专利名称：一种前列腺癌相关的基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及前列腺癌相关的N-myc 下游调节3型基因(NDRG3)及其应用；针对NDRG3基因或蛋白的拮抗剂及其 应用。
背景技术：
前列腺癌是欧美国家男性常见病，在过去20年中，中国前列腺癌发病率 的增加也居各种肿瘤之首。前列腺癌患者被确诊时， 一半左右的病例都属晚期， 大部分病例有癌细胞转移，不仅失去了早期根治的机会，而且处于该阶段的治 疗预后效果很不理想。因此，前列腺癌已成为危害老年男性人群健康的重大疾 病。前列腺癌的分子病理学机制是错综复杂的，不但多基因参与其发病，而且 外部的环境因素如饮食、炎症、生活方式、病毒、化学物质、射线等也参与其 进程。
迄今为止，多方面的研究已经论证了多基因和环境因素间的复杂关系在前 列腺癌的发生、发展中起着重要作用。
在癌组织中通常表达上调的基因产物可作为研发新的抗癌药物的潜在靶 点，事实上，针对某些类型癌症中异常表达的、导致癌症生长和发展的分子， 已经开发出了有效的新药，这类药物包括治疗治疗慢性粒细胞白血病的Glivec (STI-571)、乳腺癌的Herceptin等。
已知有多种分子在前列腺癌组织中过度表达，因而被鉴定为前列腺癌标记 物或者治疗靶标，然而这些分子多数在其他主要器官中同样过度表达，以这些 分子为耙的药物可能对癌细胞是有毒的，但同样对其他器官的正常细胞造成损 害。因此，在肿瘤组织中大量表达并且仅在肿瘤组织中表达的基因有希望成为 候选靶。
综上，本领域迫切需要找到与前列腺癌的发生和发展相关的、且在前列腺 癌中特异表达的基因，作为前列腺癌的治疗靶标。
发明内容
本发明的目的在于提供一种前列腺癌相关的N-myc下游调节3型基因 (NDRG3)及其应用。
本发明的另一目的在于提供所述NDRG3的拮抗剂及其在制备预防或治疗 前列腺癌的药物中的应用。
本发明的另一目的在于提供基于所述的NDRG3作为药物筛选靶点，筛选 预防或治疗前列腺癌的潜在物质的方法。
本发明的另一目的在于提供以所述的NDRG3作为标志物，检测前列腺癌 的方法、试剂或试剂盒。
在本发明的第一方面，提供一种N-myc下游调节3型基因(NDRG3)或蛋 白的拮抗剂的用途，用于制备预防或治疗前列腺癌的组合物。 在另一优选例中，所述的前列腺癌细胞表达NDRG3。 在另一优选例中，所述的组合物还用于抑制前列腺癌细胞的转移。 在另一优选例中，所述的拮抗剂选自(但不限于)
特异性干扰N-myc下游调节3型基因表达的小干扰RNA分子或反义核苷 酸；或
特异性与N-myc下游调节3型基因编码的蛋白结合的抗体或配体。
在另一优选例中，所述的小干扰RNA分子是
SEQ ID NO: 7所示核苷酸序列的小干扰RNA分子；
SEQ ID NO: 8所示核苷酸序列的小干扰RNA分子；
SEQ ID NO: 9所示核苷酸序列的小干扰RNA分子；和/或
SEQ ID NO: 10所示核苷酸序列的小千扰RNA分子。
在本发明的第二方面，提供一种用于预防或治疗前列腺癌的小干扰RNA 分子，所述的小干扰RNA分子选自
SEQ ID NO: 7所示核苷酸序列的小干扰RNA分子； SEQ ID NO: 8所示核苷酸序列的小干扰RNA分子； SEQ ID NO: 9所示核苷酸序列的小干扰RNA分子；和/或 SEQ ID NO: 10所示核苷酸序列的小干扰RNA分子。在本发明的第三方面，提供一种预防或治疗前列腺癌的组合物，所述的组 合物含有
(1) 有效量的N-myc下游调节3型基因或蛋白的拮抗剂，以及
(2) 药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的组合物还含有有效量的以下抗肿瘤药物溶瘤病毒。
在另一优选例中，所述的溶瘤病毒是ZD55-IL24。
在本发明的第四方面，提供一种筛选预防或治疗前列腺癌的潜在物质的方
法，所述方法包括
(1) 用候选物质处理表达N-myc下游调节3型基因的体系；和
(2) 检测所述体系中N-myc下游调节3型基因的表达或活性；
其中，若所述候选物质可降低N-myc下游调节3型基因的表达或活性，则 表明该候选物质是预防或治疗前列腺癌的潜在物质。
在另一优选例中，步骤(l)包括在测试组中，将候选物质加入到表达N-myc 下游调节3型基因的体系中；和/或
步骤(2)包括检测测试组的体系中N-myc下游调节3型基因的表达或活 性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达N-myc 下游调节3型基因的体系；
如果测试组中N-myc下游调节3型基因的表达或活性在统计学上低于(优 选显著低于，如低20%以上，较佳的低50%以上；更佳的低80%以上)对照组， 就表明该候选物是预防或治疗前列腺癌的潜在物质。
在另一优选例中，所述的体系是细胞。
在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的潜在物质进行进一步的细 胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于预防或治疗前列 腺癌有用的物质。
