周期型马来丝虫m29表位基因dna疫苗的用图
【专利摘要】本发明公开了一种周期型马来丝虫M29表位基因DNA疫苗的用途，以我国流行的周期型马来丝虫为研究对象，扩增马来丝虫myosin基因片段，构建了周期型马来丝虫myosin真核表达重组质粒。根据测序结果分析，推测其氨基酸序列，然后利用相关的软件预测它们的B细胞表位和T细胞表位，制备出周期型马来丝虫肌球蛋白表位基因疫苗。将该疫苗免疫接种BALB/c小鼠，并检测其疫苗的体液免疫和细胞免疫的应答效果。试验结果证明了该疫苗可诱导小鼠产生特异性的免疫应答反应，取得满意效果，制备周期型马来丝虫肌球蛋白表位基因疫苗获得成功。
【专利说明】周期型马来丝虫M29表位基因 DNA疫苗的用途
[0001 ] 本申请是申请号：201410564361.9、申请日2014.10.21、名称"周期型马来丝虫M29 表位基因 DNA疫苗的制备方法"的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及一种周期型马来丝虫M29表位基因 DNA疫苗的制备方法。
【背景技术】
[0003] 淋巴丝虫病是全球最古老的疾病之一。据埃及开罗博物馆展示的4000年前的古埃 及法老塑像，显示患有右下肢象皮肿，即为该病典型临床表现之一。据WHO报告，全球有83个 国家和地区共有淋巴丝虫感染者约1.2亿，其中班氏丝虫病约1.07亿，马来丝虫病和帝汶丝 虫病共约1300万。这些感染者中约4400万有淋巴丝虫病的临床表现，约7600万为微丝蝴血 症者。估计全球有受威胁人口超过11亿，约占世界总人口的20%。我国曾是全球淋巴丝虫病 流行最严重的国家之一，受威胁人口达3.3亿。虽然丝虫病的防治在全球范围内取得了巨大 的成绩，但由于气候变暖等自然、生物和社会以及淋巴丝虫的夜现周期性和微丝蝴血症者 多无临床症状等诸多因素的广泛存在，近年来在一些国家和地区出现疫情复燃和蔓延的趋 势，丝虫病的流行不仅给人民的健康带来严重危害，也成为因病致贫的重要原因之一。最新 研究报道表明，感染者残存传染源的微丝蝴血症可持续20年以上，中等密度和较高密度微 丝蝴血症者具有传播丝虫病的作用。所以后期的监控与防治任务仍很艰巨。
[0004] 在我国流行的主要是班氏丝虫和马来丝虫。后者生活史较复杂，主要包括幼虫在 蚊体内和成虫在人体内的发育过程，此外还可在人体以外的多种脊椎动物体内发育成熟。 淋巴丝虫病可导致患者永久或长期致残，被WHO列为世界第二大致残病凶。寻找控制丝虫病 疫苗的研究越来越受到人们重视。筛选有效的保护性抗原并有机结合以获得最佳保护效应 是疫苗研究的一个重要内容。肌球蛋白（myosin)是一种广泛存在于真核生物中的功能蛋 白，不仅存在于肌细胞中，而且在非肌细胞中也存在。它作为生物体的一种重要的收缩蛋白 质，在调节肌肉收缩和细胞重组等方面发挥着重要作用。有关寄生虫myosin的分子生物学 和免疫学方面的研究表明它是一种早期免疫显性分子，具有较显著的免疫原性，免疫动物 可产生较强的免疫保护作用。这也是研究者致力于myosin分子疫苗和药物研究的原因。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种方法简便、易操作，效果好的周期型马来丝虫M29表位 基因 DNA疫苗的制备方法。
[0006] 本发明的技术解决方案是：
[0007] 一种周期型马来丝虫M29表位基因 DNA疫苗的制备方法，其特征是:包括
[0008] 下列步骤：
[0009] ( -）引物设计
[0010] 根据GenBank中周期型马来丝虫肌球蛋白基因（的高度保守序列区，应用Primer Premier5.0软件设计引物，并分别引入Xho I/BamH I酶切位点，起始终止密码以及保护性 喊基；
[0011] Pl:上游5'-CC GGA TCC ATG AAA TGC AAA AAA T-3'
[0012] 下划线序列为BamH I酶切位点Tm = 56.84
[0013] P2:下游5'-CC CTC GAG ATG GTG AAC GGA GTA CG-3'
[0014] 下划线序列为Xho I酶切位点Tm = 66.90
[0015] (二)周期型马来丝虫虫体及微丝蝴的收集和总RNA的提取和测定
[0016] (1)将取自长爪沙鼠腹腔液的成虫及微丝蝴移入1.5ml匀浆器中，加入1mlTrizol 试剂研磨，室温静置5min;
[0017] (2)加入0.2ml氯仿，震荡15s后静置2min，4°C，12000rpm离心15min取上清；
[0018] (3)加入0.51111异丙醇混勾，室温静置1〇111；[11，4°0，12000印1]1离心1〇111；[11弃上清；
[0019] (4)加入1ml 75%乙醇混勾，4°C，9000rpm离心5min弃上清；
[0020] (5)干燥5min后溶于DEPC处理水30ul，60°C10min;
[0021] (6)取2ul总RNA稀释200倍，在紫外分光光度计上测0D260和0D280值，确定其浓度 和纯度，并进行甲醛电泳检测；
[0022] (三）cDNA的合成
[0023] (1)取总RNA 5ul，后加入IOmM dNTPmix lul，0.5ug/ul oligo(dT)12-18ul ,DEPC 处理水3ul，65°C加热5min，后冰浴5min;
[0024] (2)另取IOXBuffer 2ul，25mM MgC12 4ul，0.1M DTT 2ul,RNA酶抑制剂Iul混匀， 42°C 孵育 2min;
[0025] (3)将步骤(2)混合液加入步骤（I)物质中混匀，再加入Iul逆转录酶Superscript Π 混匀；42 °C孵育50min，70 °C 15min终止反应，-70 °C保存备用；
[0026] (四）PCR 扩增 Bm-myosin 基因
[0027] Ρ1 = 56·84，Ρ2 = 66·90,反应体系cDNA 1.5ul, 10XPCR Buffer 2.5ul，2.5mM dNTPmix 4.0ul，Pl P2各0.7ul，5U/ul TaqDNA聚合蛋白酶0.2ul，ddH20 15.4ul;混匀在DNA 扩增仪？1'〇100上进行？〇?;循环参数为：941€3111丨11，941€508,51 1€458,721€908，共33个循 环，最后一次循环72°C延伸反应时间为7min，4°C冷却终止反应；同时设立阴性对照。PCR产 物经1.0 %琼脂糖凝胶电泳鉴定；
[0028](五)Bm-myosin基因片段纯化和T载体的连接以及转化
[0029] (1)纯化Bm-myosin基因片段:取50ulPCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯 下切割含目的基因的凝胶，按胶回收试剂盒说明，纯化回收产物；
