一种猪伪狂犬病病毒株、疫苗组合物及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种疫苗组合物，该疫苗组合物包括免疫量的猪伪狂犬病病毒抗原和兽医学上接受的佐剂。该疫苗组合物可以在猪、犬体内诱导有效的免疫反应，且免疫该疫苗组合物的仔猪体温升高时间更短，食欲基本正常，并且基本没有临床症状，显示出很好的免疫保护。
CCTCC NO：V201335
2013.08.26
【专利说明】一种猪伪狂犬病病毒株、疫苗组合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种疫苗组合物，属于动物病毒学领域。
【背景技术】
[0002]伪狂犬病，又称Aujeszky氏病，是由疱疹病毒科（Herpesviridae)a亚科中的猪 疱疫病毒I型（Suidherpesviruslstrain)所引起的猪、牛、羊等多种家畜、家禽和野生动 物的一种以发热、奇痒（除猪外）及脑脊髓炎为主症的急性传染病。猪的伪狂犬病在我国 广泛存在，危害严重，是制约规模化猪场生产的主要疫病之一。它能引起妊娠母猪流产、死 胎或木乃伊胎和仔猪出现神经症状、麻痹，死亡率高。PRV具有较强的泛嗜性、神经嗜性及潜 伏感染特性，在外周神经系统可以长期潜伏感染，当潜伏病毒被激活变成有感染力的病毒， 被潜伏感染的宿主就会发病。
[0003] 研究表明亚单位疫苗能够给免疫动物提供相应的保护，亚单位疫苗是利用基因工 程方法将病原保护性抗原基因克隆到原核或真核表达系统中，使其高效表达而制成的疫 苗。目前发现伪狂犬病毒糖蛋白中的gB、gC、gD均能使机体产生中和抗体，这些抗体无论是 在体内、体外，还是在有无补体存在的情况下都有中和PRV的能力。"伪狂犬病亚单位疫苗 研究进展"（杨承槐，娄高明，谌南辉《江西畜牧兽医杂志》2004年第3期）公开了在伪狂犬 病病毒目前已发现的11种糖蛋白中，gB、gC、gD均能诱导机体产生中和抗体。在没有补体 的参与下，gB、gC、gD的单克隆抗体能中和PRV。猪和小鼠注射抗gB、gC、gD的单克隆抗体 均能抵抗PRV强毒的攻击。因此，gB、gC、gD是研制PRV亚单位疫苗的首选蛋白。糖蛋白gD 是一种重要的中和抗原，也是保护性抗体的主要目标，能诱导较好的保护反应。US6858385 和US6521231公开了利用猪伪狂犬病病毒gD蛋白可以制备疫苗用于猪伪狂犬病的预防。
[0004] 猪PRV只有一个血清型，通常认为毒株的交叉保护力很强，但目前仍存在仔猪注 射商品化疫苗后发生典型猪伪狂犬病，例如长时间体温升高，精神沉郁，食欲减退，出现呼 吸道和/或神经症状。
[0005] 伴随着伪狂犬毒株的变异，犬感染伪狂犬病毒引起的发病和死亡屡有发生，例如 刘蕾等人在"关注伪狂犬病患犬，它就在你面前，中国畜牧兽医学会小动物医学分会第六 次学术研讨会暨兽医外科学分会第十八次学术研讨会论文集第一部分，小动物医学文集， 56-59,2011。"报道了犬因为食用患伪狂犬的猪肉而发生伪狂犬病，并且利用PCR方法从犬 脑组织中扩增出了PRV基因片段。
【发明内容】
[0006] 为解决现有技术的不足，本发明的主要目的是提供一种猪伪狂犬病病毒株，其中， 所述猪伪狂犬病病毒株具有序列表SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列编码的gD糖蛋白。
[0007]本发明术语"gD糖蛋白"，是猪伪狂犬病病毒进行感染必需的结构蛋白，是成熟的 病毒粒子囊膜表面的主要糖蛋白之一，也称为gp50蛋白。