在本发明的第五方面，提供一种特异性识别N-myc下游调节3型基因或其 编码的蛋白的试剂的用途，用于制备检测前列腺癌的试剂或试剂盒。
在另一优选例中，所述的特异性识别N-myc下游调节3型基因或其编码的 蛋白的试剂选自特异性扩增N-myc下游调节3型基因的引物； 特异性识别N-myc下游调节3型基因的探针；或 特异性结合N-myc下游调节3型基因编码的蛋白的抗体或配体。 在另一优选例中，所述的特异性扩增N-myc下游调节3型基因的引物具有 SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示的序列。
在本发明的第六方面，提供一种检测前列腺癌的试剂盒，所述的试剂盒中 含有特异性识别N-myc下游调节3型基因或其编码的蛋白的试剂。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而 易见的。
图h NDRG3在人的组织和前列腺癌细胞株的表达情况。
A:利用大规模平行测序技术检测NDRG3在33种人正常组织中的表达模式。
B:前列腺癌细胞株LNCaP、 CL-l、 PC-3、 DU145和前列腺永生化间质细 胞株WPMY-l中NDRG3的表达情况，左图为RT-PCR检测mRNA，右图为 Western blot检测NDRG3蛋白，以P -actin作为上样量对照。
C: LNCaP细胞中NDRG3受雄激素调节，左图为RT-PCR检测mRNA右 图为Western blot检测NDRG3蛋白(泳道1与4:未受雄激素处理；泳道2与5: 受雄激素(lOnM)处理24小时；泳道3与6:受雄激素(10nM)处理48小时。以 P-actin作为上样量对照。
图2: NDRG3在人前列腺癌组织中的表达情况。
在组织芯片上用免疫组化方法检测NDRG3的表达情况，图A， B， E， F 为前列腺癌样品和图C， D为BPH样品。其中图F中的样品未受一抗处理， 作为阴性对照。
图3: NDRG3的过度表达促进前列腺癌细胞PC-3的致癌潜能。
A: Western blot分析稳定转染NDRG3的细胞株PN3， PN5和PN10的表达水平。其中，Parental表示未转染的亲本PC-3细胞；PNK表示阴性对照。 B: PN3， PN5和PN10细胞的生长速率，NDRG3稳定表达的细胞克隆生
长率明显快于对照PNK。
C:创伤修复试验的照片。
D: NDRG3过表达的细胞株(PN3， PN10),禾[I PNK，亲本PC-3细胞在裸 鼠上肿瘤形成试验。
图4:在CL1细胞中降低NDRG3表达降低了细胞的生长速度和克隆形成 能力。
A: Western blot结果显示NDRG3-siRNA组(泳道l)的蛋白表达量明显低 于GFP-siRNA组(泳道2)。
B:转染NDRG3-siRNA和GFP-siRNA后72小时、120小时细胞生长的比较。
C: CL-1细胞转染NDRG3-siRNA后的克隆形成试验。
图5:过量表达NDRG3的细胞株PN3， PN10在ZD55-IL24作用下的存活率。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次揭示N-myc下游调节3型基因 (NDRG3)在前列腺癌中高表达，并且NDRG3的异常表达或活化与前列腺癌的 发生和发展密切相关。NDRG3的过表达可促进肿瘤细胞的生长，而抑制NDRG3 的表达可抑制肿瘤细胞的生长。并且，NDRG3的过表达可增强肿瘤细胞对于 抗肿瘤药物的抵抗能力。因此，NDRG3是一种在肿瘤细胞中发挥重要功能的 基因，不仅可作为前列腺癌的诊断标志，还可作为靶点开发预防或治疗前列腺 癌的药物。
NDRG3
N-myc下游调节基因(N-myc downstream regulated gene， NDRG)是最近 发现的一个新的基因家族，它至少包括NDRG1、 NDRG2、 NDRG3和NDRG4 四个成员。其中已经发现NDRG1、 NDRG2作为肿瘤生长的负调节因子参与细胞的增殖与分化，因此具有肿瘤生长抑制的功能。然而，在现有技术中NDRG3 的功能还没有得到深入研究，尤其是NDRG3的功能以及是否与癌症之间存在 关系并不清楚。
NDRG3基因(参见NP—114402.1)编码374个氨基酸的蛋白质。为揭示前 列腺癌的发生机理，鉴定新的癌症诊断标记物和/或者药物耙点以治疗癌症，本 发明人联合大规模并行测序(MPSS)和组织芯片等技术分析了NDRG3在前列 腺和前列腺癌中的基因表达情况。利用MPSS技术对人类多种组织进行了 NDRG3表达分析，研究显示NDRG3表达具有高度组织特异性，其中在睾丸和 前列腺中具有高表达。前列腺中每百万有30个转录产物，睾丸每百万有92个 转录产物，其表达明显高于其他组织，这说明NDRG3在前列腺中是一个特异 表达基因。
本发明人用RT-PCR和Western印迹分析显示，NDRG3在五种前列腺细胞 (包括PC3， DU145， CL-1， LNCaP和WPMY-1)中都有不同水平的表达，并 且在LNCaP细胞中NDRG3的表达可以被雄激素类似物R1881显著上调。本发 明人还在组织芯片上检测到NDRG3在前列腺癌样本中的表达率为58.6%，而 在良性前列腺增生(BPH)样本中仅为13.2%，两者差异显著。上述结果说明 NDRG3可以作为前列腺癌诊断的标志物。