[0030] (2)感受态大肠杆菌的制备:大肠杆菌DH5a在新鲜LB琼脂平板上37 °C培养过夜;挑 取单菌落于3ml LB培养基中，37°C振荡过夜；取300ul菌液加入30ml LB培养基中，37°C 220rpm振荡4h,冰浴lh,后分装到1 · 5ml Eppendorf管4°C离，8000rpm 5min;弃上清，加入冰 浴0.1mol/L MgC12 IOOul悬浮，4°C离心，8000rpm 5min,弃上清，加入冰浴0.1mol/L CaCl2-10 %甘油溶液300ul悬浮，-70°C保存备用；
[0031] (3)Bm-myosin基因和pGEM-T载体的连接:取纯化的PCR产物3ul，2X快速连接缓冲 液5u I，pGEM - T载体 I u I，T4DNA连接酶 3we i s s /u I I u 1，共 I Ou 1 混匀，4 °C 连接20h;
[0032] (4).转化:取连接反应物IOul加入新鲜制备的大肠杆菌DH5a感受态细胞300ul混 匀，冰浴30min，42°C热休克90s，快速移至冰浴3min，加入200ul LB培养基，37°C孵育45min。 将培养物IOOul涂在含有X-gal，IPTG，Amp的1.5%琼脂平板上，倒置平板，37°C过夜培养； [0033](六）阳性重组克隆的筛选和鉴定
[0034] (1)阳性重组克隆的筛选:挑取生长状态好的白色菌斑，并提取质粒；
[0035] (2)PCR鉴定：以重组质粒Bm-myosin/pGEM-T为模板，用Bm-myosin的引物Pl、P2进 行PCR反应，反应体系25ul，Bm-myosin/pGEM-T重组质粒 1 · 5ul，10 X PCR Buffer 2 · 5ul， 2.5禮（1犯1311^叉4.〇111，？1、？2各0.7111，51]/111了39〇嫩聚合蛋白酶0.2111，(1(1!120 15.4111;循环 参数为:94°C3min，94°C50s，51°C45s，72°C90s，共33个循环，最后一次循环72°C延伸反应时 间为7min，4°C冷却终止反应;PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定；
[0036] (3)酶切鉴定:取经PCR鉴定正确的重组质粒，用BamH I与Xho I双酶切，用1.0%琼 脂糖凝胶电泳检测酶切片段；
[0037](七)Bm-MYOSIN二级结构预测
[0038] 分别应用EXPASY服务器上的SOPMA、GOR、nnPredi c、HNN方法以及EMBOSS程序分析 预测Bm-myosin的二级结构；
[0039](八)Bm-MYOSIN亲水性、表面可及性、抗原性、极性及柔韧性参数预测
[0040] 采用Hopp&Woods亲水性参数、Emini表面可及性参数、Jameson-Wo If抗原性参数、 Zimmerman极性参数和柔韧性参数预测；
[0041 ](九)Bm-MYOSIN T细胞表位预测
[0042] (1)人源HLA I类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入 Rankpep服务器，选择AA长度为9-mers，基因型为HLA-A0201、HLA-Al 101，预测HLA I类分子 结合肽，保留输出的结果；
[0043] (2)鼠源MHC I类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入 Rankp印服务器，选择AA长度为9 -mer s，基因型为H2 - d，包括H2 - Kd、H2 - Ld和H2 - Dd，为H2 - d型 小鼠表达的MHC I类分子;预测MHC I类分子结合肽，保留输出的结果；
[0044] (3)人源HLA Π 类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入 Rankpep服务器，选择基因型为HLA - DRB1 *0101、HLA - DRB1 *0 301、HLA - DRB1 *0 401、HLA - DRB1 * 0701、HLA-DRB1*0801、HLA-DRB1*0901、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB1*1301、HLA-DRB1*1501，预 测HLA Π 类分子结合肽，保留输出的结果；
[0045] (4)鼠源MHC Π 类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入 Rankpep服务器，选择选择基因型为Ι-AcUI-Ed，预测鼠源MHC Π 类分子结合肽，保留输出的 结果；
[0046](十)表位基因片段的选择
[0047] 根据B细胞表位预测和T细胞表位预测结果，选择富含抗原表位的基因片段562bp_ 1269bp设计引物，以质粒pcDNA3.1( + )-BmM55为模板，并将该片段克隆至原核表达载体pET-28a(+)中，构建pET-BmM29。应用Primer 5软件设计引物；
[0048] 上游Pl: 5，-GCGGATCCGCTAATGAATTGAATATGC-3，
[0049] 其中GGATCC为BamH I酶切位点；
[0050] 下游P2:5 ' - CGGAATTCCTATGGTGAACGGAGTACGGT [0051 ] 其中GAATTC为EcoR I酶切位点；
[0052] 引物使用前用ddH20溶解，浓度为1 Ομπιο I /L;
[0053] (十一)表位基因片段PCR扩增
[0054] (1)以pcDNA3.1( + ) - BmM55为模板，Pl、P2分别为上、下游引物，反应体系： 「mwl ργτ?*"·補 玄
[0060]取5μ1样品用1 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增目的基因；
[0061 ](十二）目的基因与载体连接与鉴定
[0062] A、PCR产物及pET_28a( + )载体质粒双酶切体系：
[0063]双酶切反应体系
[0065]目的基因与载体连接，具体反应体系：
[0066]目的基因与载体连接反应体系
[0068] 混匀，室温反应30min以上，产物用于转化；
[0069] B、E.coli DH5a感受态细胞的制备
[0070] (1)用接种环取保存于-80°CDH5a菌液，划菌于不含抗生素的LB平板上，37°C倒置 培养约14-16h至单菌落出现；
[0071] (2)挑单菌落至5ml无抗性的LB液，37 °C振荡培养约10-12h;
[0072] (3)取Iml过夜培养的菌液至含100mL无抗LB液中，37°C振荡培养约2-2.5h，到OD值 达 0.5,冰浴5-IOmin;
[0073] (4)分装到2个50ml预冷无菌的离心管，4°C，1600rpm离心7min;
[0074] (5)用IOml冰冷的0.1M CaC12溶液重悬细胞，4°C，1100rpm离心5min;
[0075] (6)用IOml冰冷的0.1M CaC12溶液重悬细胞，冰上放置30min后，4°C，1100rpm离心 5min；
[0076] (7)用2ml冰冷的0.1 M CaCl2溶液重悬细胞，分装后15%甘油冻存于-80°C;
