Khdc1l基因作为疾病诊断标志物的用图
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，具体地设及人KHDC1L基因在骨关节炎的诊断、治疗中 的用途。
【背景技术】
[0002] 中国已逐步跨入了老龄化社会，0A对人体健康的影响程度W及所造成的医疗费用 正在W惊人的速度逐年增长。有资料显示，60岁W上的人口中50%的人群在X线片上有0A 的表现，其中35 %~50 %有临床症状，在75岁W上的人群中80%W上有0A的症状，运是一 个非常可怕的比例。现在，0A已经成为仅次于屯、脏病使患者丧失工作能力的第二位主要疾 病，给家庭和社会带来沉重的经济负担，从而引起国内外专业人±的广泛关注。
[0003] 目前，骨关节炎诊治指南中关于0A的定义如下：0A指由多种因素引起关节软骨纤 维化、薇裂、溃瘍、脱失而导致的关节疾病。病因尚不明确，其发生与年龄、肥胖、炎症、创伤 及遗传因素等有关。其病理特点为关节软骨变性破坏、软骨下骨硬化或囊性变、关节边缘骨 质增生、滑膜增生、关节囊李缩、初带松弛或李缩、肌肉萎缩无力等。W中老年患者多见，女 性多于男性。该病的致残率可高达53%。0A好发于负重大、活动多的关节，如膝、脊柱（颈 椎和腰椎）、髓、踩、手等关节，与遗传和体质因素有一定的关系。
[0004] 0A初期阶段是没有明显症状的，可能只是伴随着间歇性的关节疼痛及压痛或者关 节僵硬、关节无力、活动障碍等现象，很多人抱着饶幸屯、理，认为既然没有影响到日常生活， 就算不上大病。但是随着病情发展严重后果而导致关节功能丧失的时候，就很可能致残。对 此，临床上一直的主张都是早诊断、早预防、早治疗。
【发明内容】
[0005] 为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于骨关节炎 (Osterart虹itis，0A)早期诊断的分子标志物。相比传统的骨关节炎的诊断方法，使用基 因标志物来诊断骨关节炎的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知 晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 本发明提供了检测KHDC1L基因表达的产品在制备诊断骨关节炎的工具中的应 用。
[0008] 进一步，所述检测KHDC1L基因表达的产品包括检测KHDC1L基因mRNA水平的产 品、和/或检测KHDC1L蛋白水平的产品。
[0009] 进一步，所述检测KHDC1L基因表达的产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫 检测、原位杂交或忍片检测KHDC1L基因表达W诊断骨关节炎的产品。
[0010] 进一步，所述用RT-PCR诊断骨关节炎的产品至少包括一对特异扩增KHDC1L基因 的引物；所述用实时定量PCR诊断骨关节炎的产品至少包括一对特异扩增KHDC1L基因的引 物；所述用免疫检测诊断骨关节炎的产品包括：与KHDC1L蛋白特异性结合的抗体；所述用 原位杂交诊断骨关节炎的产品包括：与KHDCIL基因的核酸序列杂交的探针；所述用忍片诊 断骨关节炎的产品包括：蛋白忍片和基因忍片；其中，蛋白忍片包括与KHDC1L蛋白特异性 结合的抗体，基因忍片包括与KHDC1L基因的核酸序列杂交的探针。
[0011] 所述用实时定量PCR诊断骨关节炎的产品至少包括的一对特异扩增KHDC1L基因 的引物如沈QIDNO. 3和沈QIDNO. 4所示。
[0012] 所述检测KHDCIL基因表达的产品可W是检测KHDCIL基因表达的试剂、也可W是 包含所述试剂的试剂盒、忍片、试纸等，也可W是使用所述试剂的高通量测序平台。
[0013] 所述诊断骨关节炎的工具包括但不限于忍片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台； 高通量测序平台是一种特殊的诊断骨关节炎的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个 人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达 谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知KHDC1L基因的异 常与骨关节炎相关也属于KHDC1L基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
[0014] 本发明还提供了一种诊断骨关节炎的工具，所述工具包括检测KHDC1L基因表达 的试剂；所述试剂包括检测KHDC1L基因mRNA的引物和/或探针、检测KHDC1L蛋白的抗体。