为了研究NDRG3是否能够影响前列腺癌细胞的致癌潜能，本发明人制备 了稳定转染并高表达NDRG3的肿瘤细胞株，从而研究过表达NDRG3对肿瘤 细胞的影响。结果显示NDRG3能够显著促进前列腺癌细胞的增长，在克隆形 成试验和创伤修复实验中也表明它能够增强前列腺癌细胞的恶性度和迁移性。 NDRG3过表达可在裸鼠模型上促进肿瘤形成。证明NDRG3具有肿瘤促进功能 并在前列腺癌的发生、发展中起相当重要的作用。上述研究结果不仅肯定了 NDRG3具有促进肿瘤生长的功能，而且提示它对于治疗或预防前列腺癌有重 要意义。
进一步的，本发明人利用干扰NDRG3表达的siRNA转染前列腺癌细胞， 研究所述siRNA对细胞产生的影响和作用。结果显示RNAi后的前列腺癌细胞 中大部分内源性的NDRG3蛋白表达降低，细胞的生长速度显著降低，细胞形 成的克隆数明显减少，即生长率和克隆形成能力显著降低。这说明降低NDRG3 的表达可以抑制前列腺癌细胞的生长。因此NDRG3可以作为前列腺癌的药物 设计的靶标。目前生物治疗已成为肿瘤治疗的发展方向，其中以溶瘤病毒为载体的病毒 -基因治疗技术已显示较好的疗效。本发明人使用了 ZD55-IL24溶瘤病毒株。该 病毒株主要通过两个基本点途径杀死肿瘤细胞1，通过溶瘤病毒ZD55选择性 在肿瘤细胞内繁杂，最后直接杀死宿主肿瘤细胞；2，通过溶瘤病毒ZD55选择 性在肿瘤细胞内繁杂时，合成IL24。 IL-24分泌后，能选择性杀死肿瘤细胞。 结果，本发明人首次发现，ZD55-IL24溶瘤病毒能有效杀死前列腺癌细胞，但 在同样的ZD55-IL24用量的条件下，过量表达NDRG3的前列腺癌细胞的存活 率显著增高。这充分说明过量表达NDRG3的前列腺癌细胞能明显的抵抗溶瘤 病毒的作用。N-myc下游调节3型基因的拮抗剂基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种NDRG3基因或蛋白的拮 抗剂的用途，用于制备预防或治疗前列腺癌的组合物。如本文所用，所述的NDRG3基因或蛋白的拮抗剂包括了抑制剂、下调剂、 阻滞剂、阻断剂等。所述的NDRG3基因或蛋白的拮抗剂是指任何可降低NDRG3蛋白的活性、 降低NDRG3基因或蛋白的稳定性、下调NDRG3蛋白的表达、减少NDRG3 蛋白有效作用时间、或抑制NDRG3基因的转录和翻译的物质，这些物质均可 用于本发明，作为对于下调NDRG3有用的物质，从而可用于预防或治疗前列 腺癌。例如，所述的拮抗剂是特异性干扰N-myc下游调节3型基因表达的小 干扰RNA分子或反义核苷酸；或是特异性与N-myc下游调节3型基因编码的 蛋白结合的抗体或配体。作为本发明的一种优选方式，所述的拮抗剂是一种NDRG3特异性的小干 扰RNA分子(siRNA)。如本文所用，所述的"小干扰RNA (small interfering RNA， siRNA)"是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA 为耙目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA千扰(RNA interference)过 程。作为本发明的特别优选的方式，提供了一种效果良好的小干扰RNA分子， 所述的小干扰RNA分子可特异性的干扰NDRG3基因的表达，与其它的人类核 酸序列没有显著的同源性；并且经验证，其具有良好的干扰NDRG3表达的效 果。所述的小干扰RNA分子是选自SEQIDNO: 7、 SEQ ID NO: 8、 SEQIDNO:9或SEQIDNO: IO所示小干扰RNA分子的一种或多种。更优选的，所述的小 干扰RNA分子是SEQ ID NO: 7、 SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 10所示小干扰RNA分子的组合分子；该组合分子中各小干扰RNA分子的比例 是(1-10): (1-10): (1-10): (1-10);较佳的是(l-5): (1-5): (1-5): (1-5);更佳的是(1國2): (1-2): (1-2): (1-2)。本发明对小干扰RNA的制备方法没有特别的限制，包括但不限于化学 合成法，体外转录法等。应理解，本领域技术人员在得知了本发明所提供的 siRNA的序列以后，可以以各种途径方便地制备或表达所述的小干扰RNA。例 如，在本发明的一种优选例中，所述的小干扰RNA是化学合成的。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义 链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。 一个双链RNA复合物可以由相互 分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化 学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。所述的小干扰RNA可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可 采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。