[0077] C、转化及鉴定
[0078] (1)取100μΙ贮存于-80°C钙化菌，冰浴化开；加入IOyl连接产物，轻轻混匀，冰浴 30min；
[0079] (2)热休克，42 °C 水浴30 - 90s，勿动；
[0080] (3)快速转移到冰浴中，冷却l-2min;
[00811 (4)加2 · 25ml LB液至试管，再加 0 · 25ml混合物，倾斜放置，37°C，IOOrpm振荡培养 45min；
[0082] (5)5000rpm 离心lmin;
[0083] (6)弃部分上清，混匀后倒在含Amp的LB平板上，用涂布器涂均匀，室温静置，直至 液体被吸收，37°C温箱倒置培养12- 16h;
[0084] (7)用白枪头挑单克隆至5ml含Amp的LB液，37°C，220rpm振荡培养12- 16h，至OD值 在0.6-0.8之间；
[0085] (8)同时按上述步骤做阳性对照、阴性对照转化反应；
[0086] (9)提取质粒进行质粒电泳鉴定和PCR鉴定；
[0087] (10)选取PCR鉴定阳性菌液，于LB液体培养基中扩增后进行测序；
[0088](十三)BmM29表位基因真核表达载体构建
[0089] 纯化目的表位基因并亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1( + )的BamH I和EcoR I的克 隆位点。目的基因和载体的摩尔比为5:1，反应体系25ul，16°C水浴连接过夜;取连接液转化 感受态大肠杆菌DH5a，涂布于LB-Amp平板上，其中每mlLB中含AmplOOmg，37°C过夜培养;从 LB-Amp平板上随机挑取单个菌落，分别接种于LB-Amp培养基中，37°C振荡过夜培养，提取重 组质粒，经BamH I和EcoR I酶切，后1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定；
[0090] (十四）BmM29表位基因疫苗免疫应答试验
[0091] A.pcDNA3· 1 ( + )和pcDNA3· I( + ) -BmM29质粒大量抽提
[0092] (1)取100mL过夜培养的菌液加入50ml离心管，12000rpm离心3min收集细菌，尽量 弃尽上清；
[0093] (2)12000rpm离心3min，用移液器把剩下的少量液体吸出；
[0094] (3)加入IOml质粒大量抽提试剂盒的溶液1，使用涡旋振荡器和移液器让细胞悬 浮，无小菌块；
[0095] (4)加入IOml质粒大量抽提试剂盒的溶液2，立即温和地上下翻转6 - 8次，室温静置 5min；
[0096] (5)加入IOml质粒大量抽提试剂盒的溶液4,立即温和地上下翻转6-8次，室温静置 IOmin，12000rpm离心20min，将溶液全部倒入过滤柱中，慢慢推动推柄，滤液收集在50ml离 心管中；
[0097] (6)向滤液中加8ml异丙醇，混勾后转移到吸附柱，12000rpm离心2miη，弃收集管中 的废液；
[0098] (7)向吸附柱中加3ml去内毒素缓冲液，室温静置2min，12000rpm离心2min，弃收集 管中的废液；
[0099] (8)向吸附柱中加入漂洗液W2，12000rpm离心2min，弃收集管中的废液。重复一次；
[0100] (9)将吸附柱重新放回收集管，12000rpm离心5min，去除吸附柱中残余的液体。
[0101] (10)吸附柱置于干净的50ml收集管，加 Iml洗脱液TE，室温静置5min，12000rpm离 心2min;
[0102] (11)用生理盐水将纯化的质粒稀释至终浓度为lmg/ml，-20°C保存备用。
[0103] 步骤(十二)C(7)中，OD 值为 0.7.
[0104] 一种免疫佐剂，其特征是：序列如下：CpG ODN 1826 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3'，并全链硫代磷酸骨架修饰来增强其核酸酶抗性。
[0105] 本发明方法简便、易操作，效果好。本发明以我国流行的周期型马来丝虫为研究对 象，扩增马来丝虫myosin基因片段，构建了周期型马来丝虫myosin真核表达重组质粒 (p CDNA3.1( + )-Bm-my〇sin)。根据测序结果分析，推测其氨基酸序列，然后利用相关的软件 预测它们的B细胞表位和T细胞表位，制备出周期型马来丝虫肌球蛋白表位基因疫苗。将该 疫苗免疫接种BALB/c小鼠，并检测其疫苗的体液免疫和细胞免疫的应答效果。试验结果证 明了该疫苗可诱导小鼠产生特异性的免疫应答反应，取得满意效果，制备周期型马来丝虫 肌球蛋白表位基因疫苗获得成功。
[0106] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。
【具体实施方式】
[0107] -、引物设计
[01 08 ] 根据GenBank中周期型马来丝虫肌球蛋白基因（Bm- myosin)的高度保守序列区，应 用Primer Premier5.0软件设计引物，并分别引入Xho I/BamH I酶切位点，起始终止密码以 及保护性碱基，引物由上海生物工程公司合成。
[0109] Pl:上游5'-CC GGA TCC ATG AAA TGC AAA AAA T-3'
[0110] 下划线序列为BamH I酶切位点Tm = 56.84
[0111] P2:下游5'-CC CTC GAG ATG GTG AAC GGA GTA CG-3'
[0112] 下划线序列为Xho I酶切位点Tm = 66.90
[0113] 二、周期型马来丝虫虫体及微丝蝴的收集和总RNA的提取和测定
[0114] 1.将取自长爪沙鼠腹腔液的成虫及微丝蝴移入1.5ml匀浆器中，加入1mlTri zol试 剂充分研磨，室温静置5min。
[0115] 2.加入0· 2ml氯仿，震荡15s后静置2min，4°C，12000rpm离心15min取上清。
[0116] 3.加入0.51111异丙醇混勾，室温静置1〇111；[11，4<€，12000印1]1离心1〇111；[11弃上清。
[0117] 4.加入lml75%乙醇混勾，4°C，9000rpm离心5min弃上清。
[0118] 5 ·干燥5min后溶于DEPC处理水30ul，60°C lOmin。
[0119] 6.取2ul总RNA稀释200倍，在紫外分光光度计上测0D260和0D280值，确定其浓度和 纯度，并进行甲醛电泳检测。
[0120] 三、cDNA的合成
[0121] 1.取总RNA 5ul,后加入IOmM dNTPmix lul，0.5ug/ul oligo(dT)12-18ul，DEPC处 理水3ul，65°C加热5min,后冰浴5min。
[0122] 2.另取 IOXBuffer 2ul,25mM MgC12 4ul，0.1M DTT 2ul, RNA 酶抑制剂Iul 混匀， 42°C 孵育 2min。
