一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗-犬瘟热活疫苗组合的制作方法

一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗-犬瘟热活疫苗组合的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗-犬瘟热活疫苗组合。本发明组合为使用烷化剂作为病毒灭活剂的水貂病毒性肠炎灭活疫苗兼作组合中犬瘟热活疫苗的稀释液；组合中两种疫苗具有特定的配比关系。该疫苗组合相比两种疫苗传统的应用方法达到一针两防(预防水貂病毒性肠炎和犬瘟热)，降低了疫苗成本、减少了动物应激反应、提高了免疫效果、减轻了饲养者的劳动强度从而取得显著的经济效益。
【专利说明】一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗-犬瘟热活疫苗组合

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗及犬瘟热活疫苗组合。属于兽用生物制 品领域。

【背景技术】
[0002] 水紹病毒性肠炎是由水紹肠炎病毒（Mink Enteritis Virus, MEV)引起的一种急 性、烈性和高度接触性传染病，主要以剧烈腹泻为主要特征，1949年由加拿大学者Sehofield 首次发现本病（Schofield F W. Virus enteritis in mink. Am Vet, 1949, 30:6512654·)。 1981年姜廷秀等（姜挺秀，朴厚坤，王喜龙等.疑似水貂病毒性肠炎初报.毛皮动物饲养， 1981，（2):224.)首先报道了我国发生水貂病毒性肠炎，此后该病逐渐蔓延全国，给我国养 貂业带来巨大的经济损失（高云，宋纯林，吴玉林等水貂病毒性肠炎（MEV)流行病学调查及 防治.特产科学实验，1984,（4) 33234.)。
[0003] 犬癌热是由犬癌热病毒（Canine distemper virus, (DV)引起的犬科、融科和熊 科动物的一种高度接触性传染病，病死率30 %?80 %。犬瘟热病毒为副粘病毒科麻疹病毒 属，呈圆形或不整形。直径100?300nm，含有直径为15?17nm的螺旋状核衣壳，外覆一 层双轮膜，膜上长I. 3nm的纤突。发病率高，几乎可以达到100%，且临床症状多样，容易继 发其他细菌、病毒的混合感染和二次感染，死亡率高，素有"毁灭性传染病"之称，对养犬业、 毛皮动物养殖业造成巨大损失。自1809年Jeneer首次报道犬瘟热，1905年Carre通过动 物接种分离的滤过性致病因子复制出病例以来，各国学者已经对犬瘟热病毒的分离培养、 理化特性、流行病学以及免疫与防制作了大量的研究。近年来，其感染范围不断扩大，危害 也越来越大，甚至已经有人感染犬瘟热病毒的病例。Mee等也从患Pagets疾病的病人组织 中检测出犬瘟热病毒核酸，这使得犬瘟热有可能成为继狂犬病之后犬传播给人的第二种疫 病。在我国，随着近几年来军犬、警犬、实验用犬和宠物犬饲养量的大幅度增加，以及异地交 流的不断增多，犬瘟热在我国犬中的发病率和致死率也均有升高的趋势，而且临床症状也 与以往的表现有所不同。
[0004] 水貂病毒性肠炎与犬瘟热是毛皮动物养殖中发病率最高的两种疾病，均需要免疫 预防，目前这两种疾病均有单独疫苗可以使用。但是由于毛皮动物养殖中，每次免疫均会对 动物造成较大的应激，因而寻找一种将两种疫苗联合使用的方法极为重要。由于传统的水 貂病毒性肠炎灭活疫苗使用的是甲醛溶液灭活剂，如果与犬瘟热活疫苗共同使用则会造成 犬瘟热抗原的失效，无法实现联合使用。
