一种鸭肝炎二价活疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种鸭肝炎二价活疫苗及其制备方法。属于兽用生物制品领域。
【背景技术】
[0002] 鸭肝炎（Duck Hepatitis，DH)是由鸭肝炎病毒（Duck Hepatitis virus，DHV)引起 雏鸭的一种以肝脏呈现出血性炎症为特征，具有急性、高度接触性和致死性的传染性疾病。 该病一年四季均可发生，自然暴发时仅发生于雏鸭，对养殖业造成了巨大经济损失。传统的 鸭肝炎病毒有三个血清型，分别引起1型、2型和3型鸭肝炎（陆承平.兽医微生物学(第三版） [M].北京：中国农业出版社，2001，564)。近年来，由于免疫压力等因素，血清I型鸭肝炎病毒 呈现出新的流行态势。中国台湾地区和韩国的学者陆续分离出了与1型DHV基因组结构相近 的典型小RNA病毒，称台湾新型和韩国新型，均不与DHV-1产生交叉中和反应，为避免混淆， 已将鸭肝炎病毒改称为鸭甲肝病毒(DHAV)，分为血清I型(DHAV-1)、台湾新型(DHAV-2)和韩 国新型(DHAV-3)。传统的DHV血清2型和3型分别归类为鸭星状病毒DAstV-Ι型和DAstV-2型。
[0003] 在我国，鸭肝炎的流行大致分三个阶段：1958-1962年发生了DHAV-1型鸭肝炎的初 次流行(黄均建.小鸭肝炎研究[M].上海:上海农业科学院畜牧兽医研究所.1963); 20世纪 80年代初期起本病在我国再次流行，郭玉璞根据病毒中和实验和血清被动保护试验结果， 证实我国流行的DHAV病原为1型鸭肝炎病毒(郭玉璞.北京鸭肝炎血清型的初步鉴定[A].中 国畜牧兽医学会禽病研究会第三次学术讨论会论文摘要[C]. 1986，78)。其后，各地疫情此 起彼伏，疫情能够被标准鸭肝炎I型弱毒疫苗的免疫所控制；1997年以来在某些地区出现较 严重的流行，其疫情不能被标准鸭肝炎1型弱毒疫苗免疫完全的控制，3型鸭肝炎病毒在我 国大陆首次被报道(林世棠，黄瑜，等.一种新的鸭传染病研究I，流行情况与初步诊断[J]. 中国畜禽传染病，1996，4:14-17.舒敬良，黄瑜，等.新型鸭肝炎病毒的分离及初步鉴定[J]. 中国兽医科技，2002，32(1): 15-16)。到目前为止，我国已有二十多个省市报道有本病发生， 其中DHAV-3发病数量逐渐增多，使用现有的鸭肝炎疫苗和其高免血清以及高免卵黄抗体均 未能防治该病。
[0004] 我国目前肉鸭养殖规模已经超过35亿只，占到全球总量的70%以上，无论是存栏 量还是鸭肉产量均稳居世界第一。在现代化、集约化和规模化的现代养殖业中，动物的疫病 防治成为发展养殖业的关键。在众多动物传染性疾病中，防治好危害3周龄以下雏鸭，病死 率达50 %~90 %的鸭肝炎对养鸭场具有重大的经济意义。
[0005] 目前国内市场上用于预防鸭肝炎的活苗仅有鸭肝炎病毒血清1型单价苗。而3型鸭 肝炎病毒的流行也很普遍，且已经出现了 1型和3型鸭肝炎病毒的共感染。研制鸭肝炎二价 活疫苗迫在眉睫。
[0006] 据报道，经胚胎传代致弱的1型鸭肝炎病毒株接种后仍可引起轻微的、一过性的组 织学变化，经雏鸭回复传代后可发生毒力返强现象（W ο ο 1 c 〇 c k，P . R a n d G.ff.Crighton.Duck virus hepatitis:serial passage of attenuated virus in duckling.Vet Rec.1979,105:30-32.ffoolcock,P.R and G.ff.Crighton.Duck virus hepatitis: the effect of attenuation on virus stability in duckling. Avian Path. 1981，10:113-119)。本发明中提供的1型鸭肝炎病毒QLl株和3型鸭肝炎病毒QL3株安 全性好，经雏鸭回复传至第6~7代，雏鸭仍健活，无发病死亡。