[0123] 3.将步骤2混合液加入步骤I混匀，再加入Iul逆转录酶Superscript Π 混匀，42°C 孵育50min，70°C15min终止反应，-70°C保存备用。
[0124]四、PCR 扩增 Bm-myosin 基因
[0125] Ρ1 = 56·84，Ρ2 = 66·90,反应体系cDNA 1.5ul, 10XPCR Buffer 2.5ul，2.5mM dNTPmix 4.0ul，Pl P2各0.7ul，5U/ul TaqDNA聚合蛋白酶0.2ul，ddH20 15.4ul。混匀在DNA 扩增仪PTC-100上进行PCR。循环参数为：94°C3min，94°C50s，51°C45s，72°C90s，共33个循 环，最后一次循环72 °C延伸反应时间为7min，4 °C冷却终止反应。同时设立阴性对照。PCR产 物经1.0 %琼脂糖凝胶电泳鉴定。
[0126] 五、Bm-myosin基因片段纯化和T载体的连接以及转化
[0127] 1.纯化Bm-myosin基因片段:取50ulPCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下 切割含目的基因的凝胶，按胶回收试剂盒说明，纯化回收产物。
[0128] 2.感受态大肠杆菌的制备：大肠杆菌DH5a在新鲜LB琼脂平板上37°C培养过夜。挑 取单菌落于3ml LB培养基中，37°C振荡过夜。取300ul菌液加入30ml LB培养基中，37°C 220rpm振荡4h,冰浴lh,后分装到1 ·5ml Eppendorf管4°C离，8000rpm 5min。弃上清，加入冰 浴0.1mol/L MgC12 IOOul悬浮，4°C离心，8000rpm 5min,弃上清，加入冰浴0.1mol/L CaCl2-10 %甘油溶液300ul悬浮，-70°C保存备用。
[0129] 3. Bm-myosin基因和pGEM-T载体的连接:取纯化的PCR产物3ul，2 X快速连接缓冲 液5uI，pGEM- T载体(50ng)lul,T4DNA连接酶3weiss/uI Iu 1，共IOu 1 混匀，4°C连接20h。 [0130] 4.转化:取连接反应物IOul加入新鲜制备的大肠杆菌DH5a感受态细胞300ul混匀， 冰浴30min，42°C热休克90s，快速移至冰浴3min，加入200ul LB培养基，37°C孵育45min。将 培养物IOOul涂在含有X-gal，IPTG，Amp的1.5%琼脂平板上，倒置平板，37°C过夜培养。
[0131] 六、阳性重组克隆的筛选和鉴定
[0132] 1.阳性重组克隆的筛选:挑取生长状态好的白色菌斑，并提取质粒。
[0133] 2·PCR鉴定：以重组质粒Bm-myosin/pGEM-T为模板，用Bm-myosin的引物PlP2进行 PCR反应，反应体系25ul，Bm-myosin/pGEM-T重组质粒 1 · 5ul，10 XPCR Buffer 2 · 5ul，2 · 5mM dNTPmix4.0ul，Pl P2各0.7ul，5U/ul TaqDNA聚合蛋白酶0.2ul，ddH20 15.4ul。循环参数 为:94°C3min，94°C50s，51°C45s，72°C90s，共33个循环，最后一次循环72°C延伸反应时间为 7min，4°C冷却终止反应。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
[0134] 3.酶切鉴定：取经PCR鉴定正确的重组质粒，用BamH I与Xho I双酶切，用1.0%琼 脂糖凝胶电泳检测酶切片段。
[0135] 七、Bm-MYOSIN二级结构预测
[0136] 分别应用EXPASY服务器（http : / /www .expasy.ch/tools)上的 SOPMA、GOR、 nnPredict(University of California at SanFrancisco(UCSF))、HNN(Hierarchical NeuralNetwork method，Guermeur，1997)方法以及EMBOSS程序分析预测Bm-myosin的二级 结构。
[0137] 八、Bm-MYOSIN亲水性、表面可及性、抗原性、极性及柔韧性参数预测
[0138] 采用Hopp&Woods亲水性参数、Emini表面可及性参数、Jameson-Wo If抗原性参数、 Zimmerman 极性参数和柔韧性参数预测(http: //www · expasy · org/cgi - bin/protscale · pi)
[0139] 九、Bm-MYOSIN T细胞表位预测
[0140] 1.人源HLA I类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入 Rankpep服务器，选择AA长度为9-mers，基因型为HLA-A0201、HLA-Al 101，预测HLA I类分子 结合肽，保留输出的结果。
[0141] 2.鼠源MHC I类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入 Rankp印服务器，选择AA长度为9 -mer s，基因型为H2 - d (包括H2 - Kd、H2 - Ld和H2 - Dd，为H2 - d型 小鼠表达的MHC I类分子），预测MHC I类分子结合肽，保留输出的结果。
[0142] 3.人源HLA Π 类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入 Rankpep服务器，选择基因型为HLA - DRB1 *0101、HLA - DRB1 *0 301、HLA - DRB1 *0 401、HLA - DRB1 * 0701、HLA-DRB1*0801、HLA-DRB1*0901、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB1*1301、HLA-DRB1*1501，预 测HLA Π 类分子结合肽，保留输出的结果。
[0143] 4.鼠源MHC Π 类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入 Rankpep服务器，选择选择基因型为Ι-AcUI-Ed，预测鼠源MHC Π 类分子结合肽，保留输出的 结果。
[0144] 十、表位基因片段的选择
[0145] 根据B细胞表位预测和T细胞表位预测结果，选择富含抗原表位的基因片段 (562bp-1269bp)设计引物，以质粒pcDNA3.1( + )-BmM55为模板，并将该片段克隆至原核表达 载体pET- 28a(+)中，构建pET-BmM29。应用Primer 5软件设计引物。
[0146] 上游（Pl) :5' -GCGGATCCGCTAATGAATTGAATATGC-3'
[0147] (其中GGATCC为BamH I酶切位点）；
[0148] 下游（P2) :5' -CGGAATTCCTATGGTGAACGGAGTACGGT
[0149] (其中GAATTC为EcoR I酶切位点）。
