专利名称：一个新的食管癌标志基因cagr1及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种食管癌诊断标志基因CAGR1(如GenBank中NT_024524.13第17,031,188～17,027,940bp所示，或者如SEQ ID NO1所示)用于检测食管癌的用途。具体的，基因CAGR1的缺失可以作为食管癌早期诊断标志；作为食管癌预警的标志；作为食管癌预后判断的标志以及作为食管癌治疗监测的标志，其中测试样品中含有该基因缺失的细胞数量的减少指示良好的治疗效果。
背景技术：
利用分子生物学技术，能够有效地进行分子水平检测和/或诊断疾病，进而为早期治疗这些疾病提供便利。
食管癌是最常见的消化道肿瘤之一，其死亡率位于我国十大恶性肿瘤的第四位。肿瘤形成是涉及癌基因激活与抑癌基因失活的多阶段、多步骤过程。在食管鳞癌经常观察到13号染色体长臂上频繁出现杂合性丢失(Aoki et al.，1994；Shibagaki et al.，1994；Harada et al.，1999；Hu et al.，1999 and 2000；Chen et al.，2001；Li et al.，2001；Roth et al.，2001)。
目前已经发现D13S267和D13S220座位在食管鳞癌的杂合性丢失频率较高(Huang et al.，2002)，这两个微卫星标志相距大约0.9Mb。CAGR1基因位于D13S220的旁侧，定位于染色体13q13。该基因仅含有一个外显子，其mRNA全长2,465bp。CAGR1是线虫细胞命运决定基因(Caenorhabditis elegans cell fate determining gene)mab21的人类同源序列，其5’非翻译区含有一个高度多态的CAG重复序列，重复范围为6至31次(Margolis et al.，1996)。在线虫中，mab21突变导致神经元和上皮细胞发育障碍，结果造成形态发育和行为的异常(Chow et al.，1995)。CAGR1基因被认为是在人类神经疾病中与发育异常相关的一个候选基因(Potter et al，1997)。然而，尚未见报道CAGR1的变化与食管癌之间的关系。
本发明人运用CAGR1基因内多态性标志在基因组DNA水平和转录水平对我国食管鳞癌进行了研究，出人意料的发现，CAGR1的分子内三核苷酸多态重复序列在食管癌具有高频率的杂合性丢失，即一个等位基因缺失。而且，在高比例的肿瘤组织中，同时出现CAGR1基因组DNA水平的杂合性丢失和表达水平的下调。特别重要的是，在食管原位癌和不典型增生的食管组织也发现CAGR1的杂合性丢失。因此，该基因的缺失可以作为一个很好的食管癌诊断标志。本发明人出人意料的发现，CAGR1的分子内三核苷酸多态重复序列在食管癌具有高频率的杂合性丢失，即一个等位基因缺失。而且，在高比例的肿瘤组织中，同时出现CAGR1基因组DNA水平的杂合性丢失和表达水平的下调。特别重要的是，在食管原位癌和不典型增生的食管组织也发现CAGR1的杂合性丢失。因此，该基因的缺失可以作为一个很好的食管癌诊断标志。
发明内容
本发明的一个方面涉及新的食管癌诊断标志CAGR1基因或其片段用于检测食管癌的用途。具体的，基因CAGR1的缺失可以作为食管癌早期诊断标志。另一方面，基因CAGR1的缺失还可以作为食管癌预警的标志。食管上皮不典型增生被公认为食管癌前病变。然而不典型增生是一种可逆状态，一部分患者在数月至数年后又恢复正常，而另一部分患者数月至数年后发展为癌。在不典型增生食管上皮检测发现该基因的缺失时，指示将可能发生食管癌，有利于受试者采取适当的预防措施。再一方面，基因CAGR1的缺失还可以作为食管癌预后判断的标志该基因的缺失指示某种特定临床表型。此外，基因CAGR1的缺失可以作为食管癌治疗监测的标志，其中测试样品中含有该基因缺失的细胞数量的减少指示良好的治疗效果。
本发明所述食管癌诊断标志CAGR1，包括所述基因的全长DNA序列(如GenBank中NT_024524.13第17,031,188～17,027,940bp所示)和cDNA序列(如SEQ ID NO1所示)及其片段，和与所述基因或其片段有高度序列相似性的功能性类似物。
在本发明中，所述基因序列的片段长度选自GenBank中NT_024524.13第17,031,188～17,027,940bp所示和SEQ ID NO1所示序列的至少20个连续碱基，优选至少30个碱基，更优选为50个碱基。
在本发明中，所述具有高度序列相似性的功能性类似物是指与如GenBank中NT_024524.13第17,031,188～17,027,940bp所示序列或SEQ ID NO1所述序列具有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，甚至更优选至少85％，特别优选至少90％，甚至最优选至少95％，甚至最特别优选至少98％序列相似性的那些类似物。
