒培养液进行灭活处理24小时；以及 在37摄氏度下，使所述β -丙内酯发生水解，以便获得含有灭活伪狂犬病毒的溶液。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，将所述经过灭活的伪狂犬病毒与佐剂混合包括: 将含有灭活伪狂犬病毒的溶液与MARCOL52白油佐剂按照体积比为2:3进行混合乳化，以便获得所述伪狂犬病疫苗。
【文档编号】A61P31/22GK103468645SQ201310388419
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年8月30日 优先权日:2013年8月30日
【发明者】熊炜, 高杨, 郑杰, 刘俊生, 刘延亭 申请人:北京中联康生物科技有限公司