杏鲍菇复合群est-ssr分子标记特异引物体系及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，具体设及杏鲍茹复合群EST-SSR分子标记特异 引物体系及其在鉴别杏鲍茹复合群的不同菌株的用途。 技术背景
[0002] 杏鲍茹（WeyrWwferjT?知i)，又名刺芹侧耳，因其具有杏仁的香味和菌肉肥厚如 鲍鱼的口感而得名。是近年来开发栽培成功的及食用、药用、食疗于一体的珍稀食用菌新品 种。阿魏茹（Wwro加S/eru知6)又名阿魏侧耳、阿魏磨，属担子菌亚口层菌纲伞菌目侧耳 科侧耳属，是干旱草原上具有代表性的葦菌。由于其子实体脆嫩可口，香味浓郁，有草原牛 肝菌的美称；又因其具有消积、杀虫、治疗肉积、瘡块、久追、巧劳等药效，当地群众誉之为天 山神茹和西天白灵芝。白灵茹（Weyroi化erjT?知i沉/的0. 是白灵侧耳的商 品名称，隶属于真菌口、担子菌亚Π、真菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属，是近年来逐渐发展起 来的食用菌新秀之一。
[0003] 杏鲍茹、白灵茹、阿魏茹形态相似，且遗传关系尚不明确。有研究人员认为，阿魏磨 与白灵茹为刺芹侧耳种下的2个变种，但也有人认为，运Ξ者分别为不同的种。白灵茹与阿 魏磨在外观和口感上均很接近，人们易将两者混淆。但实际上它们是亲缘关系非常近的两 个种。利用PCR产物克隆测序测定了阿魏茹、白灵茹与杏鲍茹rDNA内转录间隔区（口巧 的序列，测序比对结果表明，阿魏磨、白灵茹和杏鲍茹Ξ者之间亲缘关系较近，其中白灵茹 与杏鲍茹具有非常近的亲缘关系，但阿魏磨、白灵茹和杏鲍茹为3个不同的种。因此，本发 明中暂称Ξ个菌种为杏鲍茹复合群。
[0004] 食用菌最早是采用形态学特征为分类依据，虽然形态特征能在一定程度上进行很 好的类群的划分，但子实体的形态特征易受外界环境条件的影响，因而很不稳定。因此，形 态鉴别不能准确反映被鉴定物种的分类地位。除了形态学分类外，还有利用括抗试验、同工 酶分析来进行菌株的鉴定，但是他们都各自有一些缺点，受影响的因素很多，还需要辅助其 他试验才能将菌株鉴别清楚。
[0005] 近年来，随着分子生物学和生物技术的迅速发展，遗传标记技术也得到了迅猛的 发展。目前，用于作物种质资源鉴定的分子标记主要有RFLP、RAPD、AFLP、SSR等，但对于核 屯、种质构建、基因性状鉴定、品种指纹图谱建库等研究，SSR分子标记是公认的最佳方法。开 发SSR标记主要有构建与筛选基因组文库法、微卫星富集法、省略筛库法和数据库捜索法 等。其中数据库捜索法，尤其是从表达序列标签巧ST)数据库中捜索，开发EST-SSR标记， 已经成为一种广为采用的方法。EST-SSR标记相对于基因组SSR标记而言，由于其来自于转 录谱，能够反映出转录区的差异，使EST-SSR标记可W直接与目标性状（如高产或多抗）相 联系，在分子标记辅助选择上具有更高的应用价值。
[0006] 针对食用菌的SSR分子标记引物系统比较少，目前国内外还没有针对杏鲍茹复合 群鉴定的专用EST-SSR分子标记特异引物，因此本发明对于杏鲍茹、白灵茹、阿魏茹及其复 合群的资源鉴定和开发利用具有重要意义。
[0007]
【发明内容】
[0008] 本发明针对现有技术的不足，提供杏鲍茹复合群EST-SSR分子标记特异引物体系 及其应用。
[0009] 杏鲍茹复合群EST-SSR分子标记特异引物体系，它包括：引物1、2、3、4和\或5; 引物 1:AAGAGACCGCAAACGAAATG CAAGGCGGGTGGTCTTAGTA引物 2:GAAAGCTCGCCATCAGACTC AGAAGAAGCCCGAAGAGAGC 引物 3:ATCGGATTCGTTGTCGGTAG CGGATTCCTCCTCTTCTTCC 引物 4:ATCTCACGTTGAGCAGGTCC ACCTATCACGAGCCGCATAC 引物日：TCCTCTATCTCGCCCATCAC GGGACAGCCTATTCGAGGAT 杏鲍茹复合群的不同菌株鉴定方法，它包括： 1) 提取杏鲍茹复合群菌种的基因组DNA; 2) W基因组DNA为模板，用上述引物体系进行扩增； 3) sequi-GenGT核酸电泳系统上进行聚丙締酷胺电泳分离，照相后统计条带，转换成 0-1数值，利用软件SPSS10. 0进行聚类分析。