[0005] 烧化剂属于细胞毒类药物，又称生物烧化剂（Bioalkylating Agengts)，在体内能 形成碳正离子或其他具有活泼的亲电性基团的化合物，进而与细胞中的生物大分子中含有 丰富电子的基团发生共价结合，使其丧失活性或使DNA分子发生断裂，导致细胞死亡。其中 二乙烯亚胺（BEI)可以破坏病毒核酸，不改变病毒蛋白质，而且不同病毒对BEI的抵抗力不 尽相同，同时BEI对核酸具有较高的诱变作用。本发明使用BEI溶液作为水貂病毒性肠炎 灭活疫苗生产过程中的灭活剂，使得水貂病毒性肠炎灭活疫苗满足了作为犬瘟热活疫苗稀 释液进行使用的可能，并通过各种创造性试验，实现了水貂病毒性肠炎灭活疫苗与犬瘟热 活疫苗的联合应用。


【发明内容】

[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗-犬瘟热活疫苗 组合，将水紹病毒性肠炎灭活疫苗作为犬癌热活疫苗稀释液，达到降低疫苗成本、减少动物 应激、提高经济效益的目的。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明的技术方案在于：
[0008] 1. -种水貂病毒性肠炎灭活疫苗-犬瘟热活疫苗组合，是由水貂病毒性肠炎灭活 疫苗和犬瘟热活疫苗组成，其中水貂病毒性肠炎灭活疫苗兼作犬瘟热活疫苗的稀释剂。
[0009] 2. -种水貂病毒性肠炎灭活疫苗-犬瘟热活疫苗组合中水貂病毒性肠炎灭活疫 苗使用的灭活剂为烷化剂，优选灭活终浓度为〇. 05%?0. 3%的BEI溶液。
[0010] 3. -种水貂病毒性肠炎灭活疫苗-犬瘟热活疫苗组合中两种疫苗具有每3毫升 水貂病毒性肠炎灭活疫苗稀释1头份犬瘟热活疫苗的配比关系，其中水貂病毒性肠炎灭 活疫苗灭活前病毒含量为每晕升I. ox i〇7_°tcid5(i以上，犬癌热活疫苗每头份病毒含量为 104_ 5TCID5tl 以上。
[0011] 4. 一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗-犬瘟热活疫苗组合中水貂病毒性肠炎灭活疫 苗制备步骤包括：
[0012] (1)将F81细胞系或者CRFK细胞系进行传代和培养；
[0013] (2)将水貂病毒性肠炎病毒接种到长满80%的F81或者CRFK单层细胞的介质上， 用维持液培养，制备生产用种毒；
[0014] (3)通过微载体平衡、细胞接种及消化转移、细胞罐放大转移使细胞培养扩大至 1000L的细胞罐。当细胞密度达到I. 5X 106cells/ml时，接种水貂肠炎病毒MEV-RCl株，得 到水貂病毒性肠炎病毒抗原液；
[0015] (4)将水貂病毒性肠炎病毒抗原液分别加入BEI溶液灭活，混合均匀，加入水溶性 佐剂，优选灭菌的氢氧化铝胶配苗，即得。
[0016] 5.组合中水貂病毒性肠炎灭活疫苗制备中使用水貂病毒性肠炎病毒（Mink Enteritis Virus，MEV)为MEV-RCl株该毒株已于2012年04月12日送交北京市朝阳区北 辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心保藏，编号为：CGMCC No. 4331。

【具体实施方式】
[0017] 一、水貂病毒性肠炎灭活疫苗
[0018] 1.水貂病毒性肠炎灭活疫苗的生产制备
[0019] (1)生产用毒种制备
[0020] 取生长良好的F81细胞或者CRFK细胞按常规方法传代，待细胞长成80%单层后， 弃去生长液，换以含0. 5%?1% MEV-RCl株毒种的维持液（含2%在56°C下灭活30分钟 的新生牛血清的MEM) (MEM购自美国Gibco公司，新生牛血清购自济南劲牛生物科技有限公 司），置37°C继续培养，待80%左右的细胞出现典型拉网式病变时收获，冻融1次，定量分 装，冷冻保存，注明收获日期、毒种代次等。
[0021] (2)制苗用材料的选择
[0022] 选择生长良好、符合现行《中国兽药典》生产、检验用细胞标准的或者CRFK细胞做 为制苗用材料，细胞代次为F6?F35代。
[0023] (3)制苗用毒液的繁殖
[0024] 1)生物反应器清洗灭菌及微载体平衡
[0025] 将生物反应器清洗干净，121°C灭菌30分钟。灭菌结束后，将灭菌好的微载体打入 细胞培养罐中，将平衡培养基MEM打入罐中至最小培养体积，平衡20?24小时。平衡载体 期间完成溶氧电极100%点的校正。