此外，小干扰RNA包含的正义链和反义链可通过一个或多个编码正义链 和反义链的表达盒来制备。当正义链和反义链由一个单独的表达盒编码时，它 们可以从生成的转录物中断裂形成分离的正义链和反义链，其后杂交生成双链 小干扰RNA。检测前列腺癌的试剂或试剂盒基于本发明人的上述新发现，可以将NDRG3作为诊断前列腺癌的标志物 (i)进行前列腺癌的分型、鉴别诊断、和/或易感性分析；(ii)评估相关人群的 前列腺癌治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法；(iii)早期评 估相关人群前列腺癌患病风险，早期监测早期防治。比如，可分离出由NDRG3 基因表达异常而导致前列腺癌的人群，从而可进行更有针对性地治疗。因此，本发明提供了NDRG3基因或蛋白的用途，用于制备诊断(或检测)前 列腺癌的试剂或试剂盒。可釆用各种本领域已知的技术来检测NDRG3基因的存在与否以及表达情 况，这些技术均包含在本发明中。例如可用已有的技术如Southern印迹法、序列分析、PCR等，这些方法可结合使用。本发明还提供了用于在分析物中检测NDRG3基因的存在与否以及表达情况 的试剂。优选的，当进行基因水平的检测时，可以采用特异性扩增NDRG3的引 物；或特异性识另IJNDRG3的探针来确定NDRG3基因的存在与否；当进行蛋白水 平的检测时，可以采用特异性结合NDRG3编码的蛋白的抗体或配体来确定 NDRG3蛋白的表达情况。作为本发明的优选方式，所述的试剂是引物，其可特异性扩增出NDRG3 基因或基因片段。更优选的，所述的引物具有SEQIDNO: l和SEQIDNO:2所示 的序列。该引物扩增获得的扩增产物具有合适的长度，且特异性高，对于复杂体系 的扩增也具有良好的特异性。针对NDRG3基因的特异性探针的设计是本领域人员熟知的技术，例如，制备 一种探针，其可与NDRG3基因上特定位点发生特异性结合，而不与NDRG3基因以 外的其它基因特异性结合，且所述探针带有可检测信号。利用特异性结合NDRG3蛋白的抗体来检测分析物中NDRG3蛋白表达情况的方法也是本领域人员熟知的技术。本发明还提供了用于在分析物中检测NDRG3基因的存在与否以及表达情 况的试剂盒，该试剂盒包括特异性扩增N-myc下游调节3型基因的引物；特 异性识别N-myc下游调节3型基因的探针；或特异性结合N-myc下游调节3型 基因编码的蛋白的抗体或配体。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、 PCR、杂交、显色等所需 的各种试剂，包括但不限于抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、 洗液等。此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或核酸序列分析软件等。 药物筛选在得知了NDRG3的过表达可促进肿瘤细胞的生长，而抑制NDRG3的表达 可抑制肿瘤细胞的生长这一特征后，可以基于该特征来筛选抑制NDRG3的表达 或活性的物质。可从所述的物质中找到对于预防或治疗前列腺癌真正有用的药物。因此，本发明提供一种筛选抑制淀粉样蛋白产生的潜在物质的方法，所述 的方法包括用候选物质处理表达NDRG3的体系；和检测所述体系中NDRG3 的表达或活性；若所述候选物质可抑制NDRG3的表达或活性，则表明该候选 物质是预防或治疗前列腺癌的潜在物质。所述的表达NDRG3的体系较佳的是 细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达NDRG3的细胞； 或可以是重组表达NDRG3的细胞。例如所述的细胞选自前列腺癌细胞PC-3， DU145， CL-1或LNCaP。在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到NDRG3的表 达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质 的表达NDRG3的体系。作为本发明的优选方式，所述的方法还包括对获得的潜在物质进行进一 步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于预防或治疗前列腺癌真 正有用的物质。另一方面，本发明还提供了釆用所述筛选方法获得的预防或治疗前列腺癌 的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以 从中筛选出能够对于抑制NDRG3的表达和活性，进而预防或治疗前列腺癌有 用的物质。组合物本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.000001-50wt。/。；较佳的 0.0000l-20wt%;更佳的，0.0001-10wt%)的所述的NDRG3基因或蛋白的拮抗 剂，以及药学上可接受的载体。任何前述的NDRG3基因或蛋白的拮抗剂均可用 于组合物的制备。作为本发明的一种优选方式，提供了一种用于预防或治疗前列腺癌的组合 物，所述的组合物含有有效量的本发明所述的小干扰RNA分子，以及药学上可 接受的载体。