一种dna-蛋白质缀合物及其在检测汞离子浓度中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及检测分析领域，具体设及一种DNA-蛋白质缀合物及其在检测隶离子 浓度中的应用。
【背景技术】
[0002] 近年来，利用功能核酸作为新型生物识别元件的传感分析方法发展迅速，备受科 研团队与企业研发部口的关注。功能核酸是具有亲和识别、催化等特定功能的核酸片段，包 括核酸适配体、DNA酶W及能通过碱基错配等作用形成特定结构的核酸片段。
[0003] 利用碱基错配作用对环境中污染物进行检测是功能核酸的一类典型作用。碱基错 配是指在特定条件下，两个非互补的碱基错配形成碱基对，如"C-Ag-C"等。2004年，日本 东京都立大学的化0和Togashi课题组首次报道了"道了T-Hg-T"碱基错配作用，并将其应 用于水体中隶离子的选择性检测中：该课题组将一段富含T碱基的寡聚核巧酸两端分别修 饰巧光基团与泽灭基团，基于隶离子被碱基错配识别后产生的DNA构象变化实现巧光信号 的增强或减弱，从而建立起隶离子浓度与巧光信号的定量关系。运一设计材料简单，检测方 便，属于均相"turn-off"的检测模式一一即在隶离子存在的条件下，DNA链段通过碱基错 配作用形成弯折的发卡结构，在空间上使巧光基团和泽灭基团接近，体系巧光值亦由于二 者之间的FRET作用而降低。运种祀标物愈多、信号愈低的"turn-off"模式通常易受样品 基质中干扰物的影响，有可能产生虚假信号，不利于实际未知水样的检测。之后美国伊利诺 伊大学厄己纳-香横分校的LuYi课题组通过引入互补链，将此方法优化为"turn-on"模 式，但上述报道均属于均相反应体系。均相反应体系虽然简便快捷，但试剂消耗量大、难W 重复利用，W至单次检测成本高。相对而言，固相传感借助于一个固定的传感界面，可对界 面进行再生重复使用，是实现在线监测的前提，具有重要的实际应用意义。
【发明内容】
[0004] 为了解决上述问题，本发明充分利用DNA链与其互补核酸链之间的FRET作用W及 "DNA-蛋白质"缀合物与倏逝波传感忍片上固定的蛋白质配基之间的亲和反应，获得了一种 能够有效检测隶离子浓度的方法。 阳0化]因此，本发明一方面提供了一种DNA-蛋白质缀合物，其中DNA链修饰W巧光标记 基团，其互补核酸链修饰W巧光泽灭基团，并且DNA链富含T碱基，缀合物中蛋白质部分与 倏逝波传感忍片上固定的蛋白质配基发生亲和反应。
[0006] 在本发明优选的实施方案中，DNA链包含序列1所示的核巧酸序列，其互补核酸链 包含序列2所示的核巧酸序列，巧光标记基团为切5. 5,巧光泽灭基团为B册-3,蛋白质部分 为链霉亲和素。
[0007] 在本发明进一步优选的实施方案中，DNA链的核巧酸序列如序列1所示，其互补核 酸链的核巧酸序列如序列2所示。
[0008] 本发明另一方面提供了一种检测隶离子浓度的方法，包括制备脱硫生物素修饰光 纤、合成DM-蛋白质缀合物W及检测隶离子浓度的步骤。
[0009] 其中制备脱硫生物素修饰光纤包括光纤预处理、制备APTS-光纤、制备氨基光纤、 制备脱硫生物素溶液W及制备脱硫生物素-光纤的步骤。
[0010] 合成DNA-蛋白质缀合物包括制备活化的琉基DNA、制备活化的链霉亲和素蛋白、 制备DNA-链霉亲和素蛋白缀合物浓缩液W及制备DNA-链霉亲和素蛋白缀合物储备液的步 骤。
[0011] 检测隶离子浓度包括配制隶离子储备液W及检测隶离子浓度的步骤。
[0012] 在本发明优选的实施方案中，制备脱硫生物素修饰光纤的具体步骤为： 阳01引 1、光纤预处理：将光纤置于浓H2SO4与H202体积比为3:1的混合溶液中，120°C加 热1小时，充分洗涂光纤后，室溫下吹干，70°C真空干燥过夜。
[0014] 2、制备APTS-光纤：用无水甲苯配制体积比为2%的（3-氨基丙基）Ξ乙氧基娃 烧（APT巧溶液，将步骤1经预处理的光纤放入其中，反应1小时，用甲苯反复冲洗，氮气吹 干后，200°C烘烤1小时。
[0015] 3、制备氨基光纤：自然降溫后，用2. 5%的戊二醒的乙醇溶液浸没光纤，室溫下反 应1小时，用乙醇反复冲洗，加入乙醇配制的10%的乙二胺，室溫反应1. 5小时，用乙醇配制 的Img/mL的NaBH4溶液还原未反应的醒基15分钟。
[0016] 4、制备脱硫生物素溶液：分别称取25毫克脱硫生物素、50毫克EDC和50毫克 N服，置于离屯、管中，加入1毫升DMF，室溫下反应3小时后，加入200微升抑值为8. 7的1M NaHC03-Na2C03 缓冲液。
[0017] 5、制备脱硫生物素修饰光纤：将步骤3制备的氨基光纤放入步骤4制备的脱硫生 物素溶液中室溫反应12小时，反复洗涂光纤，氮气吹干，4°C保存备用。