[0008]本发明术语"同源性"在本申请中是指两条氨基酸序列或两条核苷酸序列的相 似程度。氨基酸序列或核苷酸序列的同源性可以通过本领域公知的任何适当的方法计 算得到，例如，可以将目标氨基酸（或核苷酸）序列与参比氨基酸（或核苷酸）序列进行 序列比对，必要时可以引入空缺，使得两条比对的序列间相同的氨基酸（或核苷酸）数目 达到最优化，并在此基础上计算两条氨基酸（或核苷酸）序列之间相同氨基酸（或核苷 酸）的百分比。氨基酸（或核苷酸）序列的比对和同源性的计算可以通过本领域公知的 软件实现，例如，但不限于，BLAST软件（在美国国立生物技术信息中心（NCBI)的网址上 可获得：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，或者见，例如，AltschulS.F.et al,J.Mol.Biol. , 215 ：403-410(1990)；StephenF.etal,NucleicAcidsRes. ,25： 3389-3402(1997))，ClustalW2软件（在欧洲生物信息研究所网址上可获得：http://www. eji.ac.uk/Toolsa/clustalw2/,另见，例如，HigginsD.G.etal,MethodsinEnzymology, 266:383-402(1996)；LarkinM.A.etal,Bioinformatics(Oxford,England),23(21)： 2947-8(2007));和TCoffee软件等（在瑞典生物信息学研究所的网站上可以获得： http://tcofTee.vital-it.ch/cgi_bin/TcofTee/tcofTee_cgi/index.cgi，另见，例如，Poirot0.etal,NucleicAcidsRes. ,31(13) ：3503-6(2003)；NotredameC.etal,J.Mol. Boil.，302 (1) :205-17 (2000))。使用软件进行序列比对时，可以使用软件提供的默认参数， 或者也可以根据实际情况对软件提供的参数进行调整，这些都在本领域技术人员的知识范 围内。
[0009] "编码序列"在本申请中是指一种DNA序列，其能够被转录得到相应的RNA序列。
[0010] 本发明的主要目的在于提供一种猪伪狂犬病病毒株，所述猪伪狂犬病病毒株基因 组包含编码SEQ.NO. 1的gD蛋白的基因。
[0011] 本发明的另一目的在于提供一种猪伪狂犬病毒HN1202株（Pseudorabiesvirus, strainHN1202)，所述猪伪狂犬病毒株保藏号为V201335,保藏于中国典型培养物保藏中 心，地址为中国武汉?武汉大学，保藏日期为2013年8月26日。
[0012] 所述猪伪狂犬病毒HN1202 株（Pseudorabiesvirus，strainHN1202)保藏号为 CCTCCNO.V201335 ;保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉市?武汉大学， 保藏日期为2013年8月26日。
[0013] 本发明提供了一种DNA序列，所述DNA序列实质上编码SEQ.NO. 1的gD蛋白。
[0014] 本发明的再一目的在于提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括免疫量的所述 的猪伪狂犬病病毒抗原和兽医学上接受的佐剂。
[0015] 优选地，所述猪伪狂犬病病毒抗原为所述猪伪狂犬病病毒或其培养物的减毒全病 毒抗原、灭活全病毒抗原、亚单位抗原、合成肽抗原或基因工程抗原。
[0016] 优选地，所述猪伪狂犬病病毒抗原为含有序列表SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列 编码的gD糖蛋白毒株的抗原。
[0017] 所述术语"培养物"是病毒的不同代次传代培养物，本领域技术人员知晓不同代 次之间其基因序列仅可能会发生微小的变异，优选地，所述培养物是5-35代以内的培养 物。
[0018] 本发明所用的术语"活疫苗"指的是以毒力已经减弱但仍可在宿主体内或细胞上 复制的病毒制备的疫苗。本发明所用的术语"减毒"用于指以使病原丧失致病性、但保持免 疫原性的方式对基因进行突变来人工降低病原体毒性。通常，通过UV辐射、化学处理或体 外连续高阶继代培养实现减毒。人工的基因改变，例如将已知序列中的特定核苷酸缺失以 使毒力减弱。
