CA
[0079] 2. 1. 4 质控 I :PUC18 基因 （SEQ ID NO :5):
[0080] GCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTG TCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCC AGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCC
[0081] 2. L 5 质控 2 :GAPDH 基因 （SEQ ID NO :6):
[0082] CCCCTTCATCACCACGGACTACATGACCTACATGTTCAAGTACGACACCGTCCACGGCCACTGGAAGCA CAGCGACATCACACTCAAGGACTCCAAGACCCTTCTCTTCGGTGACAAGCCGGTCACCGTCTTTGGCATCAGGAACC CTGAGGAAATCCCGTGGGGTGAGGCTGGCGCTGAGTATGTCGTGGAGTCCACCGGCGTCTTCACTGACAAGGACAAG GCTGCTGCACATCTCAAGGGTGGTGCCAAGAAGG
[0083] 2. 1. 6重组质粒及其重组菌的制备
[0084] 2. L 6. 1探针基因的连接
[0085] 采用pMD19_T Simple克隆试剂盒，进行探针基因的连接重组，具体步骤按说明进 行。连接体系如下：
[0086] pMDI9-T Simple 我休 1.0 ul 胶回收PCR产物 2.0 ul Solution 1 5.0 ul 去离子水 2.0 ul Total 10.0 ul
[0087] 4°C连接过夜，连接产物用于转化DH5a感受态细胞。
[0088] 2. 1. 6. 2探针基因的转化
[0089] 取9ul连接产物，向其中加入Iul Solution III (可增强转化效率），混匀。将连接 产物加入50ul感受细胞中，混匀，冰浴30min ;42°C水浴热休克90s，快速冰浴冷却5min ;立 即加入600ul 37°C预热的LB液体培养基（不含Amp)，37°C，180r/min振荡培养lh，使受体 菌恢复正常生长状态；4000r/min离心5min，弃上清510ul，重悬菌液后取150ul培养物均 勾涂布于LB平板（含100mg/ml Amp)，瞭干，于37°C培养箱中培养约12h。
[0090] 即得 T/PRV-gB、T/PRV-gE、T/NSl 和 T/ORF22 个检测探针以及 T/PUC18 和 T/GAPDH 2个定位探针基因重组质粒菌。
[0091] 2. 2可视芯片的制备
[0092] 2. 2. 1阵列的设计排布
[0093] 每张芯片分为2个重复阵列，每个阵列为7排不同的探针基因，每排探针基因重复 喷样4次。每个阵列探针基因排布为：第一排为PRV-gB基因，第二排为PRV-gE基因，第三排 为PPV-NSl基因，第四排为PCV2-0RF2基因，第五排为空白对照（超纯水），第六排为PUC18 基因，第七排为GAPDH基因。阵列排布示意图如图1。
[0094] 2. 2. 2 喷样
[0095] 本试验采用北京博奥生物有限公司的晶芯? SmartArrayer 48系统喷样。在喷样 前，先将384孔板与粘在基片上的硝酸纤维素膜安装到点样仪的指定区域，然后对点样仪 的各项位置参数进行标定，并按2. 2. 1的阵列排布设置点阵。针阵点矩为3000 μ m，阵间间 隔为7mm.点阵及样品参数设置如图2和图3.
[0096] 将纯化好的探针基因浓度调整到200ng/ul，加入等体积的点样缓冲液后混匀。混 合液在PCR仪中95°C变性IOmin后，立即冰浴冷却5min，将探针基因轻轻加至384孔板相 应的孔中。以上均设置完成后，打开氮气瓶，调整压力为0.4~0.5M Pa，即可开始喷样。
[0097] 2. 2. 3探针基因固定、密封与保存
[0098] 喷样完成后将硝酸纤维素膜置于80°C的烘箱中烘焙2h，真空机抽干密封、4°C冰 箱保存。
[0099] 2. 3靶基因的PCR扩增标记
[0100] 分别提取PRV、PPV和PCV2DNA，与对应的引物进行PCR扩增标记。
[0101] 2. 3. IDNA提取方法如下：基因组DNA抽提采用天根血液/细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒，具体操作步骤如下：
[0102] (1)处理病料：取疑似患猪圆环病、猪伪狂犬病、猪细小病毒病的肝、肺脏（纤维素 性渗出及出血处）、脾（梗死、出血处）、淋巴结（肿大、出血处）25~50mg剪碎、研磨；
[0103] (2)加入20ul 20mg/ml的Protease K溶液，吹打混匀，56°C水浴锅放置lh，顺离 30s后进行下一步骤；
[0104] (3)加200ul缓冲液GB，上下颠倒混勾，在70°C水浴锅中放置IOmin后，溶液应变 的清亮，顺离30s ;
[0105] (4)加200ul无水乙醇，上下颠倒混匀，此时溶液中可能会出现絮状的沉淀物，顺 离 30s ;
[0106] (5)将上一步所得液体都加入一个带有收集管的吸附柱CB3中，12, OOOrpm离心 30s，倒废液，将吸附柱重新放入收集管中；
[0107] (6)向吸附柱中加入500ul去蛋白液⑶，12, OOOrpm顺离30s，倒废液，再将吸附柱 重新放入收集管中；
[0108] (7)向吸附柱中加入700ul漂洗液PW，12, OOOrpm顺离30s，倒废液，将吸附柱重新 放入收集管中；
[0109] (8)向吸附柱中加入500ul漂洗液PW，12, OOOrpm顺离30s，倒废液；
[0110] (9)将吸附柱放入废液收集管中，12, OOOrpm离心2min.室温开盖放置数分钟；
[0111] (10)将吸附柱转入一个新的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空加入IOOul经预 热过的TE缓冲液，室温放置3min后，12, OOOrpm离心30s ;