作为本发明的一种优选方式，提供了一种用于预防或治疗前列腺癌的组合 物，所述的组合物含有有效量的NDRG3基因或蛋白的拮抗剂，以及有效量的 抗肿瘤药物溶瘤病毒(优选ZD55-IL24)。由于高表达NDRG3的肿瘤细胞比普 通肿瘤细胞具有更强的生命力，其抵抗肿瘤细胞的能力更强，因此在使用所述抗肿瘤药物的同时或之前使用所述的NDRG3基因或蛋白的拮抗剂来下调 NDRG3的表达或活性，可使得所述肿瘤细胞对抗肿瘤药物更敏感，从而达到 更理想的治疗效果。如本文所用，所述"有效量"是指可对人和/或动物产生功能或活性的且 可被人和/或动物所接受的量。所述"药学上可接受的载体"指用于治疗剂给 药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体它们本身 并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通 技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、 缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助 流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试 剂。在得知了所述NDRG3基因或蛋白的拮抗剂的用途后，可以釆用本领域熟知 的多种方法来将所述的拮抗剂或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动 物。包括但不限于皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释 给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将NDRG3的拮抗剂通 过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带NDRG3的拮 抗剂的表达单位(比如表达载体或病毒等，或siRNA)递送到靶点上，并使之表达 活性的NDRG3拮抗剂，具体情况需视所述的拮抗剂的类型而定，这些均是本领 域技术人员所熟知的。本发明所述的NDRG3基因或蛋白的拮抗剂的有效量可随给药的模式和待 治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术 人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于所 述的NDRG3基因或蛋白的拮抗剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半 衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给 药的途径等。通常，当本发明的NDRG3基因或蛋白的拮抗剂每天以约 0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0,0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予， 能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分 开的剂量，或将剂量按比例地减少。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建 议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。实施例1.细胞培养前列腺癌细胞株LNCaP细胞，PC-3， DU145, CL-1和前列腺永生化间质 细胞WPMY-1皆购自ATCC。LNCaP细胞培养在含5% FBS和100U/ml青链霉 素的DMEM培养基中。其他细胞株培养在含10% FBS和100U/ml青链霉素的 RPMI 1640培养基中。所有细胞均在37'C含5% (302培养箱中培养。实施例2. MPSS检测NDRG3在人体组织的表达提取各种人组织(见图1)总RNA，用生物素标记的寡核苷酸引物 (oligo-dT)将mRNA合成为cDNA双链；限制性内切酶Mbol (酶切位点为 GATC)消化cDNA片段，利用标记的生物素纯化消化的cDNA片段；合成包 含1.67 ><107个长为32 bp的寡核苷酸片段的标签载体；将纯化的cDNA片段克 隆入标签载体中，并通过标签载体上的PCR引物扩增插入片段。酶切消化PCR 产物，生成含cDNA片段与32 bp标签相连接的产物；通过tag和anti-tag杂 交连接将cDNA片断与微球体连接起来，每一个微球体上也可承载104-105个 相同的cDNA拷贝。进一步消化结合在微球体上cDNA模板，用不同寡核苷酸接头与连接在微 球体上的cDNA模板相连接，另外每一种接头的3'端还带有一个荧光标记，可 与荧光探针杂交，分别加入能产生红黄蓝绿杂交信号的四套荧光探针，进行杂 交用显微拍照的方法记录荧光信号，并将四种信号的图像输入计算机储存。MPSS检测结果NDRG3在前列腺和睾丸组织中分别有30 tpm(每百万个 转录本具有的转录本数)和92 tpm(图1A),其表达明显高于其他组织，这说明 NDRG3在前列腺中是一个特异表达基因。