[0019] 所用的术语"灭活疫苗"，也称作失活疫苗，指的是用作抗原以产生免疫力的灭活 病毒的混悬液。灭活疫苗的例子包括全病毒疫苗和裂解型疫苗。使用已知方法可以很容易 地产生灭活疫苗。例如，通过用甲醛溶液处理病毒可获得全病毒灭活疫苗。裂解型疫苗可 在用醚处理后由病毒包膜制备得到。
[0020] 术语"亚单位疫苗"指的是利用基因工程方法将病原体的保护性抗原基因克隆到 原核或真核表达系统中，使其高效表达而制成的疫苗。它比全病毒疫苗引起副反应的可能 性小。例如，表达的猪伪狂犬病病毒的gD蛋白可用于制备亚单位疫苗。
[0021] 术语"合成肽疫苗"指的是一种仅含免疫决定簇组分的小肽，即用人工方法按天 然蛋白质的氨基酸顺序合成保护性短肽，与载体连接后加佐剂所制成的疫苗。
[0022] 更优选地，所述猪伪狂犬病病毒抗原为所述猪伪狂犬病病毒HN1202株或其培养 物的减毒全病毒抗原、灭活全病毒抗原、亚单位抗原、合成肽抗原或基因工程抗原；优选地， 所述培养物为培养5-35代以内的培养物。
[0023] 进一步优选地，所述猪伪狂犬病病毒抗原为所述猪伪狂犬病病毒HN1202株或其 培养物的灭活全病毒抗原或gD重组蛋白抗原。
[0024] 本发明的疫苗组合物可以包含所述猪伪狂犬病病毒或其抗原作为活性成分。用于 疫苗的组合物的猪伪狂犬病病毒具有SEQIDNO. 1的氨基酸序列或与其共有98%以上同源 性的氨基酸序列表示的gD糖蛋白。
[0025] 用于本发明的抗原是指病毒组分的抗原部分，它引起免疫应答，并可包含具有SEQ ID NO. 1的氨基酸序列。
[0026] 优选地，所述猪伪狂犬病病毒或其培养物含量为彡106_°TCID5(l/ml。
[0027] 优选地，所述疫苗组合物包括> 106_°TCID5(l/ml的猪伪狂犬病病毒株HN1202株或 其培养物灭活疫苗。
[0028] 优选地，本发明的疫苗组合物可包含每头份106_°TCID5(I量的猪伪狂犬病病毒。当 猪伪狂犬病病毒以少于l〇6_°TCID5(l的量使用时，疫苗不能有效刺激抗体产生。另一方面，超 过的量可能是不经济的。
[0029] 此外，本发明的猪伪狂犬疫苗可与其他失活病原体或抗原组合使用以制备抵抗包 括猪伪狂犬病的各种疾病的联合疫苗或复合疫苗。本发明所用的术语"联合疫苗"指利用 本发明的猪伪狂犬病病毒与至少一种不同病毒的病毒混合物制备的疫苗。术语"复合疫苗" 指的是从病毒和细菌制备的疫苗。例如，本发明的猪伪狂犬病毒可与猪瘟病毒、猪繁殖与呼 吸综合征病毒、猪圆环病毒和/或副猪嗜血杆菌、支原体混合或组合。
[0030] 优选地，所述疫苗组合物进一步包括介质、佐剂、赋形剂。
[0031] 本发明的疫苗组合物还可包含介质、佐剂和/或赋形剂。生理盐水或蒸馏水可用 作介质。用于疫苗组合物的佐剂的例子包括弗氏的不完全佐剂或完全佐剂、氢氧化铝凝胶、 植物油或矿物油等。赋形剂的例子包括磷酸铝、氢氧化铝和硫酸铝钾，但不限于此。在实践 中，本领域技术人员已知的用于疫苗制备的所有物质均可适用于本发明的疫苗组合物。
[0032] 本发明的又一目的在于提供一种制备所述疫苗组合物的方法，所述方法包括： (1)培养增殖所述猪伪狂犬病病毒；（2)灭活所述增殖的猪伪狂犬病病毒；（3)加入佐剂，乳 化。
[0033] 具体地，所述方法为：（1)将猪伪狂犬病病毒疫苗株接种于易感细胞，并培养所述 接种后的易感细胞；收获细胞培养物；
[0034] (2)用甲醛溶液、BPL(@-丙内酯）或BEI(二乙烯亚胺）处理来自步骤（1)的病 毒；
[0035] 所述易感细胞可以是传代细胞系，也可以是原代细胞。适合于猪伪狂犬病病毒的 易感细胞包括但不限于，ST细胞系（ATCC编号：CRL-1746)、PK-15细胞系（ATCC编号： CCL-33)、非洲绿猴肾细胞Marc-145细胞系（ATCC编号：CRL-12219)、牛肾细胞MDBK细胞系 (ATCC编号：CCL-22)、牛睾丸传代细胞BT细胞系（ATCC编号：CRL-1390)、Vero细胞系（ATCC 编号：CCL-81)、BHK-21细胞系（ATCC编号：CCL-10)、猪肾传代细胞系（如：IBRS-2,见例 如，DECASTRO,M.P.1964.Behavioroffootandmouthdiseasevirusincellculture： susceptibilityoftheIB-RS_2swinecellline.ArquivosInstitutoBiologica31 ： 63-78)、兔肾传代细胞系（RK，如：ATCC编号：CCL-106)等传代细胞系，或者鸡胚成纤维细胞 和猪肾细胞等原代细胞。原代细胞可以通过本领域公知的方法，用动物体内的组织进行分 离和制备。