[0010] 本发明提供了杏鲍茹复合群EST-SSR分子标记特异引物体系，它是采用5对分子 标记特异引物，在检测过程中同时使用，在30个杏鲍茹复合群菌种中有多态性，在30个杏 鲍茹复合群中进行的遗传多样性分析与侧耳属白灵茹、杏鲍茹和阿魏茹的分类常识相吻合 (图1)，是稳定存在的新标记，可W直接将本发明所提供的5对引物对应用于更多杏鲍茹复 合群上，进行种质资源和遗传多样性分析；5对分子标记特异引物均来自于杏鲍茹复合群 发育相关基因EST序列，为克隆杏鲍茹复合群发育相关基因、基因序列分析奠定了良好的 基础。
【附图说明】
[0011] 图1为基于5对SSR位点数据构建的30份杏鲍茹复合群UPGM聚类图。图中的 品种或种名后的字母代表杏鲍茹复合群菌种的类型。 【具体实施方式】[001引一、提取DNA (1)配制DNA提取缓冲液：2%CTAB，0. 1MTris，20mM邸TA，1. 4M化C1，P册.0 和DNA溶解缓冲液TE:10MmTris;1Mm邸TA;PH=8. 0。
[0013] (2)对上述30个杏鲍茹复合群菌株材料进行如下处理： 1)吸取5mlCTAB提取缓冲液置于65 °C水浴锅中预热，加0.1gPVP(去除酪类物 质）。
[0014] 2)分别称取0. 1g不同的杏鲍茹复合群菌株的菌丝体放入研鉢中，于液氮中迅速 研磨成粉并转入65 °C预热的DNA提取液中，颠倒离屯、管5-10次。（不要剧烈振荡，防止 DNA断裂）并放入65 °C水浴中30min,期间轻轻颠倒摇动几次。
[0015] 3) 4°C,10000巧m离屯、5min,吸取上清液并加其等体积氯仿/异戊醇（24 :1)轻 轻混匀，10000巧m离屯、10min。
[0016] 4)取上清液，用等体积苯酪/氯仿/异戊醇（25:24:1)反复抽提。
[0017] 5)加入1/10体积NaAc(3mol/L，抑5. 2)和2倍体积冷乙醇，轻轻颠倒离屯、管几 次后置于-20 °C冰箱中2h来沉淀DNA。
[0018] 6)取出于 4 °C，10000;rpm离屯、10min。
[0019] 7)用70 %乙醇洗涂沉淀。在超净工作台上将沉淀吹干。
[0020] 8)加100μ1TE缓冲液回溶DNA沉淀，同时加入2μ1RNase，置37 °C处理1 h。
[0021] 9)转入1.5ml离屯、管中，将总体系扩大后加入等体积的苯酪/氯仿/异戊醇 (25:24:1)和氯仿/异戊醇（24:1)分别抽提。
[002引 10)吸取上清，重新沉淀DNA，用70 %乙醇洗，吹干。
[0023] 11)加入100μ1的TE或去离子水回溶。取1-2μ1样品与1 %的琼脂糖凝胶 上电泳，检查样品DNA的质量。
[0024] (3)将杏鲍茹、白灵茹、阿魏茹不同发育时期的材料进行转录组测序分析，筛选得 到40对EST-SSR引物，具体见表2。
[00巧]W步骤（2)提取的待鉴定样品总DM为模板DM,w筛选后得到40对特异引物为 检测体系引物：EST-SSR标记引物1-40,进行PCR扩增，PCR采用20μ1反应体系： 在 20μ1 反应体系中分另〇加入 10XPCRbuffer(Mg2+)2μl，2mMdNTP0. 2μ1，5UTaq DMpolymerase0. 1μ1，正向引物0. 1μ1，反向引物0. 5μ1，巧光标识引物0. 4μ1，50ng/μ1DM模板2μΚΡΟ?反应程序为：94°C预变性5min后进入循环；94 °C变性30s，60°C 复性45s，72°C延伸1min,反应进行35个循环；72°C后延伸lOmin。
[0026] (4)将步骤（3)PCR扩增后的产物与上样缓冲液（98%的去离子甲酯胺10Mm邸ΤΑ (Ρ册.0)，0. 025%二甲苯青，0. 025%嗅酪兰）混合均匀后，取2μ1点样，在Sequi-GenGT核 酸电泳系统度I〇-Rad，USA)中通过6%聚丙締酷胺凝胶进行电泳分离，电极缓冲液为1XTBE 灯riS-棚酸），在25 °C、2000V恒压下电泳2h。
