猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的可视化基因芯片以及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的可视化基因 芯片以及检测方法。
【背景技术】
[0002] 随着我国养猪业向集约化和规模化方向发展，规模化猪场疫病多发、多种病原 混合感染较普遍存在，给养猪业造成了一定损失。其中猪伪狂犬病毒（PRV)、猪细小病毒 (PPV)和猪圆环病毒2型（PCV2)是引起猪繁殖障碍的三种重要疫病病原。这三种病临诊症 状相似，需要进行鉴别诊断。
[0003] 目前，对这三种疾病的诊断多采用分离鉴定及常规的血清学方法，所需时间较长， 也有PCR技术的鉴别方法，但还没有建立操作性强且能同时鉴别三种病毒的方法。因此，有 必要建立能同时进行三种疫病快速检测的方法。
【发明内容】
[0004] 为了解决上述问题，本发明提供了一种特异性强、灵敏度高、可同时检测猪伪狂犬 病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的可视化基因芯片和试剂盒。
[0005] 基因芯片，是指指通过不同方法将生物分子（寡核苷酸、cDNA、genomic DNA、多肽、 抗体、抗原等）固着于硅片、玻璃片（珠）、塑料片（珠）、凝胶、尼龙膜等固相递质上形成的 生物分子点阵，其突出的特点是微型化、集成化、平行化和高通量。
[0006] 本发明检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的可视化基因芯片，它 包括固相载体以及固定在固相载体上的探针；所述探针包括SEQ ID NO :1、3、4所示基因片 段，用于分别检测伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型。
[0007] 它还包括SEQ ID NO :2所示所示探针，用于检测伪狂犬病毒野毒株。
[0008] 它还包括质控探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO :5和/或SEQ ID NO :6所示。
[0009] 一种检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的试剂盒，它包括前述的 基因芯片以及扩增试剂；其中，扩增试剂包括SEQ ID NO :7~8、SEQ ID NO :11~12、SEQ ID NO :13~14所示引物对，用于分别扩增伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的基 因。
[0010] 它还包括SEQ ID NO :9~10所示引物对，用于扩增伪狂犬病毒野毒株的基因。
[0011] 所述SEQ ID NO :7、9、11和13所示上游引物标记有生物素。
[0012] 本发明还提供了 SEQ ID NO :7 ~8、SEQ ID NO :9 ~10、SEQ ID NO :11 ~12、SEQ ID NO :13~14所示引物对以及SEQ ID NO :1~4所示基因片段。
[0013] 本发明还提供了 SEQ ID NO :1、3、4所示基因片段在制备检测猪伪狂犬病毒、猪细 小病毒和猪圆环病毒2型的基因芯片的用途。
[0014] 其中，所述基因芯片还包括SEQ ID NO :2所示所示探针，用于检测伪狂犬病毒野毒 株。
[0015] 本发明还提供了 SEQ ID NO :7 ~8、SEQ ID NO :9 ~10、SEQ ID NO :11 ~12、SEQ ID NO :13~14所示引物对以及SEQ ID NO :1~4所示基因片段在制备检测猪伪狂犬病毒、 猪细小病毒和猪圆环病毒2型中的用途；其中，四对引物对为扩增试剂，SEQ ID NO :1~4 所示基因片段为检测探针。
[0016] 本发明基因芯片和试剂盒可以有效检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒 2型病原，还能区分猪伪狂犬病毒的疫苗株与野毒株感染，具有特异性好、灵敏性高和保存 期长等特点，耗时短，检测快速，检测结果的观察直观，无需昂贵的设备，可以迅速掌握畜禽 疫病的感染情况，临床应用前景良好。
[0017] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要 求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0018] 图1 :阵列排布示意图
[0019] 图2:点阵设置图示
[0020] 图3 :样品设置图示
[0021] 图4 :芯片预杂交的组装图示
[0022] 图5 :芯片特异性检测结果A:PRV检测结果；B:PPV检测结果；C:PCV2检测结果； D:PRV+PPV检测结果；E:PRV+PPV检测结果；F:PRV+PCV2检测结果
[0023] 图6 :gB探针基因不同稀释度芯片灵敏性检测结果
[0024] 图7 :gE探针基因芯片灵敏性检测结果
[0025] 图8 :NS1探针基因芯片灵敏性检测结果
[0026] 图9 :0RF2探针基因芯片灵敏性检测结果
[0027] 图10 :稳定性检测结果
【具体实施方式】
[0028] 实施例1本发明检测方法
[0029] 一、探针基因的设计以及包含探针的质粒菌的构建
[0030] 1 材料
[0031] Ll 种毒
[0032] PRV Fa株，由卫生部成都生物制品研宄所惠赠；
[0033] PCV2由本实验室赵春容从四川资阳病料中分离；
[0034] 猪细小病毒灭活疫苗购自北京中海科技动物保健科技公司。
[0035] 1. 2探针基因重组质粒菌
[0036] T/GAPDH由英骏生物公司合成。