[0150] 引物由上海生工生物技术有限公司合成，使用前用ddH20溶解，浓度为ΙΟμ mol/L。
[0151] ^、表位基因片段PCR扩增
[0152] 1.以pcDNA3.1( + )-BmM55为模板，P1、P2分别为上、下游引物，反应体系见表1。
[0153] 表1 PCR扩增反应体系
[0158]取5μ1样品用1 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增目的基因。
[0159] 十二、目的基因与载体连接与鉴定
[0160] 1.PCR产物及pET-28a( + )载体质粒双酶切体系见表2。 「01611 m?. Iv ^
[0163] 目的基因与载体连接，具体反应体系见表3。
[0164] 表3目的基因与载体连接反应体系
[0167] 混匀，室温反应30min以上，产物用于转化。
[0168] 2.E.coli DH5a感受态细胞的制备
[0169] (1)用接种环取保存于-80°CDH5a菌液，划菌于不含抗生素的LB平板上，37°C倒置 培养约14-16h至单菌落出现。
[0170] (2)挑单菌落至5ml无抗性的LB液，37 °C振荡培养约10-12h。
[0171] (3)取Iml过夜培养的菌液至含100mL无抗LB液中，37°C振荡培养约2-2.5h，到OD值 达 0.5,冰浴5-IOmin。
[0172] (4)分装到2个50ml预冷无菌的离心管，4°C，1600rpm离心7min。
[0173] (5)用IOml冰冷的0.1M CaC12溶液重悬细胞，4°C，1100rpm离心5min。
[0174] (6)用IOml冰冷的0 · IM CaC12溶液重悬细胞，冰上放置30min后，4°C，IIOOrpm离心 5min〇
[0175] (7)用2ml冰冷的0.1M CaC12溶液重悬细胞，分装后15%甘油冻存于_80°C。
[0176] 3.转化及鉴定
[0177] (1)取100μΙ贮存于-80°C钙化菌，冰浴化开;加入IOyl连接产物，轻轻混匀，冰浴 30min〇
[0178] (2)热休克，42 °C 水浴30 - 90s，勿动。
[0179] (3)快速转移到冰浴中，冷却l_2min。
[0180] (4)加2 · 25ml LB液至试管，再加0 · 25ml混合物，倾斜放置，37°C，IOOrpm振荡培养 45min〇
[0181] (5)5000rpm 离心lmin。
[0182] (6)弃部分上清，混匀后倒在LB平板(含Amp)上，用涂布器涂均匀，室温静置，直至 液体被吸收，37°C温箱倒置培养12- 16h。
[0183] (7)用白枪头挑单克隆至5ml LB液(含Amp)，37°C，220rpm振荡培养12-16h，至OD值 在0.6-0.8之间。
[0184] (8)同时按上述步骤做阳性对照、阴性对照转化反应。
[0185 ] (9)提取质粒进行质粒电泳鉴定和PCR鉴定。
[0186] (10)选取PCR鉴定阳性菌液，于LB液体培养基中扩增后送上海英骏生物技术有限 公司进行测序。
[0187] 十三、BmM29表位基因真核表达载体构建
[0188] 纯化目的表位基因并亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1( + )的BamH I和EcoR I的克 隆位点。目的基因和载体的摩尔比为5:1，反应体系25ul，16°C水浴连接过夜。取连接液转化 感受态大肠杆菌〇耶€[，涂布于1^-411^1(10011^/1111)平板上，37 <€过夜培养。从1^-411^1(10011^/ ml)平板上随机挑取单个菌落，分别接种于LB-Amp培养基中，37°C振荡过夜培养，提取重组 质粒，经BamH I和EcoR I酶切，后1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
[0189] 十四、BmM29表位基因疫苗免疫应答试验
[0190] 1 · pcDNA3 · 1 ( + )和pcDNA3 · I ( + ) -BmM29质粒大量抽提
[0191 ] (1)取100mL过夜培养的菌液加入50ml离心管，12000rpm离心3min收集细菌，尽量 弃尽上清。
[0192] (2) 12000rpm离心3min，用移液器把剩下的少量液体吸出。
[0193] (3)加入IOml质粒大量抽提试剂盒的溶液1，使用涡旋振荡器和移液器让细胞悬 浮，无小菌块。
[0194] (4)加入IOml质粒大量抽提试剂盒的溶液2，立即温和地上下翻转6 - 8次，室温静置 5min〇
[0195] (5)加入IOml质粒大量抽提试剂盒的溶液4，立即温和地上下翻转6 - 8次，室温静置 IOmin，12000rpm离心20min，将溶液全部倒入过滤柱中，慢慢推动推柄，滤液收集在50ml离 心管中。
[0196] (6)向滤液中加8ml异丙醇，混勾后转移到吸附柱，12000rpm离心2min，弃收集管中 的废液。
[0197] (7)向吸附柱中加3ml去内毒素缓冲液，室温静置2min，12000rpm离心2min，弃收集 管中的废液。
[0198] (8)向吸附柱中加入漂洗液W2，12000rpm离心2min，弃收集管中的废液。重复一次。
[01"] (9)将吸附柱重新放回收集管，12000rpm离心5min，去除吸附柱中残余的液体。
[0200] (10)吸附柱置于干净的50ml收集管，加 Iml洗脱液TE，室温静置5min，12000rpm离 心2min〇
[0201] (11)用生理盐水将纯化的质粒稀释至终浓度为lmg/ml，-20°C保存备用。
[0202] 2.免疫佐剂CpG ODN的制备
[0203] 新型佐剂中以非甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸为核心的寡聚脱氧核苷酸(CpG 0DN)最具代表性。CpG ODN合成的序列如下:CpG ODN 1826 S'-TCCATGACGTTCCTGACGTTJ^ 并全链硫代磷酸骨架修饰来增强其核酸酶抗性，由上海英骏生物公司合成。用生理盐水溶 解配制成lmg/ml。
[0204] 3.实验动物分组
[0205]将48只BALB/c实验小鼠称量体重排序，按照随机数字表法分4组，每组12只，A: PBS 对照组;B:佐剂CpG对照组;C:空载体pcDNA3.1 ( + )/CpG组;D:重组质粒pcDNA3.1 ( + ) -BmM29/ CpG组，免疫方案为0、2、4周各免疫一次。
[0206] 4.接种部位预处理
[0207] DNA疫苗注射部位为小鼠后腿胫前肌，重组蛋白疫苗为皮下多点注射。将Iml左旋 盐酸布比卡因注射液稀释到Hml生理盐水中，得到0.5mg/ml稀释液。每次接种前24h，于接 种部位注射左旋盐酸布比卡因50μ1进行预处理。
[0208] 5.免疫接种
[0209] A:PBS 100μ1;Β:佐剂CpG 30yg;C:pcDNA3.1( + )/CpG 100yg/30yg;D:pcDNA3.1 (+) - BmM29/CpG 100yg/30yg。共免疫3次，每次间隔 2周。