[0027] 通过银染法显影，拍照、记录结果，银染法具体步骤如下： 1、 电泳完毕后，胶板用10%醋酸溶液缓慢摇动并固定15分钟，然后用去离子水漂洗3 次； 2、 将漂洗后的胶板用含有0.Iw/v硝酸银和0. 15%甲醒的溶液染色30分钟； 3、 染色后，用去离子水漂洗胶板2-3次，然后用含有3%碳酸钢和0. 15%甲醒的溶液染 色3-5分钟，缓慢摇动，直到条带清晰；然后放入10%醋酸溶液固定10分钟，然后用去离子 水漂洗5-10分钟，惊干，照相记录。
[0028] 利用40对EST-SSR引物对30个杏鲍茹复合群品种的DNA进行扩增，并利用6% 聚丙締酷胺凝胶电泳后银染检测。发现其中的5对EST-SSR引物（即本发明所述标记SEQ IDNO 其序列特征如表2所示）在30个不同的杏鲍茹复合群菌种上表现多态性，将 30个菌株利用5对EST-SSR引物进行聚丙締酷胺电泳后得到的多态性条带转换成0-1数 值(有条带记为1，无条带记为0)，将得到的0-1数值表录入excel表中，利用生物统计软件 SPSS10. 0将之前统计的数值进行0-1型变量聚类分析，得到30个不同的杏鲍茹复合群菌株 的UPGMA聚类图，聚类得到的树状图表明运5对EST-SSR引物可W将30个不同的杏鲍茹复 合群分为杏鲍茹、白灵茹和阿魏茹Ξ大类讨目应的菌株信息及编号见表1)，运种分类结果与 杏鲍茹复合群的形态学分类相符合(供试的30个菌株已经进行了出茹试验，并通过形态学 进行了鉴定，分别为10株杏鲍茹，10株白灵茹，10株阿魏茹)，而且通过树形聚类图也可W 看出，分属杏鲍茹、白灵茹和阿魏茹的各个菌株均能够区分开(相同的菌株会聚类到一起)， 说明运5对EST-SSR引物能够用于杏鲍茹、白灵茹、阿魏茹及其复合群的种质资源鉴定，并 可用于杏鲍茹复合群种质资源遗传多样性分析和亲缘关系研究中。
【主权项】
1. 杏鲍菇复合群EST-SSR分子标记特异引物体系，它包括：引物1、2、3、4和\或5; 引物 1:AAGAGACCGCAAACGAAATG; CAAGGCGGGTGGTCTTAGTA； 引物 2:GAAAGCTCGCCATCAGACTC; AGAAGAAGCCCGAAGAGAGC； 引物 3:ATCGGATTCGTTGTCGGTAG; CGGATTCCTCCTCTTCTTCC； 引物 4:ATCTCACGTTGAGCAGGTCC; ACCTATCACGAGCCGCATAC； 引物 5:TCCTCTATCTCGCCCATCAC; GGGACAGCCTATTCGAGGAT〇2. 杏鲍菇复合群的不同菌株鉴定方法，它包括： 1) 提取杏鲍菇复合群菌种的基因组DNA; 2) 以基因组DNA为模板，用权利要求1所述的引物体系进行扩增； 3. sequi-GenGT核酸电泳系统上进行聚丙稀酰胺电泳分离，照相后统计条带，转换成 0-1数值，利用软件SPSS10. 0进行聚类分析。
【专利摘要】本发明公开了杏鲍菇复合群EST-SSR分子标记特异引物体系，它是采用5对分子标记特异引物，在检测过程中同时使用，在30个杏鲍菇复合群菌种中有多态性，在30个杏鲍菇复合群中进行的遗传多样性分析与侧耳属白灵菇、杏鲍菇和阿魏菇的分类常识相吻合，是稳定存在的新标记，可以直接将本发明所提供的5对引物对应用于更多杏鲍菇复合群上，进行种质资源和遗传多样性分析，5对分子标记特异引物均来自于杏鲍菇复合群发育相关基因EST序列，为克隆杏鲍菇复合群发育相关基因、基因序列分析奠定了良好的基础，并且大大缩短了分析周期，提高研究效率，对食用菌分子标记选择育种的发展具有重要意义。
【IPC分类】C12R1/645, C12N15/11, C12Q1/04, C12Q1/68
【公开号】CN105256050
【申请号】CN201510763415
【发明人】宋冰, 付永平, 李玉, 苏文英, 代月婷, 郭昱秀, 王新新, 段明政, 李丹, 李长田, 杜鹃, 杨洋, 刘源
【申请人】吉林农业大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年11月11日