[0037] 1. 3主要实验仪器
[0038] 电子天平：Sartorius BP 310S ;
[0039] 超纯水仪：Milli Qplus，法国产；
[0040] 超净工作台：SW-CJ-2FD，苏州安泰空气技术有限公司；
[0041] 恒温摇床：真空机：SinBo,香港；
[0042] 恒温水浴锅；Thermo Savant冷冻干燥仪；
[0043] 核酸蛋白检测仪：Bio-RAD，SmartSpaee TM 3010 ;
[0044] 高速冷冻离心机3K18型：Sigma&，德国产；
[0045] Mini-SUB凝胶电泳装置，电泳仪：POWER Pac300,凝胶电泳图像分析系统2000型： Bio-RADR〇，意大利产；
[0046] 梯度 PCR 仪：PX 2, Thermo hybaid ;分子杂交仪：Thermo,美国产；
[0047] 晶芯? SmartArrayer?48 (微阵列芯片点样系统），晶芯? LuxScan?10K微阵列芯 片扫描仪：
[0048] Capitalbio Corporation，北京博奥生物有限公司；
[0049] 高纯氮气瓶：四川冠峰气体有限公司生产。
[0050] 1. 4主要试剂
[0051] Plasmid miniprep Kit，Gel Extractraction Kit，均购自 Omega (美国）生物技 术有限公司；
[0052] 血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒、50bp DNA LadderUOObp DNA Ladder、 2XTaq PCR MasterMix、DH5a感受态细胞-化学转化，Amp均购自北京天根生化科技有限公 司；
[0053] PUC18Cloning Vector，pMD19-T Simple克隆试剂盒，均购自宝生物（大连）科技 有限公司；
[0054] LB 液体培养基（含 100mg/ml Amp) ;LB 平板（含 100mg/ml Amp)等。
[0055] Western Blot膜封闭液，购自天根生物科技有限生司；
[0056] Streptavidin-HRP，DAB Kit (Brown)购自英駿生物科技有限公司；
[0057] Baio ?点样缓冲液，购自上海百傲生物工程有限公司；
[0058] 预杂交缓冲液：甲酰胺 50ml、20XSSC 25ml、100Xdenhartd' s 5ml、脱脂奶粉 5g、 0· 2M Na3PO4IOml,超纯水定容至 100ml ;
[0059] 杂交缓冲液，甲酰胺45ml、20XSSC 25ml、100Xdenhartd's 1ml、脱脂奶粉2g、20m M Na3PO4 (pH 6· 5) 10ml，超纯水定容至 100ml ;
[0060] 尼龙膜，购自GE Healthcare ;硝酸纤维素膜，购自Millipore.
[0061] 0· 2M PBS 缓冲液：NaCl 8g、KCl 0· 2g、Na2HPO4L 42g、KH2PO4O. 27g，定容至 IL ;
[0062] 洗液 I :1XSSC 0· 1% SDS ;洗液 II :0· 2XSSC 0· 1% SDS ;洗液III :0· 2XSSC ;超 纯水。
[0063] 2实验方法
[0064] 2. 1探针设计
[0065] 2. I. IPRV
[0066] PRV-gB 基因 （SEQ ID NO :1):
[0067] TCGCCGTGCTCTTCAAGGAGAACGTCGCCCCGCACAAGTTCAAGGCCCACATCTACTACAAGAACGT CATCGTCACGACCGTGTGGTCCGGGAGCACGTACGCGGCCATCACGAACCGCTTCACGGACCGCGTGCCCGCCCC CGTGCAGGAGATCACGGACGTGATCGACCGCCGCGGCAAGTGCGTCTCCAAGGCCGAGTACGTGCGCAACAACCA CAAGGTGACCGCCTTCGACCGCGACGAGAACCCCGTCGAGGTGGACCTGCGCCCCTCGCGCCTGAACGCGCTCGG CACCCGCGGCTGGCACACCACCAACGACACCT
[0068] 可用于检测所有PRV毒株的检测。
[0069] PRV-gE 基因 （SEQ ID NO :2):
[0070] CTGGCTCTGCGTGCTGTGCTCCCGGCGCCGGGCGGCCTCGCGGCCGTTCCGGGTGCCGACGCGGGCG CGGACGCACATGCTCTCTCCGGTGTACACCAGCCTGCCCACGCACGAGGACTACTACGACGACGACGACGACGAC GACGAC
[0071] 可用于检测所有PRV疫苗株的检测。
[0072] PRV野毒株含有gB基因与gE基因，而PRV疫苗株只含有gB基因，gB基因可用于 PRV毒株的检测，两种基因同时应用可判定是否为野毒株或疫苗株感染。
[0073] 2.1.2PPV 探针
[0074] PPV-NSl 基因 （SEQ ID NO :3):
[0075] TTCATGGGCCAGCATCAACAGGAAAAAGTATAATTGCTCAACACATTGCAAACTTAGTTGGTAATGTTG GTTGCTACAATGCAGCCAATGTGAACTTTCC
[0076] 2. I. 3PCV2 探针
[0077] PCV2-0RF2 基因 （SEQ ID NO :4):
[0078] GGAGTGGTAGGAGAAGGGTTGGGTTATGGTATGGCGGGAGGAGTAGTTTACATAGGGGTCATAGGTTAG GGCATTGGCCTTTGTTACAAAGTTATCATCTAGAATAACAGCAGTGGAGCC