【发明内容】
[0007] 本发明人从疑似鸭肝炎发病鸭中采集肝脏组织，用鸡胚传代方法分别分离到一株 1型鸭肝炎病毒QL1株和一株3型鸭肝炎病毒QL3株，随后对这两株病毒进行鸡胚传代致弱和 免疫原性研究，证明这两株病毒已具有良好的安全性和免疫原性，可以作为疫苗株。
[0008] 本发明的目的在于提供鸭肝炎病毒1型和3型二价活疫苗，含有致弱的1型鸭肝炎 病毒QL1株和3型鸭肝炎病毒QL3株;该二价活疫苗免疫后保护性抗体产生快，免疫攻毒保护 率高，对1型和3型鸭肝炎的攻毒保护率均达到90%以上。
[0009] 本发明的技术方案：
[0010] 1. 一种鸭肝炎二价活疫苗，其特征在于所述活疫苗含有1型鸭肝炎病毒DHV-1QL1 株和3型鸭肝炎病毒DHV-3QL3株的活病毒，可同时预防由1型和3型鸭肝炎病毒引起的鸭肝 炎。
[0011] 2.如权利要求1所述鸭肝炎二价活疫苗其特征在于:所述1型鸭肝炎病毒DHV-1QL1 株和3型鸭肝炎病毒DHV-3QL3株已于2016年01月29日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.12036、CGMCC No.12037。
[0012] 3.如权利要求1所述的鸭肝炎二价活疫苗，其特征在于所述DHV-1QL1株P1基因的 核苷酸序列为序列5、氨基酸序列为序列6。
[0013] 4.如权利要求1所述的鸭肝炎二价活疫苗，其特征在于所述DHV-3QL3株P1基因的 核苷酸序列为序列11、氨基酸序列为序列12。
[0014] 5.如权利要求1所述鸭肝炎二价活疫苗，其特征在于所述DHV-1QL1株P1基因的氨 基酸序列具有序列6的特征，第821至823位的氨基酸为LFD。
[0015] 6.如权利要求1所述鸭肝炎二价活疫苗，其特征在于所述DHV-3QL3株P1基因的氨 基酸序列具有序列12的特征，第10、224、352位的氨基酸分别为N、Y、Y。
[0016] 7.如权利要求1所述鸭肝炎二价活疫苗的制备方法，其特征在于用所述DHV-1QL1 株和DHV-3QL3株作为疫苗生产毒株，分别接种SPF鸡胚，收获感染胚尿囊液、胎儿及绒毛尿 囊膜混合研磨，制备成病毒含量大于等于lO^ELDso/ml的DHV-1QL1株病毒液和病毒含量大 于等于10 8'5ELD5Q/ml的DHV-3QL3株病毒液，再将其混合后加冻干保护剂经真空干燥制成鸭 肝炎二价活疫苗。
[0017] 本发明【具体实施方式】
[0018] 1病毒疫苗株的选育
[0019] 1.1DHV-1QL1 株选育
[0020] 将DHV-1QL1强毒株通过尿囊腔途径接种9~10日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，置37°C孵 育，无菌收集24h后死亡鸡胚尿囊液，进行下一代传代。连续传至65代，进行致弱评价。将 E25、E45、E65代毒株分别接种1日龄健康易感鸭，每只肌肉注射0.5ml，并设置生理盐水对照 组。自接种之日起，每日观察、记录接种鸭的发病和死亡情况。E25代毒接种雏鸭后死亡率为 4/10，E45代毒接种雏鸭后死亡率为1/10，E65代毒接种雏鸭后发病率和死亡率均为Ο，剖检 未见肝脏肿大、出血等特异性病理变化，与对照鸭状态一致。说明该传代毒Ε65代已经致弱， 可作为疫苗研制的候选毒株。
[0021] 1 · 2DHV-3QL3 株选育