利用所述CAGR1基因或其片段或其类似物可以用于鉴定相应于全长转录物的cDNA克隆或具有完整基因，包括调节和启动子区域、外显子及内含子的基因组克隆，用于筛选受试者待测样品，以确定其中否存在能够与之杂交的成分，从而作为检测与CAGR1相关的食管癌疾病或对食管癌的易感性的判定标志。
本发明也涉及用于检测各种组织中CAGR1基因的mRNA的诊断方法。在本发明所述方法中，测定样品中CAGR1基因在DNA和/或mRNA水平的变化可用选自PCR、逆转录PCR(RT-PCR)、Southern印迹、Northern印迹、点杂交以及DNA或RNA原位杂交等方法进行检测。这些方法对于本领域的技术人员也为常规操作。
本发明另一方面涉及利用所述食管癌诊断标志CAGR1或其片段检测食管癌的方法。
在本发明的一个具体实施方案中，采用PCR方法检测待测样品中是否存在CAGR1基因缺失，包括如下步骤；1)常规方法提取患者外周血和待查组织DNA；2)利用根据CAGR1基因序列设计的引物进行PCR扩增；
3)取2微升PCR产物进行7％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；4)分析电泳结果如果某个体外周血CAGR1基因内多态性标志的一对等位片段的PCR产物长度不同，在变性聚丙烯酰胺凝胶上呈现两条带，该个体即为信息个体。当待测组织的一个等位条带减弱50％或50％以上，表明此组织发生了一个CAGR1等位基因的缺失。
图1.CAGR1在食管癌患者外周血(N)及肿瘤组织(T)分析的部分电泳结果。
本发明将在下面的实施例中进一步描述。但是本发明并不局限于这些实施例。
实施例一检测CAGR1基因缺失的方法1)常规方法提取受试者外周血和待查组织DNA[分子克隆实验指南(第二版)，J.萨姆布鲁克，等人，冷泉港实验室出版社，1989]；2)采用引物R1和R2按以下条件进行PCR扩增R15’GAT AAA AGG AAG GGA AAA 3’(SEQ ID NO2)R25’CAG AAA TGG ATC AAA AAT 3’(SEQ ID NO3)PCR反应体系基因组DNA 1.0μl(40ng)10×PCR缓冲液[100mM Tris-HCl(pH8.3)，500mM KCl]2.0μl25mM MgCl21.2μl2.5mM dNTP 1.0μl上游引物(10μM) 1.0μl下游引物(10μM) 1.0μl去离子甲酰胺0.5μlTaq酶(10u/μl) 0.2μl
双蒸水 12.1μl总反应体积 20.0μlPCR反应程序步骤1 94℃5分钟步骤2 94℃30秒步骤3 52℃30秒步骤4 72℃30秒步骤5 72℃5分钟步骤6 4℃其中从步骤2至步骤4持续35个循环。
3)取2微升PCR产物进行7％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；4)对电泳结果进行分析如果某个体外周血CAGR1基因内多态性标志的一对等位片段的PCR产物长度不同，在变性聚丙烯酰胺凝胶上呈现两条带，该个体即为信息个体。当待测组织的一个等位条带减弱50％或50％以上，表明此组织发生了一个CAGR1等位基因的缺失。
上述实验结果显示，获自患有食管癌患者的外周血与肿瘤组织中的样品经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳证实，肿瘤组织中存在一个明显减弱甚至完全丢失的CAGR1基因条带(参见图1)。
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本工作受国家高技术研究发展计划基金(2001AA221151)、国家科技攻关计划基金(2002BA711A06)、国家杰出青年科学基金(30125026)和国家重点基础研究发展规划基金(G1998051205)资助。
序列表<110>中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所<120>一个新的食管癌标志基因CAGR1及其用途<130>IDC030074<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2465<212>DNA<213>cDNA<400>1gcacactcac cccggacaca cactcagcac acttttcctc catttgatta acagtgctgc 60acacacaatg attacgggaa agcgcaaata aatacggaaa ggggtgctta ttttgactac120tggaagagct ttgctgggtc tcagcgcaac