实施例3.半定量RT-PCR检测NDRG3在前列腺癌细胞中的表达 用Trizol试剂(Invitrogen)从各培养细胞(PC-3， DU145, CL-l， WPMY-1 和LNCaP)中提取总RNA，用Oligo-dT做引物和逆转录酶转录成cDNA，适当的稀释每个单链cDNA以进行随后的PCR扩增，用P -actin作为定量对照， 引物序列分别如下-NDRG3:正向(SEQIDNO: 1):5，- CtgCCtCCtgttC加CCC3CCt3 -3，,反向(SEQ ID NO: 2):5 '-ggcga3ttgtcccctaccacc3gt-3' <=P -actin:正向(SEQ ID NO: 3):5 ，-agaaaatctggcaccacacc-3'，反向(SEQ ID NO: 4):5 '-ctccttaatgtcacgcacga-3'。NDRG3的PCR条件是首先94t:变性10分钟；然后94°C30秒，55°C 30秒，72°C l分钟共26个循环；最后72'C延伸5分钟。e -actin的PCR条件是首先94"C变性10分钟；然后94°C30秒，55°C 30秒，72°C l分钟共25个循环；最后72t:延伸5分钟。结果如图1B， NDRG3 mRNA在5种细胞中都有表达，在CL-1细胞中表 达量多，而在WPMY-1细胞中表达量少。实施例4. Western blot检测NDRG3蛋白在前列腺癌细胞的表达提取前列腺癌细胞的蛋白质，分别取等质量的五种细胞的总蛋白加1/4体 积的4X样品缓冲液于100'C煮5分钟，使其变性。12%的SDS-PAGE分离样 品；电转移至硝酸纤维素膜；用0.05%的PBS-T[137mmol/LNaCl， 2.7 mmol/L KC1， 10mmol/LNa2HPO4， 2mmol/L KH2P04， 0.05% Tween20 (pH 7.4)]配置 的5。/J兑脂奶粉37t:封闭1小时；0.05%的PBS-T洗膜5分钟X3次。 一抗山 羊抗NDRG3多克隆抗体(l: 200)37'C孵育2小时；洗膜15分钟X3次；二抗 兔抗山羊IgG-HRP(l: 2000)37。C孵育1小时；0.05%的PBS-T洗膜15分钟x3 次；加入ECL显影液室温放置3分钟，压片于暗盒中曝光。显影、定影、读片。结果如图1B， NDRG3蛋白在LNCaP、 CL-1、 DU145和PC3有较高水平 的表达，而在WPMY-1中表达量低。将LNCaP细胞培养在含10。/。石碳粉过滤得FBS的培养液中。48小时后， 加入10nMR1881。分别在此24和48小时后收集细胞，并按前述的方法制备 样品，通过半定量RT-PCR与Western blot技术检测NDRG3的表达。结果如图 1C,表明NDRG3的表达可以被雄激素类似物R1881显著上调。实施例5.免疫组化检测前列腺癌组织芯片中NDRG3的表达带有前列腺癌组织和BPH样本的芯片购自陕西超英生物技术有限公司。 3% 11202室温处理IO分钟。蒸馏水洗涤2分钟x3次，以消除内源性过氧化物 酶的活性；蒸馏水冲洗，PBS(PH7.4)浸泡5分钟；抗原修复，将切片放入一定 量的10mM柠檬酸盐缓冲液中(PH6.0)，于微波修复加热至沸腾18分钟后离开 热源，室温放置20分钟自然冷却，PBS(PH7.4)洗3次，每次5分钟；(5)滴加 正常的兔血清封闭液，室温20分钟甩掉封闭液，勿洗；滴加山羊抗NDRG3多 克隆抗体(l: 50)， 4。C孵育过夜。PBS冲洗，15分钟x3次；滴加生物素化兔抗 山羊IgG， 37'C孵育15分钟，PBS洗2分钟x3次；滴加生物素亲和素过氧化 物酶复合物，37。C孵育15分钟，PBS冲洗5分钟x4次；DAB显色室温显 色，镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤；苏木素轻度复染。脱水，透明，封片； 显微镜观察，显示棕黄色颗粒者为阳性。根据对组织芯片结果的最后统计发现，NDRG3在前列腺癌样本中的表达 率为58.6% (41/70)，而BPH样本只有13.2%，两者差异明显。部分表达NDRG3 的前列腺癌样本或BPH样本的染色结果如图2所示。实施例6.表达载体的构建 用下述引物扩增NDRG3全长编码序列， 正向(SEQ ID NO: 5):GATCGGATCCGCCACCATGGATGAACTTCAGG; 反向(SEQ ID NO: 6):TAGAAAGCTTGGGCAGGACACCTCCATG;产物经处理后插入到pcDNA3.1/myc-His(-)B (Invitrogen)的BamH I和 Hind m位点，通过测序确定构建体，称为pcDNA3.1/myc-His(-)B/NDRG3。实施例7.稳定转染细胞株的建立和对细胞的影响1. 对肿瘤细胞生长的影响按照 Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 的说明书操作，将 pcDN A3.1 /my c-His(-)B/NDRG3重组表达质粒转染PC-3细胞，4小时后换含10。/。 