[0018] 在本发明进一步优选的实施方案中，在向仪器内安装光纤，准备首次使用脱硫生 物素修饰光纤前，用含Img/mlBSA的PBS缓冲液封闭处理1小时。
[0019] 在本发明优选的实施方案中，合成DNA-蛋白质缀合物的步骤为：
[0020] 1、制备活化的琉基DNA:在10微升ImMSH-DNA-切5. 5溶液中加入5微升抑值 为5. 5的1M憐酸钢缓冲液和1微升50mMTCEP溶液，混合液避光室溫反应1小时，用 Amicon-lOK加入200微升抑值为7. 2的憐酸缓冲液，12000巧m离屯、10分钟，重复10次， 得到活化的琉基DNA。
[0021] 2、制备活化的链霉亲和素蛋白：在150微升20mg/mL的链霉亲和素溶液中加入 0. 5mgSulfo-SMCC，縱满震荡5分钟，室溫反应1小时，用Amicon-50k离屯、除去未溶解的 Sulfo-SMCC，每次加入200微升抑值为7. 2的憐酸缓冲液，于1200化pm离屯、10分钟，重复 10次，得到活化的链霉亲和素蛋白。
[0022] 3、制备DNA-链霉亲和素蛋白缀合物浓缩液：混合步骤1制备的活化的琉基DNA和 步骤2制备的活化的链霉亲和素蛋白，避光室溫放置48小时，用Amicon-50k过滤，每次加 入200微升抑值为7. 2的憐酸缓冲液，于1200化pm离屯、10分钟，重复10次，得到纯化的 DNA-链霉亲和素蛋白缀合物浓缩液。
[0023] 4、制备DNA-链霉亲和素蛋白缀合物储备液：20倍稀释步骤3制备的DNA-链霉亲 和素蛋白缀合物浓缩液，避光4°C保存待用。
[0024] 在本发明进一步优选的实施方案中，抑值为7. 2的憐酸缓冲液含有0. 1M的憐酸 钢和0. 15M的氯化钢。
[0025] 在本发明优选的实施方案中，检测隶离子浓度的步骤为： 阳026] 1、配置隶离子储备液：分别配置浓度为0. 01μg/mL、0. 1μg/mL、lμg/mL和 10μg/mL的隶离子浓度梯度储备液。
[0027] 2、隶离子浓度的检测：W抑值为7. 5的M(PS缓冲液（lOmMMOPS, 0. 5MNaN03,） 为反应液，向450微升反应液中加入2微升DM-链霉亲和素蛋白缀合物储备液W及不同浓 度的隶离子梯度储备液，室溫下反应1小时，将反应后的液体通入倏逝波光纤传感平台，用 MCPS缓冲液冲洗光纤直至基线平稳，通入与隶离子反应后的液体，开启蠕动累，进样15秒， 停止蠕动累，使待测液反应90秒后，开启蠕动累，通入洗脱液，通入MCPS缓冲液，至基线平 稳，停止采样，保存数据。
[0028] 本发明再一方面提供了本发明所述的DNA-蛋白质缀合物在检测隶离子浓度中的 应用。
[0029]与现有检测隶离子浓度的方法相比，本发明的方法具有经济、简便和快速的优点， 具有重要的社会和经济意义。
【附图说明】
[0030] 图1为本发明基于FRET作用的"DNA-蛋白质"缀合物对隶离子识别示意图。
[0031] 图2为本发明光纤表面修饰脱硫生物素的示意图。
[0032] 图3为本发明在倏逝场内检测缀合物巧光强度的示意图。
[003引图4为本发明DNA-链霉亲和素-巧光标记物缀合体合成方法示意图。
[0034] 图5为本发明对隶离子的检测标准曲线。
[0035] 图6为本发明对隶离子的检测选择性柱状图。
【具体实施方式】
[0036] 下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本 发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可W对本发 明进行若干改进和修饰，运些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。
[0037] 本发明所使用的缩写的含义列于下表中。
[0038]
[0039] 实施例1脱硫生物素修饰光纤的制备
[0040] 1、光纤预处理
[0041] 将光纤放入装有pir址a溶液（浓H2S〇4:H2〇2(v/v) = 3:1)的比色管中，于120°C 加热1小时，加热后，用超纯水充分洗涂光纤10次W上，并在室溫下用氮气吹干光纤，放于 70°C真空干燥箱中过夜。
[0042] 2、APTS-光纤的制备
[0043] 次日用无水甲苯配制2% (体积比）的（3-氨基丙基）Ξ乙氧基硅烷（APT巧溶 液，并将洁净的光纤放入该溶液中反应一小时；之后用甲苯冲洗5次，并用氮气吹干光纤， 放于200°C烘烤1小时。
[0044] 3、氨基-光纤的制备
[0045]自然降溫后，用2. 5%的戊二醒的乙醇溶液浸没光纤，于室溫反应1小时，并