[0210] 十四、免疫应答反应检测
[0211] 1.血清采集:分别于初次免疫后4、6、8周用眼球摘除法收集小鼠血清，每组取4只 小鼠。室温静置Ih，置4°C过夜，待析出血清，4°C，4000rpm离心10min。分装血清，贮存于-80 cC。
[0212] 2.免疫小鼠血清中IgG检测
[0213] (1)抗原包被:用抗原包被缓冲液将抗原稀释成5yg/mL，以100μΙ/孔包被酶标板，4 °C过夜；
[0214] (2)弃液体，用PBST洗涤3次。使用100μΙ/孔封闭液封闭，室温静置Ih;
[0215] (3)弃液体，血清用抗体稀释液按照1:100比例稀释后，100μΙ/孔，室温2h;
[0216] ⑷用PBST洗涤3次；
[0217] (5)用样品稀释液1:2000稀释HRP偶联的IgG抗体后，100μΙ/孔，室温Ih;
[0218] (6)使用PBST洗涤3次；
[0219] ⑴加入1〇〇μ1/孔底物液，作用15min后，加50μ1 2mol/L H2SO4终止反应；
[0220] (8)在450nm处测定吸光值，保存数据。
[0221] 3.小鼠脾细胞采集
[0222] (1)初次免疫后8周处死小鼠；
[0223] (2)取无菌I Oml螺口管，加入3ml淋巴细胞分离液，37 °C预热2h;
[0224] (3)将处死的小鼠置75 %乙醇溶液中2 - 3min进行消毒；
[0225] (4)将小鼠左腹侧朝上，用镊子将小鼠左腹部皮肤轻轻提起，用手术剪剪出约Icm 长刀口，用手将腹部皮肤撕开，暴露腹膜，可见红色长条状脾脏，将其小心分离。
[0226] (5)将100目铜筛放入盛3ml HanV s液的平皿中，将脾脏放在铜筛上，先将脾脏撕 碎，再用玻璃棒轻轻研磨，直至铜筛上只剩下结缔组织，再用s液冲洗铜筛；
[0227] (6)将含3ml淋巴细胞分离液的螺口管倾斜45°，用滴管将平皿中的细胞悬液沿管 壁缓慢转移(淋巴细胞分离液:细胞悬液=1:2)，不要冲破淋巴细胞分离液的界面；
[0228] (7)室温2000rpm离心20min，管中液体分为4层；
[0229] (8)取白色的第2层，转移至含10ml HanV s液的50ml离心管中，室温1000 rpm离心 IOmin；
[0230] (9)弃上层液体，加入10ml Hanl^ s液，轻轻吹打混勾，室温1000 rpm离心10min;
[0231] (10)弃上层液体，加入10ml HanV S液，轻轻吹打混勾，用计数板计数；
[0232] (11)室温1000 rpm离心10min，弃上层液体，加入适量完全培养基使得细胞的终浓 度为2 X 106cells/ml。
[0233] 4.细胞因子的诱生
[0234] 24孔板加入2X106cells/ml细胞悬液475μ1/孔，每孔各加 100μΙ/ml ConA 25μ1 至 终浓度为5μg/ml，5 %C02培养箱中37°C孵育48h。5000rpm离心10min收集培养液，取上清准 备检测。
[0235] 5.INF-γ 和IL-4含量测定
[0236] (1)提前20min取出保存在4°C的ELISA试剂盒，平衡至室温；
[0237] (2)将浓缩洗涤液用ddH20稀释20倍；
[0238] (3)从已平衡至室温的密封袋中取出酶标板，加入标准样品（160pg/ml、80pg/ml、 40pg/ml、20pg/ml、lOpg/ml、Opg/ml)各50ul;
[0239] (4)从已平衡至室温的密封袋中取出酶标板，除空白孔外，分别加入样品稀释液 40ul和待测样品IOul;
[0240] (5)除空白孔外，标准品孔和样品孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体 1〇〇μ1，用封板膜封住反应孔，37°C孵育30min;
[0241 ] (6)弃去液体，在吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置Imin，甩去洗涤液，在吸水 纸上拍干，如此重复洗板5次；
[0242] (7)每孔先加入显色剂A、B各50μ1，37Γ避光孵育15min;
[0243] (8)每孔加入终止液50μ1，15π?η内，在450nm波长处测定各孔的OD值；
[0244] (9)计算OD值:每个标准品和标本的OD值减去空白孔的OD值；
[0245] (10)绘制标准曲线：以标准品浓度作横坐标，对应的OD值作纵坐标，绘制出标准品 线性回归曲线；
[0246] (11)通过样品的OD值可在标准曲线上查出该样品的浓度。
[0247] 6.数据分析
[0248]应用SPSS19.0统计学软件分析样本数据，计量资料以均数土标准差表示，小鼠血 清抗体的OD45Q值、小鼠脾细胞培养上清中细胞因子IFN- γ和IL-4水平的组间比较比较采用 单因素方差分析，组间多重比较采用SNK(Student-Newman-Keuls)法。Ρ〈0.05为差异有统计 学意义。
[0249]表4免疫小鼠血清抗体0D450值测定
[0254] 注:*表示与三个对照组分别比较，差异有统计学意义，Ρ<0.05。
[0255] 通过试验成功地扩增出周期型马来丝虫myosin基因片段。经1.0%琼脂糖凝胶电 泳检测，Bm-myosin扩增片段大小与预期的1292bp基本相符。基因测序与GeneBank上提供的 序列blast比较的结果，同源性为98%，证明克隆片段正确。其表达蛋白为431个氨基酸。综 合Bm-MYOSIN蛋白的二级结构预测和亲水性、表面可及性、极性及柔韧性参数等B细胞表位 预测结果，以及T细胞表位预测研究结果，选择富含抗原表位的基因片段(562bp-1269bp)， 将真核表达载体pcDNA3.1 ( + )质粒与BmM29目的基因片段连接，构建pcDNA3.1 ( + ) - BmM29真 核表达载体，制备出周期型马来丝虫M29表位基因 DNA疫苗。
[0256] 将该表位基因 DNA疫苗免疫接种BALB/c小鼠后腿胫前肌，对免疫小鼠进行疫苗免 疫效果检测，测定免疫小鼠血清中IgG和脾细胞细胞因子INF- γ和IL-4含量。结果显示:免 疫小鼠产生高水平特异性IgG抗体，明显高于对照组(Ρ均<0.05)。随着免疫次数的增加，免 疫小鼠 IgG抗体的0D450值呈上升趋势。免疫细胞因子检测结果显示:免疫组小鼠脾细胞培 养上清中细胞因子IFN- γ和IL-4的水平均明显高于对照组，有显著统计学意义0均〈 0.05)。以上实验结果证明周期型马来丝虫Μ29表位基因 DNA疫苗免疫接种可诱导小鼠产生 特异性的体液和细胞免疫应答反应，取得满意效果。周期型马来丝虫Μ29表位基因 DNA疫苗 的制备获得成功。
【主权项】