[0022] 将DHV-3QL3株强毒株通过绒毛尿囊膜途径接种8~10日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，置 37°C孵育，无菌收集24h后死亡鸭胚尿囊液，进行下一代传代。连续传至110代，进行致弱评 价。将E10、E30、E60、E90、E110代毒株分别接种l日龄健康易感鸭，每只肌肉注射0.5ml，并设 置生理盐水对照组。自接种之日起，每日观察、记录接种鸭的发病和死亡情况。E10、E30、E60 代毒接种雏鸭后死亡率依次为9/10、5/10、3/10 490代毒接种雏鸭后死亡率为1/10 4110代 毒接种雏鸭后发病率和死亡率均为〇，剖检未见肝脏肿大、出血等特异性病理变化，与对照 鸭状态一致。说明该传代毒E110代已经致弱，可作为疫苗研制的候选毒株。
[0023] 2病毒特性
[0024] 2.1病毒疫苗株的培养
[0025] 将DHV-1QL1株疫苗株通过尿囊腔途径接种9~10日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，置37°C 孵育96h，无菌收集36h后死亡鸡胚尿囊液，置-20°C保存。检测传代毒液毒价，病毒含量稳定 在 109'°ELD5〇/ml 以上。
[0026]将DHV-3QL3株疫苗株通过绒毛尿囊膜途径接种8~10日龄SPF鸡胚或卵黄囊途径 接种6~7日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，置37 °C孵育96h，无菌收集36h后死亡鸭胚尿囊液，置-20 °C保存。检测传代毒液毒价，病毒含量稳定在108· 5ELD5Q/ml以上。
[0027] 2.2特异性
[0028] 将DHV-1QL1株病毒液用无菌生理盐水稀释成200ELD5Q/0.1ml，分两组，一组与等量 的鸭肝炎病毒I型特异性血清混匀，另一组与等量生理盐水混合，37°C中和1小时后，经尿囊 腔接种9~10日龄SPF鸡胚10枚，每胚0.2ml，置37 °C下培养并观察168小时。中和组应不发生 特异性病变和死亡，且至少存活8枚，未中和对照组应至少有8枚鸡胚死亡。
[0029] 将DHV-3QL3株病毒液用无菌生理盐水稀释成200ELD5Q/0.1ml，分两组，一组与等量 的鸭肝炎病毒m型特异性血清混匀，另一组与等量生理盐水混合，37°C中和1小时后，经绒 毛尿囊膜途径接种8~10日龄SPF鸡胚10枚，每胚0.2ml，置37 °C下培养并观察168小时。中和 组应不发生特异性病变和死亡，且至少存活8枚，未中和对照组应至少有8枚鸡胚死亡。 [0030] 2.3纯净性
[0031]按现行《中国兽药典》（中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇一〇年版 三部.中国农业出版社，2011)附录进行，DHV-1QL1株毒种和DHV-3QL3株毒种无细菌、霉菌、 支原体和外源病毒污染。
[0032] 2.4免疫原性
[0033] 20只1日龄健康易感雏鸭(DHV-1型、DHV-3型中和抗体效价< 1:4)随机分为2组，10 只/组。第1组肌肉注射DHV-1QL1株毒种，每只0.1ml (含103'5ELD5Q)。第2组作为不接种对照 组。免疫后7日，采集血清样品检测DHV-1中和抗体效价，同时第1组和第2组雏鸭肌肉注射 DHV-1型强毒株，每只0.5ml。攻毒后观察7天，免疫组雏鸭10/10状态良好，无发病和死亡， DHV-1中和抗体效价均> 1:8。攻毒组雏鸭7/10死亡，DHV-1中和抗体效价均< 1:2。说明DHV-1QL1株毒具有良好的免疫原性。
[0034] 20只1日龄健康易感雏鸭(DHV-1型、DHV-3型中和抗体效价< 1:4)随机分为2组，10 只/组。第1组肌肉注射DHV-3QL3株毒种，每只0.1ml (含103'5ELD5Q)。第2组作为