[0026] 2)细胞接种及消化转移
[0027] 选择生长旺盛的转瓶细胞，用EDTA-胰蛋白酶分散液消化后，用含8%新生牛血 清的MEM和微载体（Cytodex I型微载体，购自GE公司）悬浮制成细胞悬液，接种30L细 胞培养罐，接种密度5. 0?6. OX 105cells/ml，连续培养2?3天，细胞罐培养过程中当 葡萄糖含量低于500mg/L，用含5 %新生牛血清的MEM培养基批次换液，当细胞密度达到 2. OX 106cells/ml以上后进行消化转移，即培养规模的放大。转移前，将在细胞培养罐内 连续培养2?3日的或者CRFK细胞取样观察并用0. 1 %结晶紫染色计数，细胞密度达到 2X106cells/ml时，按3?4倍放大到90L细胞罐。
[0028] 3)细胞罐放大转移
[0029] 按照上述步骤逐级放大，将90L细胞罐依次放大转移至350L、1000L细胞罐。
[0030] 4)接毒及收获
[0031] 1000L细胞罐培养2?3日，细胞密度达到1.5X106cells/ml时，接种水貂肠炎 病毒MEV-RCl株，接毒时采用含1 %新生牛血清的DMEM培养基，温度37°C，接毒量为MOI = 〇. 1。接毒后定时取样观察细胞，待微载体表面80%细胞病变突起且有少量脱落时，连续高 速搅拌10?15分钟，通过消化器滤除微载体收获病毒液，取样进行病毒含量测定后，收获 的病毒液标明名称、收获日期、批号，存放_15°C低温冷库，待检备用。
[0032] (4)病毒液灭活
[0033] 向病毒液中加入2%的BEI溶液，使其终浓度为0. 2%，37°C灭活48小时，期间每 隔4?8小时混匀1次；灭活完全后，向病毒液中添加50%的硫代硫酸钠溶液，使其终浓度 为0. 4%，加入后搅拌1小时。
[0034] (5)半成品检验
[0035] 1)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
[0036] 2)病毒含量每晕升病毒含量应不低于107_°TCID5(i。
[0037] 3)灭活检验将灭活病毒液和MEM按1 : 5的比例混合后接种已长成80 %单层的 或者CRFK单层细胞4瓶（每瓶细胞瓶底面积为5cmX 7cm)，每瓶接种lml，置37°C下吸附 30分钟后，换维持液（含2%在56°C下灭活30分钟的新生牛血清的MEM)，继续培养观察4 日，应无细胞病变；再盲传1代，仍应无细胞病变。取培养液作血凝试验，应为阴性。
[0038] (6)配苗将灭活病毒液和灭菌的氢氧化铝胶（附注3)按9 : 1的比例进行配苗， 使疫苗中氢氧化铝胶含量以氧化铝表示不超过3. 9mg/ml，充分搅拌。
[0039] (7)分装定量分装。分装时，应随时搅拌使其混合均匀。
[0040] 2.成品检验
[0041] (1)性状静置后，上层为粉红色液体，下层为淡粉红色沉淀，振摇后呈均匀混悬液。
[0042] (2)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
[0043] (3)装量检查按现行《中国兽药典》附录进行检验，应符合规定。
[0044] (4)安全检验用2?10月龄健康易感水貂（MEV HI抗体效价不高于1:4)5只，各 皮下注射疫苗3ml，连续观察10日，应全部健活。
[0045] (5)效力检验
[0046] 取2?10月龄健康易感水貂（MEV HI抗体效价不高于1:4)5只，各皮下注射疫苗 lml，同时设不接种对照水貂5只。免疫后14日，对所有水貂分别通过口服途径攻击水貂肠 炎病毒MEV-RCl株病毒液15ml (病毒含量为15 X 107_ tlTCID5tl)，观察10日。对照水貂应全部 发病（附注2)，免疫水貂应全部健活。
[0047] (6)汞类防腐剂残留量测定分别按现行《中国兽药典》附录进行测定，应符合兽用 生物制品通则的规定。
[0048] 二、犬瘟热活疫苗
[0049] 1、犬瘟热活疫苗的生产制备
[0050] (1)生产用种毒的制备