[0036] 本发明的提供了一种制备所述疫苗组合物的方法，所述方法包括：（1)表达所述 猪伪狂犬病病毒gD抗原；（2)加入佐剂，乳化。
[0037] 可将根据本发明的疫苗组合物制备成口服剂型或非口服剂型。优选的是可通过皮 内、肌肉、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内或硬脑膜外途径给予的非口服剂型。
[0038] 本发明的还一目的在于提供所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗伪狂犬病 病毒相关疾病的药物中的应用。
[0039] 本文所用的术语"猪伪狂犬病病毒相关疾病"用于指由猪伪狂犬病病毒感染引起 的疾病。它的例子包括发病仔猪表现出明显的神经症状、昏睡、呜叫、呕吐、拉稀、体温升高， 一旦发病，怀孕母猪可发生流产、产木乃伊胎儿或死胎或繁殖障碍，但不限于此。
[0040] 本文所用的术语"预防"指通过给予根据本发明的疫苗组合物抑制猪伪狂犬感染 或推迟疾病发作的所有行为。术语"治疗"指通过给予根据本发明的疫苗组合物使猪伪狂 犬病病毒感染引起的症状减轻或转好的所有行为。
【专利附图】
【附图说明】
[0041] 图1为HN1202株gD抗原氨基酸序列与猪伪狂犬病毒BarthaK-61株gD抗原氨 基酸序列同源分析结果。
[0042] 序列表中：
[0043] 序列1为猪伪狂犬病病毒HN1202株gD蛋白氨基酸序列；
[0044] 序列2为猪伪狂犬病病毒HN1202株gD基因核苷酸序列。
【具体实施方式】
[0045] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更 为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0046] 本发明中的术语"头份"是指每头猪注射的疫苗量。
[0047] 本发明中所述的 "TCID5(I"（50%tissuecultureinfectivedose)是指半数细胞 培养物感染量，是表不病毒感染力的一种表不方式。
[0048] MEM液体培养基(液)用购自美国LifeTechnologies公司的MEM干粉培养基按照 其说明书配制。
[0049] 本发明的DMEM培养基参照GB/T18641-2002附录A配制方法配制。
[0050] 本发明中所述的"PBS"是指磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferSaline)的英文缩 写，本发明中使用的是0.OlmM的PH7. 4的PBS，按《分子克隆》第三版所述配制。
[0051] 实施例1、病毒的采集分离
[0052] 从来自河南的疑似猪伪狂犬感染的样本中分离样本无菌采集猪脑组织，以1 : 10 (体积比)加入MEM培养液，研磨，制备组织悬液，经反复3次冻融后，2000r/min离心15min， 收集上清液，再经〇.211111滤膜滤器过滤，在？1(-15细胞上接种371：培养111，换加含2%犊 牛血清的MEM培养液，37°C培养5日。收获含毒培养液，经2次冻融后，收毒，换加含2%犊 牛血清的MEM培养液。采用猪伪狂犬病病毒PCR检测试剂盒（北京世纪元亨动物防疫技 术有限公司）检测猪伪狂犬病病毒，结果为阳性；对分离的病毒利用利用PCR试剂盒进行外 源病毒的检测（猪蓝耳病病毒RT-PCR检测试剂盒、猪细小病毒PCR检测试剂盒猪瘟病毒 RT-PCR检测试剂盒均为北京世纪元亨动物防疫技术有限公产品)，PCR检测结果均为阴性， 表明毒种纯净。