ttttgttttt tattcctgag aaggtgatct180ctccatgcgg ttctctcaca caaggattct ttaaaagagg aagagagaca agcagagggg240ggaggacagt ctttcacttt aagaacggct gggctcaaag ataaaaggaa gggaaaagca300gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca360gggaaaccaa cgctgcagca cttccgaaag gcatttttga tccatttctg agtgttgcgg420cccgtttctc caccgaagtt ggctccagct ctagcagccg cattggatcc cacagcttac480tgcgagactc cggtgtacaa tccggatctc tgccccaaca tgattgcggc ccaggccaag540ctggtctacc atctgaataa atactacaac gaaaaatgcc aagccaggaa agctgccatt600gccaaaacta tccgggaagt ctgcaaagta gtttccgacg tactgaagga agtggaagtg660caggagccgc ggttcatcag ctctctcaac gagatggaca atcgctacga gggcctcgag720gtcatctccc ccaccgaatt tgaagtggtg ctttatctca accaaatggg ggtgttcaac780ttcgtggacg atggctcact gcccggctgc gcggtgctga agttgagcga cgggcgcaag840aggagcatgt ccctctgggt ggaattcatt accgcctccg gctacctctc ggcgcgcaaa900atccggtcca ggtttcagac gctggtggct caagcggtag acaaatgtag ctaccgggat960gtggtaaaga tggtggcaga caccagcgaa gtgaaactga gaatccgaga taggtacgtg 1020
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权利要求
1.食管癌诊断标志基因CAGR1或其片段或与之具有高度序列相似性的功能类似物用于诊断食管癌的用途。
2.权利要求1所述的用途，其中所述CAGR1基因的片段是指长度选自如GenBank中NT_024524.13第17,031,188～17,027,940bp所示序列和SEQ ID NO1所示序列的至少20个连续碱基，优选至少30个碱基，更优选为50个碱基的序列片段；所述高度序列相似性的功能类似物是指与GenBank中NT_024524.13第17,031,188～17,027,940bp所示序列和SEQ ID NO1所述序列具有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，甚至更优选至少85％，特别优选至少90％，甚至最优选至少95％，甚至最特别优选至少98％序列相似性的那些类似物。
3.权利要求1所述的用途，其中基因CAGR1的缺失可以作为食管癌早期诊断标志，食管癌预警的标志，食管癌预后判断的标志以及食管癌治疗监测的标志。
4.一种测定待测样品中CAGR1基因在DNA和/或mRNA水平的变化的方法，包括如下步骤；1)提取受试者正常组织如外周血和待查样品的DNA或mRNA；2)根据选自PCR、逆转录PCR(RT-PCR)、Southern印迹、Northern印迹、点杂交以及DNA或RNA原位杂交的方法设计引物；3)采用2)所述方法检测待测样品；4)当与正常组织相比，判定待测样品中CAGR1等位基因的变化。
全文摘要
本发明涉及一种食管癌诊断标志基因CAGR1(如GenBank中NT_024524.13第17,031,188～17,027,940bp所示序列和SEQ ID NO1所示)用于检测食管癌的用途。具体的，基因CAGR1的缺失可以作为食管癌早期诊断标志；作为食管癌预警的标志；作为食管癌预后判断的标志以及作为食管癌治疗监测的标志，其中测试样品中含有该基因缺失的细胞数量的减少指示良好的治疗效果。
文档编号C12Q1/68GK1618986SQ20031011536
公开日2005年5月25日 申请日期2003年11月21日 优先权日2003年11月21日
发明者王明荣, 徐昕, 蔡岩, 黄晓平, 赵春霞, 韩亚玲, 吴旻 申请人:中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所