[0051] 犬瘟热病毒株⑶V-Il株接种转瓶上的Vero细胞单层，接毒量为维持液量的2%， 当细胞病变达80%时即可收获，再传1代，制备生产用种毒。
[0052] (2)病毒液的繁殖
[0053] 用生产用种毒,接种到转瓶上的Vero细胞单层,接毒量为细胞维持液的2%。然后 将转瓶细胞置37°C培养，转速为8?10r/h。
[0054] 接种后，每天观察细胞病变情况，当细胞病变达80%左右时即可收获，冻融1次， 置一 15°C冻结保存，此为半成品。
[0055] (3)冻干
[0056] 经过半成品合格检验合格后，用常规冻干保护剂（《中国兽药典》）与病毒液的体 积比按照1:1混合，分装成2ml/瓶，按照设计好的冻干曲线进行冻干，S卩：-65°C，维持2小 时使疫苗迅速冻结，然后抽真空，当真空度达13. 3Pa时，开始升温干燥，升华阶段产品温度 为一 20?一 KTC，搁板温度为8°C，升华时间为10个小时；解析温度为30°C，2个小时。
[0057] 2、犬癌热活疫苗的成品检验
[0058] (1)无菌检验应无菌生长。按《中国兽药典》中的规定进行检验。
[0059] (2)支原体检验按《中国兽药典》中的规定进行检验，应无支原体生长。
[0060] (3)鉴别检验将疫苗作KT2稀释，与等量KT1稀释的犬瘟热阳性血清混合，经37°C 中和30分钟，接种Vero细胞4瓶，同时设病毒对照组2瓶，置37°C培养，连续观察CPE 96? 120小时。
[0061] (4)外源病毒检验按《中国兽药典》中的规定进行检验，应无外源病毒。
[0062] (5)安全检验将每头份疫苗用Iml生理盐水溶化后，肌肉接种2?3月龄易感犬 (SN抗体效价彡1:4)5只，10头份/只，观察21日。
[0063] (6)效力检验用含2%新生牛血清的MEM将疫苗溶化，使每Iml疫苗含1头份，然 后作10倍递进稀释，取1〇_2、1〇_ 3、1〇_4、1〇_54个稀释度，分别接种已长成单层的Vero细胞96 孔微量细胞培养板，每个稀释度接种8个孔，每孔100 μ 1，同时设不接毒对照，置37°C、5% 二氧化碳培养箱中培养，观察96?120小时，记录细胞病变（CPE)孔数，按Reed-Muench法 计算 TCID5tl，应达到 104·5TCID5qij
[0064] (7)剩余水分测定每批冻干制品任抽4个样品，各样品剩余水分均不应超过4%。 如果有超过时，可重检1次，重检后如有1个样品超过规定，该批制品应判为不合格（《中国 兽药典》）。
[0065] (8)真空度测定包装前测定真空度，无真空的制品，应予剔除报废，不得重抽空出 售（《中国兽药典》）。
[0066] 三、组合方法
[0067] 按照3毫升水貂病毒性肠炎灭活疫苗稀释1头份犬瘟热活疫苗（本发明人自行生 产，生产批准文号：兽药生字（2010) 150256017)的比例，将水貂病毒性肠炎灭活疫苗做为 犬瘟热活疫苗的稀释液，配比后进行使用。
[0068] 其中，水貂病毒性肠炎灭活疫苗灭活前病毒含量为每毫升I. OX 107_ciTCID5ciAil以 上；犬瘟热活疫苗病毒含量为IO4 5TCID5tl/头份以上。
[0069] 本发明涉及的微生物菌种
[0070] 本发明涉及到的水紹病毒性肠炎病毒（Mink Enteritis Virus，MEV)MEV_RCl株已 于2012年04月12日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为：CGMCC No. 4331 ;
[0071] 本发明涉及到的犬癌热病毒（Canine distemper virus,Q)V)OW-Il株已于2009 年07月15日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为：CGMCC No. 3201。
[0072] 本发明的积极意义