1.一种周期型马来丝虫M29表位基因 DNA疫苗在诱导产生IgG和脾细胞细胞因子INF- γ 和IL- 4的制剂中的应用，其特征是:所述周期型马来丝虫Μ29表位基因 DNA疫苗的制备方法 包括下列步骤： (一） 引物设计 根据GenBank中周期型马来丝虫肌球蛋白基因（的高度保守序列区，应用Primer Premier5.0软件设计引物，并分别引入Xho I/BamH I酶切位点，起始终止密码以及保护性 喊基； 卩1:上游5'-〇： GGA TCC ATG AAA TGC AAA AAA T-3' 下划线序列为BamHI酶切位点Tm=56.84 卩2:下游5'-〇： CTC GAG ATG GTG AAC GGA GTA CG-3' 下划线序列为Xhol酶切位点Tm=66.90 (二) 周期型马来丝虫虫体及微丝蝴的收集和总RNA的提取和测定 (1) 将取自长爪沙鼠腹腔液的成虫及微丝蝴移入1.5ml匀浆器中，加入lmlTrizol试剂 研磨，室温静置5min; (2) 加入0.2ml氯仿，震荡15s后静置2min，4°C，12000rpm离心15min取上清； (3) 加入0.5ml异丙醇混勾，室温静置10min，4°C，12000rpm离心10min弃上清； (4) 加入lml 75%乙醇混勾，4°C，9000rpm离心5min弃上清； (5) 干燥5min后溶于DEPC处理水30ul，60 °C lOmin; (6) 取2ul总RNA稀释200倍，在紫外分光光度计上测0D260和0D280值，确定其浓度和纯 度，并进行甲醛电泳检测； (三) cDNA的合成 (1) 取总RNA 5ul,后加入 10mM dNTPmix lul，0.5ug/ul oligo(dT)12-18ul，DEPC处理 水3ul，65°C加热5min，后冰浴5min; (2) 另取lOXBuffer 2ul，25mM MgC12 4ul，0.1M DTT 2ul，RNA酶抑制剂lul混匀，42°C 孵育2min; (3) 将步骤(2)混合液加入步骤（1)物质中混匀，再加入lul逆转录酶Superscript Π 混 匀；42°C孵育50min，70°C15min终止反应，-70°C保存备用； (四） PCR扩增Bm-myosin基因 ?1 = 56.84，？2 = 66.90，反应体系。0嫩1.5111，10\卩〇?811打612.5111，2.5111]\1(1犯1311^叉 4.0ul，Pl P2各0.7ul，5U/ul TaqDNA聚合蛋白酶0.2ul，ddH20 15.4ul;混匀在DNA扩增仪 ?1'0100上进行？0?;循环参数为：941€31^11，94 1€5〇8,511€458,721€9〇8，共33个循环，最后 一次循环7 2 °C延伸反应时间为7 m i η，4 °C冷却终止反应；同时设立阴性对照。P C R产物经 1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定； (五) Bm-myos in基因片段纯化和T载体的连接以及转化 (1) 纯化Bm-myosin基因片段:取50ulPCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切 割含目的基因的凝胶，按胶回收试剂盒说明，纯化回收产物； (2) 感受态大肠杆菌的制备:大肠杆菌DH5a在新鲜LB琼脂平板上37°C培养过夜;挑取单 菌落于3ml LB培养基中，37°C振荡过夜;取300ul菌液加入30ml LB培养基中，37°C220rpm振 荡4h，冰浴lh，后分装到1 · 5ml Eppendorf管4°C离，8000rpm 5min ;弃上清，加入冰浴 O.lmol/L MgC12 lOOul悬浮，4°C离心，8000rpm 5min,弃上清，加入冰浴O.lmol/L CaCl2-10 %甘油溶液300u 1悬浮，-70 °C保存备用； (3) Bm-myosin基因和pGEM-T载体的连接：取纯化的PCR产物3ul，2 X快速连接缓冲液 5u 1，pGEM - T 载体 1 u 1，T4DNA 连接酶 3we i s s /u 1 1 u 1，共 10u 1 混匀，4 °C 连接 20h; (4) .转化:取连接反应物10ul加入新鲜制备的大肠杆菌DH5a感受态细胞300ul混匀，冰 浴30min，42°C热休克90s，快速移至冰浴3min，加入200ul LB培养基，37°C孵育45min。将培 养物100ul涂在含有X-gal，IPTG，Amp的1.5 %琼脂平板上，倒置平板，37°C过夜培养； (六） 阳性重组克隆的筛选和鉴定 (1) 阳性重组克隆的筛选:挑取生长状态好的白色菌斑，并提取质粒； (2) PCR鉴定：以重组质粒Bm-myosin/pGEM-T为模板，用Bm-myosin的引物Pl、P2进行PCR 反应，反应体系25ul，Bm-myosin/pGEM-T重组质粒 1 · 5ul，10 X PCR Buffer 2 · 5ul，2 · 5mM dNTPmix4 · Oul，PI、P2各0 · 7ul，5U/ul TaqDNA聚合蛋白酶0 · 2ul，ddH20 15 · 4ul;循环参数 为:94°C3min，94°C50s，51°C45s，72°C90s，共33个循环，最后一次循环72°C延伸反应时间为 7min，4°C冷却终止反应;PCR产物经1.0 %琼脂糖凝胶电泳鉴定； (3) 酶切鉴定:取经PCR鉴定正确的重组质粒，用BamH I与Xho I双酶切，用1.0%琼脂糖 凝胶电泳检测酶切片段； (七) Bm-MYOSIN二级结构预测 分别应用EXPASY服务器上的S0PMA、G0R、nnPr ed i c、HNN方法以及EMBOSS程序分析预测 Bm-myosin的二级结构； (八) Bm-MYOSIN亲水性、表面可及性、抗原性、极性及柔韧性参数预测 采用Hopp&Woods亲水性参数、Emin i表面可及性参数、Jameson-Wo If抗原性参数、 Zimmerman极性参数和柔韧性参数预测； (九) Bm-MYOSIN T细胞表位预测 (1) 人源HLA I类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep 服务器，选择44长度为9-1^^，基因型为!11^40201、!11^41101，预测!11^1类分子结合肽， 保留输出的结果； (2) 鼠源MHC I类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep 服务器，选择AA长度为9-mers，基因型为H2-d，包括H2-Kd、H2-Ld和H2-Dd，为H2-d型小鼠表 达的MHC I类分子;预测MHC I类分子结合肽，保留输出的结果； (3) 人源HLA Π 类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入 Rankpep服务器，选择基因型为HLA - DRB1 *0101、HLA - DRB1 *0 301、HLA - DRB1 *0 401、HLA - DRB1 * 0701、HLA-DRB1*0801、HLA-DRB1*0901、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB1*1301、HLA-DRB1*1501，预 测HLA Π 类分子结合肽，保留输出的结果； (4) 鼠源MHC Π 类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的ΑΑ序列以FASTA格式输入 Rankpep服务器，选择选择基因型为I-Ad、I-Ed，预测鼠源MHC Π 类分子结合肽，保留输出的 结果； (十)表位基因片段的选择 根据B细胞表位预测和T细胞表位预测结果，选择富含抗原表位的基因片段562bp-1269bp设计引物，以质粒pcDNA3.1( + )-BmM55为模板，并将该片段克隆至原核表达载体pET- 28a(+)中，构建pET-BmM29。