基于二代测序平台的结肠癌微卫星不稳定性检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种结肠癌微卫星不稳定性检测试剂盒，尤其是设及一种基于二代测 序平台对结肠癌患者微卫星不稳定性进行检测的检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 结直肠癌发病率在我国高居各类癌症发病率的第3位，占癌症死因的第5位， 其根治性切除后5年生存率为50%左右，术后复发和转移是其死亡的重要原因。早期 结肠癌患者通常可借手术切除，一旦转移，其治疗的方法并不多，患者五年生存率也不理 想。研究发现，基因组的不稳定性与结直肠癌的发病机理密切相关，基因组的不稳定性包 括染色体不稳定性（C虹omosomalinst油ility，CI)和微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI)。
[0003] 微卫星是指基因上含有重复的DM短小序列或单核巧酸区域。在肿瘤细胞中，当 DNA发生甲基化或基因突变致错配修复基因缺失时，可导致微卫星重复序列错配（微卫星 突变），导致其序列缩短或延长，从而引起微卫星不稳定性（microsatelliteinst油ility， MSI)。根据MSI不稳定性的程度，可分为高不稳定性（MSI-H)和低不稳定性（MSI-L)，正常 情况下称为微卫星稳定（microsatellitest油ility，MS巧。
[0004] 大量研究表明，MSI参与恶性肿瘤的发生发展过程，与结肠癌、胃癌、子宫内膜癌等 等发生密切相关。约15%的结直肠癌患者存在MSI现象，其中典型的遗传性非息肉病性结 直肠癌化ereditary no吨olyposis colerectal cancer, HNPCC)患者90%W上为MSI瘤， 表明MSI可作为检测是否为HNPCC患者的重要标志物；与MSS(即微卫星稳定）的结肠癌相 比，携带有MSI的结直肠癌患者其预后更好，并且二者药物反应也不一样，提示MSI可作为 结直肠癌预后的独立预测因子，因此，MSI检测对结直肠癌患者意义重大。
[0005] 美国国家肿瘤研究所（化tionalCancerInstitute,NCI)曾经通过一个针对肿 瘤的微卫星不稳定及复制错误表型检测的国际专题会议制定了MSI检测的统一标准（即 BethesdaGuidelines)，作为设及检测MSI的参考Panel(即NCIPanel)，它包含2个单核 巧酸重复的位点度AT-25、BAT-26)和3个2核巧酸重复的位点值2S123、D5S346、D17S250)。 据此对肿瘤MSI状态进行检测时，5个STR位点如果检测出2个或2个W上的位点有MSI, 则为MSI-H，MSI-H肿瘤表现出特有的临床及病理学表型；若只检测出1个位点有MSI,则为 MSI-L无任何位点变化者为MSS。然而，MSI-L与MSS的肿瘤表型差异不大，要区别MSI-L 与MSS的肿瘤表型，需要选用更多位点来进行检测时才能实现。
[0006] 在2002年的第二次相关专题会议上，针对之前采纳的检测MSI的参考Panel来检 巧。MSI出现了争议，因为NCIPanel使用的3个2核巧酸重复的位点具有高多态性的特征， 在检测时必须用与肿瘤组织相匹配的正常组织来作比较才能得出结果，使其在检测存在错 配修复缺陷的肿瘤时表现出较低的特异性和灵敏度。因此采用NCIPanel来检测MSI存在 一定的局限性，大会建议增加单核巧酸重复位点来检测MSIW提高检测的灵敏度。
[0007] 2015年最新发布的药物代谢酶和药物作用祀点基因检测技术指南（试行）中 明确规定，MSI的检测可用于氣尿喀晚类药物的辅助疗效预测。近期研究发现，MSI-H较MSI-L和MSS的结肠癌患者在接受PD-1抗体〔即抑A批准的两种免疫检查点抑制药物 (Nivolumab(MDX1106)和化mbrolizum油））治疗后具有更好的临床反应性，表明结直肠癌 患者的MSI水平可作为一个对PD-1/PD-L1抗体响应的独立预测因子来预测筛选从PD-1抗 体免疫治疗获益的结肠癌患者群体。对检测结直肠癌患者的MSI水平，可用于免疫检查点 抑制剂类药物的辅助疗效预测。