[0073] 本发明提供一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗及犬瘟热活疫苗组合。本发明利用BEI 灭活后可以用硫代硫酸钠中和的特点，使用BEI灭活剂灭活水貂病毒性肠炎灭活疫苗，并 按一定比例稀释犬癌热活疫苗进行组合，达到了降低疫苗成本、减少动物应激、提高经济效 益、减轻了饲养者的劳动强度的目的。该发明有以下优点 ：
[0074] 1.犬瘟热活疫苗的目前应用中，往往是冻干产品，需要单独配制适用的疫苗稀释 液；水貂病毒性肠炎灭活疫苗的目前应用中，往往是甲醛灭活的液体疫苗，也只能是单独使 用。
[0075] 而本发明中，两种疫苗产品的应用采用BEI灭活的水貂病毒性肠炎灭活疫苗稀释 犬瘟热活疫苗的方法，直接省去了犬瘟热活疫苗的疫苗稀释液，降低了疫苗成本。
[0076] 2.与传统生产工艺相比，水貂病毒性肠炎灭活疫苗灭活剂由甲醛溶液改为BEI溶 液，BEI作用于病毒核酸，不破坏病毒的抗原蛋白，不影响病毒免疫原性。由于米用BEI对 病毒也进行灭活后，可以使用硫代硫酸钠将BEI灭活剂中和，因此灭活病毒后无残留，相比 甲醛溶液灭活，对动物应激小、安全性好。
[0077] 3.本发明利用了使用BEI灭活剂灭活病毒后无残留的特点，使得灭活疫苗与活疫 苗的组合后共同使用成为了可能，且疫苗组合免疫效果优于原两种单苗分别免疫的效果。
[0078] 4.本发明两种疫苗产品的组合，能够将以往两种疫苗产品单独应用时饲养者需要 一次捕抓动物注射两针降低为注射1针，减轻了疫苗免疫的劳动强度。
[0079] 实施例
[0080] 以下实施例进一步说明本发明。
[0081] 实施例1
[0082] --生产用毒种制备
[0083] 1、毒种繁殖取生长良好的F81细胞或者CRFK细胞按常规方法传代，待细胞长成 80%单层后，弃去生长液，换以含1 %毒种的维持液（含2%在56°C下灭活30分钟的新生牛 血清的MEM)，置37°C继续培养，待80%左右的细胞出现典型拉网式病变时收获，冻融1次， 定量分装，冷冻保存，注明收获日期、毒种代次等。
[0084] 2、毒种鉴定符合以上标准的毒种作为生产用毒种。
[0085] 3、毒种继代不超过3代。
[0086] 4、毒种保存-15°C以下保存，有效期为24个月。
[0087] 实施例2
[0088] --水貂病毒性肠炎灭活疫苗的制造
[0089] 1、制苗用材料的选择
[0090] 选择生长良好、符合现行《中国兽药典》生产、检验用细胞标准的F81细胞或者 CRFK细胞做为制苗用材料，细胞代次为F6?F35代。
[0091] 2、制苗用毒液的繁殖
[0092] (1)生物反应器清洗灭菌及微载体平衡将生物反应器清洗干净，121°C灭菌30分 钟。灭菌结束后，将灭菌好的微载体打入细胞培养罐中，将平衡培养基MEM打入罐中至最小 培养体积，平衡24小时。平衡载体期间完成溶氧电极100%点的校正。
[0093] (2)细胞接种及消化转移选择生长旺盛的转瓶细胞，用EDTA-胰蛋白酶分散液 消化后，用含8%新生牛血清的MEM悬浮制成细胞悬液，接种30L细胞培养罐，接种密度 5. OX 105cells/ml，连续培养3天，细胞罐培养过程中当葡萄糖含量低于500mg/L，用含5% 新生牛血清的MEM培养基批次换液，当细胞密度达到2. OX 106cells/ml以上后进行消化转 移，即培养规模的放大。转移前，将在细胞培养罐内连续培养，或者CRFK细胞取样观察并用 〇. 1%结晶紫染色计数，细胞密度达到2X 106cells/ml时，按3倍放大到90L细胞罐。
[0094] (3)细胞罐放大转移按照上述步骤逐级放大，将90L细胞罐依次放大转移至350L、 1000L细胞罐。
[0095] (4)接毒及收获1000L细胞罐培养至细胞密度达到I. 5X 106cells/ml时，接种水 貂肠炎病毒MEV-RCl株，接毒时采用含1 %新生牛血清的DMEM培养基，温度37°C，接毒量为 MOI = 0. 1。接毒后定时取样观察细胞，待微载体表面80%细胞病变突起且有少量脱落时， 连续高速搅拌15分钟，通过消化器滤除微载体收获病毒液，取样进行病毒含量测定后，收 获的病毒液标明名称、收获日期、批号，存放_15°C低温冷库，待检备用。
