一种用于检测水貂星状病毒的rt-pcr引物及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子生物学分子标记领域，具体地说设及一种用于检测水貂星状病毒 的RT-PCR引物及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 水貂星状病毒（Mink astrovirus，MiAstV)是引起水貂腹泻症状的致病原因之一， 特别是断奶前后的水貂和幼年水貂，星状病毒的发病率更为突出。但是，目前在我国，关于 水貂星状病毒的研究还比较少，水貂星状病毒的相关文献比较匿乏。2011年-2013年在我 国某些水貂养殖地区，在1月-2月龄幼貂中出现了一种中枢神经系统障碍疾病，经研究发 现，该病与瑞典、丹麦等国家发生的水貂震颤综合征（化anking mink syn化ome，SM巧症状 相似，主要症状为头部震颤、步态不稳、共济失调，后期发展为后肢麻搏，病貂因为头部震颤 过剧而无法进食，体溫升高，病程一般一周左右，该病的发病率为3%，死亡率为1 %。
[0003] 该水貂星状病毒的PCR检测技术，能够对水貂星状病毒做出准确的检测，该技术 具有省时、省力、减少成本减少产物污染等优点。该检测方法能够实现对水貂星状病毒快速 准确的检测，从而与引起水貂腹泻症状的冠状病毒和圆环病毒等病毒进行区分，为水貂疾 病的正确诊断打下良好的基础。
[0004] 水貂星状病毒的0RF化基因是高度保守序列，因此，针对MiAstV的0RF化基因的 保守区设计引物建立RT-PCR方法，能够提高RT-PCR检测方法的特异性和敏感性。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于提供一种用于检测水貂星状病毒的RT-PCR引物及其检测方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明技术方案如下：
[0007] 一种用于检测水貂星状病毒的RT-PCR引物，所述RT-PCR引物如下：
[0008]
[0009] 其中，所述RT-PCR引物是通过对比GenBank中登陆的水貂星状病毒0RF化基因的 核巧酸序列（序列号分别为GU985458. 1、NC_004579.UAY179509. 1)，选定基因的相对保守 区，利用Prime巧.0软件设计所得。
[0010] 为解决上述问题，本发明提供了一种用于检测水貂星状病毒的RT-PCR引物的检 测方法，包括如下步骤：
[0011] S1、将肠内容物样本加适量灭菌PBS稀释后，充分反复冻融3次，500化pm离屯、 15min，去上清，得病毒悬液，-70°C保存备用；
[001引采用TaKaRa公司的RNAisoPlus试剂提取样品中总RNA，主要步骤：
[0013]S2、取步骤S1所得的病毒悬液250ul至1.5mlEP管中，加入RNAisoPlus750ul， 颠倒混匀，室溫静止5min，裂解细胞后，加入200ul氯仿，剧烈震摇至溶液充分乳化，室溫静 止lOmin;
[0014]S3、将步骤S2所得溶液12000g4°C离屯、15min，吸取500ul上清液至另一新的 1. 5mlEP管中，加入500ul异丙醇，上下颠倒混匀，-20°C静置30min。
[0015]S4、将步骤S3所得溶液12000g4°C离屯、lOmin，弃去上清，加入1ml75%的乙醇， 颠倒混匀后，12000g4°C离屯、5min，弃去乙醇，室溫干燥沉淀2-5min，得RNA;
[0016]S5、将步骤S4所得的RNA加入20U1DEPC水，溶解RNA沉淀，待沉淀完全溶解后，通 过反转录成cDNA:在PCR管中加入RNA模板加l、10pmol/ulP1引物0.加l、10pmol/ulP2 引物 0.加l、5xM-MLVBuffer4ul、2. 5mMdNTPMixUire化1、M-MLVRT0.加1、RRI0.加1、 DEPC水7ul混合后瞬时离屯、，置42°C水浴比，70°C灭活lOmin，即得AstcDNA;
[0017]S6、W步骤S5所得的cDNA为模板，建立AstRT-PCR检测，PCR扩增体系：cDNA模 板化l、Mg2+pluslOxPCRBuffer2. 5ul、2. 5mMdNTPMix1:ure化I'rTaqDMpolymerase 0. 5ul、10pmol/ulPI引物 0. 5ul、10pmol/ulP2 引物 0.加1、灭菌d地2〇 17ul;
[001引PCR反应条件：95°C预变性5min，94°C变性30s，57°C退火45s，72°C延伸90s，35个 循环，72°C延伸lOmin;
[0019]S7、w步骤S6所得的PCR产物在1 %琼脂糖凝胶上电泳，在295bp处得到了清晰可 见的目的条带，表明检测到了水貂星状病毒。
[0020] 本发明具有W下有益效果：
[0021] 通过序列比对，分别选取了Ξ株水貂星状病毒的0RF化基因，根据其保守区设计 引物，运样既能保证鉴定病原的正确，又不会漏检不同株的病原；另外，本发明的扩增产物 长度适宜，同时引物二聚体和非特异性扩增产物很少。另外，通过反应体系和反应条件的优 化，得到了灵敏度高特异性强的检测方法。经最终试验证实，本发明的RT-PCR方法由于引 物设计和试验体系的选取，最低可检测到1. 35ng/ul的RNA模板量，且成本低廉，能够快速 实现对水貂星状病毒的特异性和敏感性检测。
【附图说明】
[0022] 图1为本发明实施例中不同水貂星状病毒毒株的0RF化序列比对结果；
[002引图2为本发明实施例中MiAstV上下游引物ΡΛ序列选择区；
[0024]图3为本发明实施例中MiAstV重复性试验，Μ泳道：DL500 DNA Marker。1-5泳 道：水貂星状病毒，6泳道：(1地2〇;
[002引图4为本发明实施例中MiAstV特异性试验，Μ泳道：DL500 DNA Marker，！泳道冰 貂星状病毒。2泳道：水貂犬攝热病毒，3泳道：水貂冠状病毒，4泳道：水貂细小病毒，5泳 道：d地20;
[0026]图5为本发明实施例中MiAstV敏感性试验，Μ泳道：DL500 DNA Marker, 1泳道：水貂星状病毒，2泳道：(1地2〇, 3-7泳道10 1-10 5倍稀释的RNA。
【具体实施方式】
[0027] 为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，W下结合实施例对本发明进行进一步 详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用W解释本发明，并不用于限定本发 明。
[002引 实施例
[0029] 本发明实施例中所采用的水貂星状病毒阳性病料；水貂细小病毒；水貂犬攝热病 毒；猪流行性腹泻病毒均由青岛农业大学预防兽医重点实验室保存。
[0030] 步骤1、引物的设计与合成：通过DNAStar软件中的MegLign比对GenBank中登录 的水貂星状病毒（MiAstV)的0RF化基因的核巧酸序列（图1)，选定基因的相对保守区。利 用Primee巧.0软件，W水貂星状病毒（NC_004579. 1)0RF化基因序列为参照，设计检测水貂 星状病毒的特异性引物（图2,表1)。引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成，用DEPC 水稀释到lOpmol/ul，-20摄氏度保存备用。
[00引]表1引物序列
[0032]
[0033]注：在Minkastrovirus株（NC_004579. 1)全基因组中的位置
[0034] 步骤二：采用TaKaRa公司的RNAisoPlus试剂提取样品中总RNA:
[0035]S21、将肠内容物样本加适量灭菌PBS稀释后，充分反复冻融3次，500化pm离屯、 1