专利名称：白色念珠菌分子伴侣基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，更具体地涉及从白色念珠菌的分子伴侣基因CaCDC37、其编码蛋白CaCdc37及用途。
背景技术：
白色念珠菌(Candida albicans)是一种人类致病真菌，能进行酵母和菌丝形态的转变，它的致病性与菌丝的形成密切相关，菌丝状态的白色念珠菌更容易粘附和侵入上皮和内皮细胞层，加重感染(1 Lo，Kohler J，Didomenico B，Loebenberg D，Cacciapuoti A，Fink G R.Nonfilamentous C.albicans mutants areavirulent.Cell，1997，90939-949)。近年来，由于人口老龄化以及免疫抑制剂的使用，白色念珠菌引起的疾病越来越多，在各类由真菌引起的疾病中上升到第二位。因此，对白色念珠菌形态变化的研究越来越得到重视。
到现在为止，在白色念珠菌中已发现了多条重要的信号转导途径与其形态转变有关，包括MAPK(mitogen-activated protein kinase)途径(Kohler，Fink G R.Candida albicans strains heterozygous and homozygous for mutations in mitogen-activated protein kinase signaling components have defects in hyphal development.Proc Natl Acad Sci USA，1996，9313223-13228；Liu，Kohler J，Fink G R.Suppression of hyphal formation in Candida albicans by mutation of a STE12homolog.Science，1994，2661723-1726)，以及cAMP/PKA(protein kinase A)途径(Feng Q H，Summers E，Guo B，Fink G R.Ras singnaling is required for Serum-induced hyphal differentiation in Candida albicans.Journal of Bacteriology，1999，181，206339-6346)。近年来的研究发现，细胞周期蛋白(cyclin)(Jonathan D J，Loeb，Marisa S B，Idit H，Liu.A G1 cyclin is necessary for maintenance offilamentous growth in Candida albicans.Mol and Cell Biol，1999，194019-4027)，分子伴侣复合体(Felicitas R，Verena K，Volker R，Stoldt R，Joachin F.Candidaalbicans chaperonin subunit(CaCct8p)as a suppressor of morphogenesis and Rasphenotypes in C.albicans and Saccharomyces cerevisiae.Microbiology，1998，1442951-2960)也参与调控白色念珠菌形态转变。这些蛋白质可能通过相互作用，形成一个复杂的网络体系。
研究人员曾经克隆了一个编码CDC2相关蛋白质激酶基因CRK1(Wang Q，Zhou S，Chen J Y.Functions of CRK1 Gene of Candida albicans as studiedby gene knock-out. Acta Biochimica et Biophysica Sinica，1999，31(5)545-552；Chen J，Zhou S，Wang Q，Chen X，Pan T，Liu H.2000.Crk1，a novelCdc2-related protein kinase，is required for hyphal developmentand virulence in Candida albicans.Mol.Cell Biol.2000Dec；20(23)8696-708)。功能研究表明，CRK1可以促进白色念珠菌以及啤酒酵母的菌丝生长。这种促进作用不依赖于MAPK途径，而且Crk1 N端激酶活性区对菌丝生长的促进作用比全长蛋白质更强。CRK1基因敲除的白色念珠菌不能形成菌丝，系统感染小鼠没有毒性。
Cdc37是普遍存在于从酿酒酵母到人的各个物种，目前的研究表明，Cdc37是特异地参与激酶成熟的分子伴侣，识别激酶的活性区域并与之结合，然后募集Hsp90，帮助激酶正确折叠。Cdc37参与了多种重要蛋白激酶的成熟过程，比如酵母的Cdc28(Farrell A，Morgan DO.2000.Cdc37 promotes thestability of protein kinases Cdc28 and Cak1.Mol.Cell.Biol.20749-754)，人类的Cdk9(O’Keeffe B，Fong Y，Chen D，Zhou S，Zhou Q.Requirement for a kinase-specific chaperone pathway in the productionof a Cdk9/cyclin T1 heterodimer responsible for P-TEFb-mediated tatstimulation of HIV-1 transcription.J Biol Chem. 2000 Jan7；275(1)279-87)等等。它对细胞的正常生理功能有重要作用，在酿酒酵母中，CDC37敲除株不能存活，单个位点的突变会造成温度敏感表型，如cdc37-34。
综上所述，鉴于白色念珠菌引起的疾病越来越多，因此本领域迫切需要开发与白色念珠菌致病性有关的基因和蛋白。
发明内容
本发明的目的是提供一种参与白色念珠菌致病作用的新的白色念珠菌分子伴侣基因及其编码蛋白。
本发明的另一目的是提供该多肽及其编码序列的用途。
在本发明的第一方面，提供了一种分离出的CaCdc37多肽，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个(1-15个，较佳地1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有互补酿酒酵母cdc37-34突变株的温度敏感表型的功能和具有参与Crk1的折叠与成熟功能的由(a)衍生的多肽。