FBS无抗生素的RPMI1640新鲜培养液继续培养；24小时后换含10% FBS和 100U/ml青链霉素的RPMI1640新鲜培养液；再过24小时换含0.4mg/ml G418、 10% FBS和100U/ml青链霉素的RPMI1640新鲜培养液筛选培养；挑选单克隆 (PN3， PN5和PN10)扩大培养，Western blot鉴定。此外，本发明人还通过转 染空载体建立了这些克隆的阴性对照住克隆PNK。Western blot分析结果显示，稳定转染NDRG3的细胞株PN3， PN5和PN10 比普通的PC-3细胞NDRG3蛋白的表达水平显著提高(图3A)。转染后培养l-5天，观察细胞的生长情况，结果显示，NDRG3能够显著促 进肿瘤细胞的增长率(图3B)。2. 对肿瘤细胞迁移的影响转移性强是肿瘤恶性程度的一个重要标记。本发明人通过创伤修复实验研 究了NDRG3的表达对肿瘤细胞迁移的影响。当PN3、 PNIO， PC-3和阴性对照 PNK在培养碟中的生长达到完全饱和时，用一个微量移液器用的枪头在培养孔 中划出一条"道"，并完全清除其中所有的细胞。此外，更换培养液以除去悬 浮细胞。IO小时后，本发明人发现，和PC-3和PNK等阴性对照相比，迁移进 入"道"中的PN3、 PN10细胞明显增加，说明NDRG3能够增强肿瘤细胞的迁 移性(图3C)。实施例8.裸鼠肿瘤生成试验NDRG3过表达的细胞株PN3、 PN10和阴性对照PNK和PC-3细胞在指数 生长期收获，重悬于无血清的RPMI 1640中，接种于5周龄雄性BALB/C裸鼠 的背侧部，lOOial每只，裸鼠两侧分别接种NDRG3过表达的PN3或PN10细胞 和阴性对照细胞，每6天用游标卡尺测量肿瘤的长和宽，肿瘤体积V二(长X宽,/2 。
注射后18-48天的肿瘤体积如图3D所示，表明NDRG3过表达在裸鼠模型 上促进肿瘤形成。
实施例9. NDRG3-siRNA对CL-1细胞生长和克隆形成的影响 CL-1细胞用4种NDRG3-siRNA寡核苷酸(Dharmacon， Lafayette， CO)混 合物(以按照摩尔比1:1:1:1混合)转染，它们的序列为 GAUCAAACCACUUCUAAAU (SEQ ID NO: 7); AAACAGACCAGUUAUACUA (SEQ ID NO: 8); GCUAAAGGCUGGAUUGACU (SEQ ID NO: 9);禾口 CGCCUGAACCCUAUAAAUA (SEQ ID NO: 10)。
阴性对照为绿色荧光蛋白siRNA(GFP-siRNA)，它们的序列为 CGCUGACCCUGAAGUUCAUUU (SEQ ID NO: 11);或 GAGACCUGCUGAACACAAUU (SEQ ID NO: 12)。
按照TransMessenger Transfection Reagent (Qiagen， Hilden， Germany)说 明书操作。CL-1细胞转染NDRG3-siRNA和阴性对照后48小时，铺到24孔 板，每孔300个细胞，继续培养14天，形成的克隆用4%甲醛固定，0.2%的 结晶紫染色。
结果显示，NDRG3-siRNA组的NDRG3蛋白表达量明显低于GFP-siRNA 组(图4A)。
并且，转染NDRG3-siRNA后，CL-1细胞生长速度下降(图4B和图4D); 并且，CL-1细胞转染NDRG3-siRNA后形成的克隆数明显少于对照组 GFP-siRNA (图4C);
因此，降低NDRG3的表达可以抑制肿瘤的生长和克隆形成。
实施例10. ZD55-IL24对PC3细胞的杀伤性及其受NDRG3影响的研究 在96孔板每个孔中分别加入2万个普通PC细胞，PNK克隆，PN3和PN5 克隆。24小后再分别加入不同量(MIO1-MIO100)的溶瘤病毒ZD55-IL24(获自 中国科学院上海生命科学研究院，可杀死肿瘤细胞)。在本研究中，病毒加入后72小时，对存活细胞进行计数。坐标纵轴代表存活细胞数；坐标横轴代表溶瘤 病毒用量。将最初加入的细胞量设置为100%。
结果如图5所示，可见溶瘤病毒ZD55-IL24能有效杀死PC-3前列腺癌细 胞。在同样的ZD55-IL24用量(MIO100)的条件下，过量表达NDRG3的PC-3 细胞(PN3和PN10)的存活率比对照组(PNK)高出3-4倍。这充分说明过量表达 NDRG3的PC-3前列腺癌细胞能明显的抵抗ZD55-IL24的作用。
实施例11.药物筛选
细胞模型稳定转染了 pcDNA3.1/myc-His(-)B/NDRG3的PC3细胞(制备方 法见实施例6和7)，其中表达NDRG3蛋白。
测试组用候选物质处理的上述细胞的培养物； 对照组不用候选物质处理的上述细胞的培养物。
如果与对照组相比，测试组中的NDRG3蛋白的表达显著下降50%以上， 则说明该候选物质是潜在的预防前列腺癌的物质。
釆用上述方法，将由SEQ ID NO: 7-10(等量混合)的siRNA(候选物质1)， 以及SEQ ID NO: 11-12(等量混合)的siRNA(候选物质2)作为候选物质，转染所 述细胞模型。结果发现，候选物质1是预防前列腺癌的物质；而候选物质2没 有作用。
实施例12.组合物
将各5 nmol的SEQ ID NO: 7-10的siRNA加入到500 u 1纯水中，或也可 加入到500" 1常规溶解缓冲液中，配制成含siRNA的组合物。
实施例13.检测试剂盒