应用Primer 5软件设计引物； 上游PI: 5 ' - GCGGATCCGCTAATGAATTGAATATGC - 3 ' 其中GGATCC为BamH I酶切位点； 下游P2:5 ' - CGGAATTCCTATGGTGAACGGAGTACGGT 其中GAATTC为EcoR I酶切位点； 引物使用前用ddH20溶解，浓度为lOymol/L; (十一)表位基因片段PCR扩增 (1)以pcDNA3.1 ( + ) - BmM55为模板，PI、P2分别为上、下游引物，反应体系： PCR扩增反应体系扩增反应参数为：取5μ1样品用1 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增目的基因； (十二）目的基因与载体连接与鉴定 A、PCR产物及pET-28a( + )载体质粒双酶切体系： 双酶切反应体系目的基因与载体连接，具体反应体系： 目的基因与载体连接反应体系混匀，室温反应30min以上，产物用于转化； B、 E.coli DH5a感受态细胞的制备 (1) 用接种环取保存于-80°CDH5a菌液，划菌于不含抗生素的LB平板上，37°C倒置培养 约14- 16h至单菌落出现； (2) 挑单菌落至5ml无抗性的LB液，37 °C振荡培养约10- 12h; (3) 取lml过夜培养的菌液至含100ml无抗LB液中，37 °C振荡培养约2- 2.5h，到OD值达 〇.5，冰浴5-1〇11^11; (4) 分装到2个50ml预冷无菌的离心管，4°C，1600rpm离心7min; (5) 用10ml冰冷的0 · 1M CaC12溶液重悬细胞，4°C，1 lOOrpm离心5min; (6) 用10ml冰冷的0.1M CaC12溶液重悬细胞，冰上放置30min后，4°C，1100rpm离心 5min； (7) 用2ml冰冷的0.1M CaCl2溶液重悬细胞，分装后15%甘油冻存于-80°C ; C、 转化及鉴定 (1) 取100μΙ贮存于-80°C钙化菌，冰浴化开;加入10μ1连接产物，轻轻混匀，冰浴30min; (2) 热休克，42 °C水浴30 - 90 s，勿动； (3) 快速转移到冰浴中，冷却1 - 2min; (4) 加2.25ml LB液至试管，再加0.25ml混合物，倾斜放置，37 °C，lOOrpm振荡培养 45min； (5) 5000rpm 离心 lmin; (6) 弃部分上清，混匀后倒在含Amp的LB平板上，用涂布器涂均匀，室温静置，直至液体 被吸收，37 °C温箱倒置培养12 -16h; (7) 用白枪头挑单克隆至5ml含Amp的LB液，37°C，220rpm振荡培养12-16h，至0D值在 0.6-0.8 之间； (8) 同时按上述步骤做阳性对照、阴性对照转化反应； (9) 提取质粒进行质粒电泳鉴定和PCR鉴定； (10) 选取PCR鉴定阳性菌液，于LB液体培养基中扩增后进行测序； (十三)BmM29表位基因真核表达载体构建 纯化目的表位基因并亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1( + )的BamH I和EcoR I的克隆位 点。目的基因和载体的摩尔比为5:1，反应体系25ul，16°C水浴连接过夜;取连接液转化感受 态大肠杆菌DH5a，涂布于LB-Amp平板上，其中每mlLB中含AmplOOmg，37°C过夜培养;从LB-Amp平板上随机挑取单个菌落，分别接种于LB-Amp培养基中，37 °C振荡过夜培养，提取重组 质粒，经BamH I和EcoR I酶切，后1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定； (十四）BmM29表位基因疫苗免疫应答试验 A · pcDNA3 · 1 ( + )和pcDNA3 · 1 ( + ) -BmM29 质粒大量抽提 (1) 取100ml过夜培养的菌液加入50ml离心管，12000rpm离心3min收集细菌，尽量弃尽 上清； (2) 12000rpm离心3min，用移液器把剩下的少量液体吸出； (3) 加入10ml质粒大量抽提试剂盒的溶液1，使用涡旋振荡器和移液器让细胞悬浮，无 小菌块； (4) 加入10ml质粒大量抽提试剂盒的溶液2,立即温和地上下翻转6-8次，室温静置 5min； (5) 加入10ml质粒大量抽提试剂盒的溶液4,立即温和地上下翻转6-8次，室温静置 10min，12000rpm离心20min，将溶液全部倒入过滤柱中，慢慢推动推柄，滤液收集在50ml离 心管中； (6) 向滤液中加8ml异丙醇，混勾后转移到吸附柱，12000rpm离心2min，弃收集管中的废 液； (7) 向吸附柱中加3ml去内毒素缓冲液，室温静置2min，12000rpm离心2min，弃收集管中 的废液； (8) 向吸附柱中加入漂洗液W2，12000rpm离心2min，弃收集管中的废液。重复一次； (9) 将吸附柱重新放回收集管，12000rpm离心5min，去除吸附柱中残余的液体。 (10) 吸附柱置于干净的50ml收集管，加 lml洗脱液TE，室温静置5min，12000rpm离心 2min； (11) 用生理盐水将纯化的质粒稀释至终浓度为lmg/ml，- 20°C保存备用。2. 根据权利要求1所述的周期型马来丝虫M29表位基因 DNA疫苗在诱导产生IgG和脾细 胞细胞因子INF - γ和IL - 4的制剂中的应用，其特征是:步骤(十二)B (2)中37 °C振荡培养约 10h〇3. 根据权利要求1所述的周期型马来丝虫M29表位基因 DNA疫苗在诱导产生IgG和脾细 胞细胞因子INF - γ和IL - 4的制剂中的应用，其特征是:步骤(十二)B (2)中37 °C振荡培养约 llh〇4. 根据权利要求1所述的周期型马来丝虫M29表位基因 DNA疫苗在诱导产生IgG和脾细 胞细胞因子INF - γ和IL - 4的制剂中的应用，其特征是:步骤(十二)B (2)中37 °C振荡培养约 12h〇
【文档编号】C12N15/85GK105944093SQ201610398014
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2014年10月21日
【发明人】方政, 吴佳倩, 徐倩, 方浩, 张波, 陆施娟, 陶然, 刘芹, 谢东方
【申请人】南通大学