[0096] 3、灭活向病毒液中加入2%的BEI溶液，使其终浓度为0. 2%，37°C灭活48小时， 期间每隔4?8小时混匀1次；灭活完全后，向病毒液中添加50%的硫代硫酸钠溶液，使其 终浓度为〇. 4%，加入后搅拌1小时。
[0097] 4、配苗将灭活病毒液和灭菌的氢氧化铝胶（附注3)按9 : 1(V/V)比例进行配苗， 使疫苗中氢氧化铝胶含量以氧化铝表示不超过3. 9mg/ml，充分搅拌。
[0098] 5、分装、贴签、入库保存。
[0099] 实施例3
[0100] -水貂病毒性肠炎灭活疫苗的成品检验
[0101] (1)性状静置后，上层为粉红色液体，下层为淡粉红色沉淀，振摇后呈均匀混悬液。
[0102] (2)无菌检验无菌生长。
[0103] (3)装量检查按现行《中国兽药典》附录进行检验，均符合规定。
[0104] (4)安全检验用5月龄健康易感水貂（MEV HI抗体效价不高于1 : 4)5只，各皮下 注射疫苗3ml，连续观察10日，均未出现异常，全部健活。
[0105] (5)效力检验
[0106] 取5月龄健康易感水貂（MEV HI抗体效价不高于1 : 4) 5只，各皮下注射疫苗lml， 同时设不接种对照水貂5只。免疫后14日，对所有水貂分别通过口服途径攻击水貂肠炎病 毒MEV-RCl株病毒液15ml (病毒含量为15 X 107_ tlTCID5tl)，观察10日。对照水貂全部发病， 免疫水貂全部健活。
[0107] (6)汞类防腐剂残留量测定分别按现行《中国兽药典》附录进行测定，测定结果为： 未检出。
[0108] 实施例4
[0109] --犬瘟热活疫苗的制备
[0110] 1、生产用种毒的制备
[0111] 犬瘟热病毒株⑶V-Il株接种转瓶上的Vero细胞单层，接毒量为维持液量的2%， 当细胞病变达80%时即可收获，再传1代，制备生产用种毒。
[0112] 2、病毒液的繁殖
[0113] 用生产用种毒,接种到转瓶上的Vero细胞单层,接毒量为细胞维持液的2%。然后 将转瓶细胞置37°C培养，转速为10r/h。
[0114] 接种后，每天观察细胞病变情况，当细胞病变达80%左右时即可收获，冻融1次， 置-15°C冻结保存，此为半成品。
[0115] 3、冻干
[0116] 经过半成品合格检验合格后，用常规冻干保护剂（《中国兽药典》）与病毒液的体 积比按照1:1混合，分装成2ml/瓶，按照设计好的冻干曲线进行冻干，S卩：-65°C，维持2小 时使疫苗迅速冻结，然后抽真空，当真空度达13. 3Pa时，开始升温干燥，升华阶段产品温度 为-20?-KTC，搁板温度为8°C，升华时间为10个小时；解析温度为30°C，2个小时。
[0117] 实施例5
[0118] --犬瘟热活疫苗的成品检验
[0119] (1)无菌检验无菌生长。
[0120] (2)支原体检验无支原体生长。
[0121] (3)鉴别检验将疫苗作KT2稀释，与等量KT1稀释的犬瘟热阳性血清混合，经37°C 中和30分钟，接种Vero细胞4瓶，同时设病毒对照组2瓶，置37°C培养，连续观察CPE 96? 120小时。中和组和细胞对照组均未出现CPE，不中和对照组全部出现CPE。
[0122] (4)外源病毒检验按《中国兽药典》中的规定进行检验，均无外源病毒。
[0123] (5)安全检验将每头份疫苗用Iml生理盐水溶化后，肌肉接种3月龄易感犬（SN抗 体效价彡1:4) 5只，10头份/只，观察21日，5只接种易感犬均未出现异常反应。
[0124] (6)效力检验每头份疫苗病毒含量为105 57TCID50。
[0125] (7)剩余水分测定4个样品结果为：1. 84%、1. 81%、1. 73%、1. 80%。
[0126] 实施例6
[0127] --水貂病毒性肠炎灭活疫苗加倍剂量安全性比较试验
[0128] 取2月龄水貂30只，随机分为3组。第1组后腿部肌肉注射一针本发明疫苗组合 3ml (10头份犬瘟热活疫苗用3ml水貂病毒性肠炎灭活疫苗稀释），第2组左右后腿内侧肌 肉分别免疫犬瘟热活疫苗10头份和水貂病毒性肠炎灭活疫苗3ml作为疫苗对照，第3组不 免疫作为空白对照。分别隔离饲养，观察10日，观察水貂精神、饮食变化。并在14日时将 所有水貂剖杀作病理学检查。