[0015] 所述工具包括但不限于忍片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。
[0016] 其中，所述忍片包括基因忍片、蛋白质忍片；所述基因忍片包括固相载体W及固 定在固相载体的寡核巧酸探针，所述寡核巧酸探针包括用于检测KHDC1L基因转录水平的 针对KHDC1L基因的寡核巧酸探针；所述蛋白质忍片包括固相载体W及固定在固相载体的 KHDC1L蛋白的特异性抗体；所述基因忍片可用于检测包括KHDC1L基因在内的多个基因 (例如，与骨关节炎相关的多个基因）的表达水平。所述蛋白质忍片可用于检测包括KHDC1L 蛋白在内的多个蛋白质（例如与骨关节炎相关的多个蛋白质）的表达水平。通过将多个与 骨关节炎的标志物同时检测，可大大提高骨关节炎诊断的准确率。
[0017] 其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试 剂盒包括用于检测KHDC1L基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括KHDC1L蛋 白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或 忍片方法检测KHDC1L基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对KHDC1L 基因的引物和/或探针。根据KHDC1L基因的核巧酸序列信息容易设计出可W用于检测 KHDC1L基因表达水平的引物和探针。
[001引所述试纸包括检测KHDC1L基因表达的试剂。
[0019] 所述高通量测序平台包括检测KHDC1L基因表达的试剂。
[0020] 与KHDC1L基因的核酸序列杂交的探针可W是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或 其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核巧酸序列特异性结 合，任何长度都可W。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述 探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针 长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最 长一般不超过30个碱基对，与目的核巧酸序列互补的长度W15-25个碱基对最佳。所述探 针自身互补序列最好少于4个碱基对，W免影响杂交效率。
[0021] 进一步，所述KHDC1L蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述 KHDC1L蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰（例如，，嵌合抗 体、scFv、F油、F(油'）2、Fv等。只要所述片段能够保留与KHDCIL蛋白的结合能力即可。用 于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可W使用任何方法来制 备所述抗体。 阳02引在本发明的具体实施方案中，所述检测KHDC1L基因mRNA的引物包括SEQIDNO. 3 和SEQIDNO. 4所示的引物对。
[0023] 本发明还提供了KHDCIL基因和/或其表达产物的抑制剂在制备治疗骨关节炎的 药物中的应用。所述抑制剂包括抑制KHDC1L基因表达的试剂、和/或抑制KHDC1L基因表 达产物的试剂。
[0024] 进一步，所述抑制KHDCIL基因表达的试剂包括抑制基因转录的试剂、抑制基因翻 译的试剂；所述抑制KHDCIL基因表达产物的试剂包括抑制KHDCIL基因mRNA的试剂、抑制 KHDCIL蛋白的试剂。所述抑制KHDCIL基因mRNA的试剂包括抑制mRNA稳定性的试剂、抑制 mRNA翻译活性的试剂。所述抑制KHDCIL蛋白的试剂包括抑制KHDCIL蛋白稳定性的试剂、 抑制KHDCIL蛋白活性的试剂、抑制KHDCIL蛋白功能的试剂。 阳0巧]进一步，抑制KHDCIL基因mRNA的试剂包括针对KHDCIL基因mRNA的双链核糖核 酸；抑制KHDCIL蛋白功能的试剂包括KHDCIL抗原蛋白的肿瘤疫苗、抑制KHDCIL蛋白功能 的抗体。所述抗体可W是多克隆抗体，或是单克隆抗体。 W26] 在本发明的具体实施方案中，所述针对KHDCIL基因mRNA的双链核糖核酸 是siRNA。为了确保KHDCIL基因能够被高效剔除或沉默，根据KHDCIL基因的mRNA序 列设计了siRNA特异性片段。siRNA的设计根据已发表的通用设计原则巧化ashir et.al 2001，Schwarz et.al 2003，趾vor