[0053] 将分离到的伪狂犬病毒提交保藏，所述猪伪狂犬病病毒株为HN1202株 (Pseudorabiesvirus，strainHN1201)，保藏号为CCTCCNO.V201335;保藏于中国典型培 养物保藏中心；保藏地址为湖北省武汉?武汉大学，保藏日期为2013年8月26日。
[0054] 实施例2、分离病毒的遗传特性
[0055] 通过基因分析来确定实施例1中分离的病毒的遗传特性。利用在PK15细胞上分 离的猪伪狂犬病病毒基因组DNA做模板，使用表1所示的引物进行PCR。分别使用Primer Premier5. 0来设计用于扩增gD基因的引物序列。
[0056] 以提取的基因组DNA为模板，制备PCR扩增体系如下：模板DNAlOOiig，PrimerSTAR HSDNAPolymerase(2.5U/iil)0.5iil，2XPrimerSTARGCBuffer25iil，上下游引物各 1111(1(^111〇1/111)，(11'0131^(2.5111163(311)4111，并用蒸馈水将体积补足5〇111。进行两 步PCR反应：在98°C变性10sec，然后在68°C退火和延伸lminl5sec，共30个循环。在4°C 终止PCR反应。通过在含有溴化乙锭的1%的琼脂糖凝胶上进行电泳分析所得的PCR产物。 PCR产物进行序列测定。用Lasergene软件分析所得到的序列数据。
[0057] 表1PCR引物序列
【权利要求】
1. 一种猪伪狂犬病病毒株，所述猪伪狂犬病病毒株基因组包含编码SEQ. NO. 1的gD蛋 白的基因。
2. -种猪伪狂犬病病毒株HN1202,所述猪伪狂犬病病毒株保藏号为V201335,保藏于 中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉?武汉大学，保藏日期为2013年8月26日。
3. -种DNA序列，所述DNA序列实质上编码SEQ. NO. 1的gD蛋白。
4. 一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括免疫量的权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒 抗原和兽医学上接受的佐剂。
5. 根据权利要求4所述的疫苗组合物，其中，所述猪伪狂犬病病毒抗原为所述猪伪狂 犬病病毒或其培养物的减毒全病毒抗原、灭活全病毒抗原、亚单位抗原、合成肽抗原或基因 工程抗原。
6. 根据权利要求5所述的疫苗组合物，其中，所述猪伪狂犬病病毒抗原为所述猪伪狂 犬病病毒HN1202株或其培养物的减毒全病毒抗原、灭活全病毒抗原、亚单位抗原、合成肽 抗原或基因工程抗原；优选地，所述培养物为培养5-35代以内的培养物。
7. 根据权利要求6所述的疫苗组合物，其中，所述猪伪狂犬病病毒抗原为所述猪伪狂 犬病病毒HN1202株或其培养物的灭活全病毒抗原或gD重组蛋白抗原。
8. 根据权利要求4所述的疫苗组合物，其中，所述猪伪狂犬病病毒或其培养物含量为 彡 106°TCID5(l/ml。
9. 一种制备所述疫苗组合物的方法，所述方法包括： (1) 培养增殖所述猪伪狂犬病病毒； (2) 灭活所述增殖的猪伪狂犬病病毒； (3) 加入佐剂，乳化。
10. 根据权利要求4?8所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗伪狂犬病病毒相关疾 病的药物中的应用。
【文档编号】C12N7/00GK104328090SQ201310433485
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2013年9月22日 优先权日:2013年9月22日
【发明者】张许科, 孙进忠, 田克恭 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司