一种检测前列腺癌的试剂盒，该试剂盒中含有 容器1，以及装于该容器中的SEQ ID NO: 1所述序列的引物1; 容器2，以及装于该容器中的SEQIDNO:2所述序列的引物2; 以及，其它一些容器，其中分别装有dNTP; DNA聚合酶；MgCl: 以及，说明检测方法的适用说明书。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。序列表
<110>上海市计划生育科学研究所；
中国科学院上海生命科学研究院； 浙江大学
<120> —种前列腺癌相关的基因及其用途 <130> 084386 <160> 12
<170〉 Patentln version 3. 3
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ctgcctcctg ttcttaccca ccta 24
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gagaccugcu gaacacaauu
权利要求
1.一种N-myc下游调节3型基因或蛋白的拮抗剂的用途，用于制备预防或治疗前列腺癌的组合物。
2. 如权利要求l所述的用途，其特征在于，所述的拮抗剂选自特异性干扰N-myc下游调节3型基因表达的小干扰RNA分子或反义核苷 酸；或特异性与N-myc下游调节3型基因编码的蛋白结合的抗体或配体。
3. 如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的小干扰RNA分子是 SEQ ID NO: 7所示核苷酸序列的小干扰RNA分子；SEQ ID NO: 8所示核苷酸序列的小干扰RNA分子；SEQ ID NO: 9所示核苷酸序列的小干扰RNA分子；和/或SEQ ID NO: 10所示核苷酸序列的小干扰RNA分子。
4. 一种用于预防或治疗前列腺癌的小干扰RNA分子，其特征在于，所述 的小干扰RNA分子选自SEQ ID NO: 7所示核苷酸序列的小干扰RNA分子； SEQ ID NO: 8所示核苷酸序列的小干扰RNA分子； SEQ ID NO: 9所示核苷酸序列的小干扰RNA分子；和/或 SEQ ID NO: 10所示核苷酸序列的小干扰RNA分子。
5. —种预防或治疗前列腺癌的组合物，其特征在于，所述的组合物含有(1) 有效量的N-myc下游调节3型基因或蛋白的拮抗剂，以及(2) 药学上可接受的载体。
6. 如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述的组合物还含有有效量 的以下抗肿瘤药物溶瘤病毒。
7. —种筛选预防或治疗前列腺癌的潜在物质的方法，所述方法包括(1) 用候选物质处理表达N-myc下游调节3型基因的体系；和(2) 检测所述体系中N-myc下游调节3型基因的表达或活性；其中，若所述候选物质可降低N-myc下游调节3型基因的表达或活性，则 表明该候选物质是预防或治疗前列腺癌的潜在物质。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(l)包括在测试组中， 将候选物质加入到表达N-myc下游调节3型基因的体系中；和/或步骤(2)包括检测测试组的体系中N-myc下游调节3型基因的表达或活 性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达N-myc 下游调节3型基因的体系；如果测试组中N-myc下游调节3型基因的表达或活性在统计学上低于对照 组，就表明该候选物是预防或治疗前列腺癌的潜在物质。较佳的，所述的体系是细胞体系。
9. 一种特异性识别N-myc下游调节3型基因或其编码的蛋白的试剂的用 途，用于制备检测前列腺癌的试剂或试剂盒。较佳的，所述的特异性识别N-myc下游调节3型基因或其编码的蛋白的试剂选自特异性扩增N-myc下游调节3型基因的引物； 特异性识别N-myc下游调节3型基因的探针；或 特异性结合N-myc下游调节3型基因编码的蛋白的抗体或配体。 较佳的，所述的特异性扩增N-myc下游调节3型基因的引物具有SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示的序列。
10. —种检测前列腺癌的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有特 异性识别N-myc下游调节3型基因或其编码的蛋白的试剂。
全文摘要
本发明公开了一种前列腺癌相关的基因及其用途，所述的基因是N-myc下游调节3型基因(NDRG3)。NDRG3在前列腺腺癌组织中高表达，其过量表达可促进前列腺癌细胞增殖，并降低前列腺癌细胞的生物治疗的效果。降低NDRG3蛋白的表达可明显抑制前列腺癌细胞的生长。因而，NDRG3可作为新的前列腺癌诊断或治疗的靶分子。
文档编号A61K39/395GK101632833SQ200810040989
公开日2010年1月27日 申请日期2008年7月25日 优先权日2008年7月25日
发明者刘新垣, 扬 李, 李润生, 李玉华, 林标扬, 王伟群, 范钧锴, 顾锦法 申请人:上海市计划生育科学研究所;中国科学院上海生命科学研究院;浙江大学