[0112] (11)再次将离心得到的溶液加入吸附柱中，室温放置3min，12, OOOrpm离心3min。
[0113] 2. 3. 2引物如下
[0114] 2. 3. 2. IPRV
[0115] PRV-gB 基因的扩增引物（SEQ ID NO :7 ~8):
[0116] F:TCGCCGTGCTCTTCAAGG
[0117] R：AGGTGTCGTTGGTGGTGTG
[0118] PRV-gE 基因的扩增引物（SEQ ID NO :9 ~10):
[0119] F:CTGGCTCTGCGTGCTGTG
[0120] R:GTCGTCGTCGTCGTCGTC
[0121] 2. 3. 2. 2PPV(SEQ ID NO :11 ~12)
[0122] F:TTCATGGGCCAGCATCAA
[0123] R:TGAAAGTTCACATTGGCTGC
[0124] 2. 3. 2. 3PCV2(SEQ ID NO :13 ~14)
[0125] F：GGGAGTGGTAGGAGAAGGGT
[0126] R:TGGGCTCCACTGCTGTTATT
[0127] 2. 3. 2. 4 质控 1(SEQ ID NO :15 ~16)
[0128] F：GGGAGTGGTAGGAGAAGGGT
[0129] R:TGGGCTCCACTGCTGTTATT
[0130] 2. 3. 2. 5 质控 2 (SEQ ID NO :17 ~18)
[0131] F：CCCCTTCATCACCACGGACTA
[0132] R:CCTTCTTGGCACCACCCT
[0133] 2. 3. 3PCR反应体系如下：
[0134]
【主权项】
1. 一种检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的基因芯片，其特征在于：它 包括固相载体以及固定在固相载体上的探针；所述探针包括SEQ ID NO :1、3、4所示基因片 段，用于分别检测伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型。
2. 根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于：它还包括SEQ ID NO :2所示所示探 针，用于检测伪狂犬病毒野毒株。
3. 根据权利要求2所述的基因芯片，其特征在于：它还包括质控探针，其核苷酸序列如 SEQ ID NO :5 和 / 或 SEQ ID NO :6 所示。
4. 一种检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的试剂盒，其特征在于：它包 括权利要求1~3任意一项所述的基因芯片以及扩增试剂；其中，扩增试剂包括SEQ ID NO: 7~8、SEQ ID N0:11~12、SEQ ID N0:13~14所示引物对，用于分别扩增伪狂犬病毒、猪 细小病毒和猪圆环病毒2型的基因。
5. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：它还包括SEQ ID NO :9~10所示引物 对，用于扩增伪狂犬病毒野毒株的基因。
6. 根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于：所述SEQ ID NO :7、9、11和13所 示上游引物标记有生物素。 7. SEQ ID NO :7 ~8、SEQ ID NO :9 ~KKSEQ ID NO :11 ~12、SEQ ID NO :13 ~14 所 示引物对以及SEQ ID NO :1~4所示基因片段。 8. SEQ ID NO :1、3、4所示基因片段在制备检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病 毒2型的基因芯片的用途。
9. 根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述基因芯片还包括SEQ ID NO :2所示 所示探针，用于检测伪狂犬病毒野毒株。 10. SEQ ID NO :7 ~8、SEQ ID NO :9 ~10、SEQ ID NO : 11 ~12、SEQ ID NO : 13 ~14 所示引物对以及SEQ ID NO :1~4所示基因片段在制备检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和 猪圆环病毒2型中的用途；其中，四对引物对为扩增试剂，SEQ ID NO :1~4所示基因片段 为检测探针。
【专利摘要】本发明公开了一种检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的基因芯片，它包括固相载体以及固定在固相载体上的探针；所述探针包括SEQ ID NO：1、3、4所示基因片段，用于分别检测伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型。本发明公开了一种检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的试剂盒。本发明基因芯片和试剂盒可以有效检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型病原，还能区分猪伪狂犬病毒的疫苗株与野毒株感染，具有特异性好、灵敏性高和保存期长等特点，耗时短，检测快速，检测结果的观察直观，无需昂贵的设备，可以迅速掌握畜禽疫病的感染情况，临床应用前景良好。
【IPC分类】C12Q1-68, C12R1-93, C12Q1-70, C12N15-11
【公开号】CN104862423
【申请号】CN201510313562
【发明人】文心田, 曹三杰, 常晓霞, 黄小波, 文翼平, 伍锐, 张仙, 马锐, 杨国淋
【申请人】四川农业大学
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年6月9日