[0008] 因此，建立MSI检测体系W寻找高度灵敏性及特异性的用来检测MSI的相关位点 已成为近年来研究MSI检测领域的热点。
[0009] 现有检测MSI的方法主要为：
[0010]1)免疫组化方法，该方法仅用于肿瘤细胞中的MLH1、Μ甜2、MS册和PMS2蛋白结合， 如果没有结合任何的蛋白，则证明发生了MSI;该方法的灵敏度虽然接近90%，但特异性和 可重复性较低，操作比较复杂；
[0011] 2)毛细管电泳法，该方法主要针对MSI相关的基因序列上简单的重复结构，通过 片段分析可W判断重复碱基的重复数目，从而进行MSI基因分型；该方法使用相对成熟，进 样量少、分辨率和自动化程度较高，然而由于进样量少，因而制备能力差；而毛细管直径小 导致光路太短，用一些检测方法（如紫外吸收光谱法）时，灵敏度较低；此外，电渗会因样品 组成而变化，进而影响分离重现性；
[0012] 3)PCR法，该方法通过选定特异的引物，W自身正常组织为对照，在体外对微卫星 位点进行PCR扩增，扩增后的产物经聚丙締酷胺凝胶电泳，经放射自显影等分析有无迁移 率的改变；该方法是目前常用的检测方法且已经被证实为最有效的初筛手段，但PCR法只 检测五个微卫星基因，产物做凝胶电泳的方法，存在操作繁琐、成本高等诸多缺陷；
[0013] 4)多重巧光PCR，该方法主要针对NCI建议的位点进行扩增，W确定MSI状态；采 用该方法检测微卫星，其引物间的竞争与干扰因素较为复杂，扩增产物不容易错开，会直接 导致检测结果的不确定性，因此该方法对引物特异性和引物浓度都有很高的要求；
[0014]W直接测序法，该方法针对MMR基因各区域（MLH1、Μ甜2、MS册和PMS2等）的扩 增产物进行sanger法测序来确定其MSI状态；该方法的检测周期较长，成本相对较高。
[0015] 因此急需开发更多位点和更好灵敏度的MSI检测系统势W满足市场和医疗的迫 切需求。
【发明内容】
[0016] 本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种基于二代测序平台 的结肠癌微卫星不稳定性检测试剂盒，使用该试剂盒对结肠癌微卫星不稳定性进行检测， 检测通量高，灵敏度强，特异性强，能够一次性检测所有位点。
[0017] 本发明解决其技术问题采用的技术方案是，基于二代测序平台的结肠癌微卫星不 稳定性检测试剂盒，包括4. 5 - 6. 5μ1 (优选5μ1)的引物panel溶液，所述引物panel溶 液中各溶质的浓度均为45 - 55mmol/L(优选50mmol/L)。
[001引所述引物panel包括10个微卫星位点的引物，其正向引物与反向引物序列如下：
[0019]
[0020] 所述试剂盒中，还包括8 - 10μ1 (优选9. 5μ1)的MasterMixW及1. 3 - 1. 7血（优选1. 5血）无酶水；
[0021] 所述MasterMix包括 3 ~7μ1 (优选 5μ1) 10礼ATaqBuffer和 3 ~5μ1 (优 选 4μ]_) 2 ~4mmol/L的dNTPs，W及 0. 5 ~1μ1LATaqenzyme。
[0022] 所述基于二代测序平台的结肠癌微卫星不稳定性检测试剂盒的多重PCR反应条 件为：93°C~98°C预变性2~3min，然后进入聚合酶链式反应扩增阶段：93°C~96°C变性 20~30s，55°C~65°C退火20~30s，70°C~75°C延伸20~45s;最后70°C~74°C延伸 lOmin，并进行10~12个循环，4°C静置。
[0023] 多重PCR过程同时进行阴性对照实验，所用对照样本为正常人基因组DNA。