[0129] 结果一针两防免疫组接种水貂精神、饮食均正常；体温无明显变化，均在正常 38. 5°C?39. 4°C范围内，与对照水貂各项指标无明显差别；接种部位没有出现肿胀、坏死， 无全身不良反应；免疫后14日将所有水貂剖杀，免疫组接种部位均未出现肿块和溃疡等不 良反应。
[0130] 实施例7
[0131] --疫苗组合与各自单苗对水貂免疫效力比较试验
[0132] 取2月龄水貂30只，随机分为3组。第1组（疫苗组合免疫组）腿部肌肉注射一 针两防疫苗Iml (1头份犬瘟热活疫苗用3ml水貂病毒性肠炎灭活疫苗稀释），第2组（免疫 对照组）两侧腿部肌肉分别免疫2种疫苗（福尔马林灭活的水貂肠炎灭活疫苗Iml、犬瘟热 活疫苗0. 33头份/lml)，第3组不免疫作为空白对照。免疫后21天，采血，分别测定犬瘟 热、水貂病毒性肠炎病毒抗体效价。
[0133] 结果显示一针两防免疫方式抗MEV HI值与⑶VSN抗体值均达到保护要求，且均高 于两种疫苗分别注射免疫方式。具体结果见表1。
[0134] 表1疫苗组合与各自单苗对水貂免疫效力比较试验结果
[0135]

【权利要求】
1. 一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗-犬瘟热活疫苗组合，其特征在于该组合是由水貂病 毒性肠炎灭活疫苗和犬瘟热活疫苗组成，其中水貂病毒性肠炎灭活疫苗兼作犬瘟热活疫苗 的稀释剂。
2. 权利要求1所述的一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗-犬瘟热活疫苗组合，其特征在于 组合中水貂病毒性肠炎灭活疫苗使用的灭活剂为烷化剂。
3. 权利要求1所述的一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗-犬瘟热活疫苗组合，其特征在于 组合中两种疫苗具有每3毫升水貂病毒性肠炎灭活疫苗稀释1头份犬瘟热活疫苗的配比关 系，其中水貂病毒性肠炎灭活疫苗灭活前病毒含量为每毫升l.〇Xl〇 7_°TCID5(l以上、犬瘟热 活疫苗每头份病毒含量为l〇4 5TCID5(l以上。
4. 如权利要求1、2所述的一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗-犬瘟热活疫苗组合，其特征 在于该组合中水貂病毒性肠炎灭活疫苗制备步骤包括： (1) 将F81细胞系或者CRFK细胞进行传代和培养； (2) 将水貂病毒性肠炎病毒接种到长满70%?90% F81或者CRFK单层细胞的介质上， 用维持液培养，制备生产用种毒； (3) 通过微载体平衡、细胞接种及消化转移、细胞罐放大转移使细胞培养扩大培养，当 细胞密度达到1.5X106cells/ml以上时，接种水貂肠炎病毒，得到水貂病毒性肠炎病毒抗 原液； (4) 将水貂病毒性肠炎病毒抗原液灭活后加入水溶性佐剂即得。
5. 权利要求2所述的水貂病毒性肠炎灭活疫苗-犬瘟热活疫苗组合，其特征在于所述 烷化剂为灭活终浓度为0. 05 %?0. 3 %的BEI溶液。
6. 权利要求4所述的水貂病毒性肠炎灭活疫苗-犬瘟热活疫苗组合，其特征在于是其 中的水貂病毒性肠炎病毒为水貂病毒性肠炎病毒（Mink Enteritis Virus，MEV)MEV-RC1 株，保藏号为CGMCC No. 4331。
【文档编号】A61K39/175GK104258386SQ201410462321
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月12日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】禚宝山, 宋晓飞, 李营, 秦绪伟, 田真, 王景伟, 王蕾, 鲍海忠 申请人:齐鲁动物保健品有限公司