[0024] 所述的基于二代测序平台的结肠癌微卫星不稳定性检测试剂盒的检测基因包括 NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26、M0N0-27,D2S123,D5S346 和D17S250。
[00巧]二代测序反应体系的组成为：DNA样本多重PCR反应、模板文库构建、上机模板准 备和富集反应、上机测序反应和测试数据处理分析。
[0026] 本发明之基于Illumina公司的MiSeq二代测序平台对结肠癌患者微卫星不稳定 性的检测试剂盒的使用方法，包括进行MSI相关的10个标记基因的多重PCR反应、模板文 库构建、上机测序W及基于测序结果对微卫星状态的结果判定。具体内容如下：
[0027] (1)挑选MSI相关的10个标记基因并进行多重PCR反应：
[0028] ①根据Besthesta guideline,调取敏感性和特异性最好的10个MSI标记基因位 点序列（其中包括7个单核巧酸重复位点和3个双核巧酸重复位点），见表1 :
[0029] 表1 10个微卫星位点信息
[0030]
[0031] 表2微卫星位点测序引物
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[0033] ②对运10个MSI相关的基因位点通过设计引物进行多重PCR扩增反应，所述的扩 增引物见表2。
[0034] 似进行文库构建和测序反应
[0035] 模板文库构建过程包括DNA随机打断、末端补平修复及纯化、末端连接测序接头、 模板扩增和纯化、纯化后富集，所述反应体系中包含末端补平酶混合物20μ1、0. 4-1U连 接酶、0. 4-lU扩增Taq酶、5-lOmM测序接头A和Pl、5-10mM测序接头A和PI通用引物、 10-15XBuffer和2-5XAmpure纯化磁珠等试剂。
[0036] 上述测序反应包括MiSeq测序反应过程，其原理是采用可逆性末端边合成边测 序反应，首先在DNA片段两端加上序列已知的通用接头构建文库，文库加载到测序忍片 Flowcell上，文库两端的已知序列与Flowcell基底上的Oligo序列互补，每条文库片段都 经过桥式PCR扩增形成一个簇，测序时采用边合成边测序反应，即在碱基延伸过程中，每个 循环反应只能延伸一个正确互补的碱基，根据四种不同的巧光信号确认碱基种类，保证最 终的核酸序列质量，经过多个循环后，完整读取核酸序列。上机反应获得的数据结果通过序 列筛选、拼接和比对等方法W及生物信息学分析，最终获得测试样本的SNP位点信息。
[0037] 本发明采用二代测序技术来检测MSI基因位点，即，首先进行MSI相关的10个标 记基因的多重PCR反应，接着构建模板文库、通过一系列上机模板准备和富集反应后获得 测序文库，然后基于Illumina公司的MiSeq二代测序平台对含MSI相关标记基因位点进行 测序，能够一次性获得所有微卫星位点的变异信息，检测结果具有通量高，灵敏度强、特异 性好等优点。运种方法随着试剂盒开发成功可W批量生产，使用条件可W模式化，全部过程 都有自动化设备。此外，用此试剂盒检测结直肠癌患者的MSI水平后，还可应用于筛选适合 PD-L1抗体治疗的结直肠癌患者人群。
[0038] 本发明之基于Illumina公司的MiSeq二代测序平台对国内外发病率较高的结 肠癌患者的微卫星不稳定性位点（包括NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26、 M0N0-27,D2S123,D5S346和D17S250)进行检测的试剂盒，该试剂盒能够一次性检测所有 MSI位点，其结果比5位点检测更为准确，特异性更好，人为干扰因素小，运种方法随着试剂 盒开发成功可W批量生产，使用条件可W模式化，全部过程都有自动化设备，能大大提高肿 瘤相关的微卫星不稳定性的检测水平。此外，用此试剂盒检测结直肠癌患者的MSI水平后， 还可应用于筛选适合PD-L1抗体治疗的结直肠癌患者人群。
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