在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少80％相同性(a)编码上述白色念珠菌CaCdc37多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是具有SEQ ID NO1中1-1527位的序列。
在本发明的第三方面，提供了含有本发明所述的多核苷酸的载体。
在本发明的第四方面，提供了一种能与本发明所述的白色念珠菌CaCdc37蛋白特异性结合的抗体。
图1A显示了白色念珠菌CaCDC37基因的核苷酸序列及其推导蛋白的氨基酸序列图1B显示了白色念珠菌CaCDC37基因的物理图谱图1C显示了白色念珠菌CaCdc37与其他物种Cdc37蛋白的同源性比较图1D显示了利用PCR获得CaCDC37基因片断，长度为1.5kb。
图1E显示了CaCDC37基因在不同生长条件下的表达情况，1，YPD，30℃；2，YPD+Serum，37℃。转录本长度约为2kb。
图2A显示了利用酵母双杂交膜反应检测CaCdc37与Crk1及Crk1N端激酶区域的相互作用。
图2B显示了利用免疫共沉淀检测CaCdc37与Crk1及Crk1N端激酶区域的相互作用。
图3显示了CaCdc37的外源表达回复酿酒酵母cdc37-34突变株的温度敏感表型，使其在37℃下恢复生长。
图4显示了CaCdc37参与Crk1表达的成熟与稳定。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，利用LexA酵母双杂交系统，以Crk1N端激酶区域为诱饵，筛选白色念珠菌基因组表达文库，获得一个其编码产物能与Crk1N端有特异性相互作用的基因片段NJN1，序列分析表明，NJN1是CDC37家族在白色念珠菌中的同源基因。然后，本发明人首次克隆和分离了白色念珠菌中CDC37同源基因CaCDC37。CaCdc37能够回复酿酒酵母cdc37-34突变株的温度敏感表型。通过酵母双杂交与免疫共沉淀试验，证明它与白色念珠菌Cdc2相关蛋白激酶Crk1的激酶结构域存在相互作用。CaCDC37能转录出约2kb的转录本，呈组成型表达，其表达不受白色念珠菌生长环境的影响。实验证明CaCdc37参与Crk1的折叠成熟，表明CaCdc37参与白色念珠菌的致病作用。
在本发明中，术语“CaCdc37蛋白”、“CaCdc37多肽”或“白色念珠菌CaCdc37多肽”可互换使用，都指具有白色念珠菌CaCdc37氨基酸序列(SEQ IDNO2)的蛋白或多肽。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的白色念珠菌CaCdc37蛋白或多肽”是指白色念珠菌CaCdc37多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化白色念珠菌CaCdc37蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
在本发明中，术语“白色念珠菌CaCdc37多肽”指具有白色念珠菌CaCdc37蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与白色念珠菌CaCdc37蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括白色念珠菌CaCdc37蛋白的活性片段和活性衍生物。
在本发明中，“白色念珠菌CaCdc37蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO2的蛋白质，但与SEQ ID NO1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％，最佳地至少90％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码白色念珠菌CaCdc37蛋白的多聚核苷酸。
本发明的白色念珠菌CaCdc37核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的DNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的DNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或白色念珠菌CaCdc37蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；2241431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的CaCDC37多肽。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码白色念珠菌CaCdc37多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，白色念珠菌CaCdc37多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含白色念珠菌CaCdc37编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的白色念珠菌CaCdc37蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)用于筛选促进或对抗白色念珠菌CaCdc37蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组白色念珠菌CaCdc37蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激白色念珠菌CaCdc37蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本发明还包括对白色念珠菌CaCdc37 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于白色念珠菌CaCdc37基因产物或片段。较佳地，指那些能与白色念珠菌CaCdc37基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的白色念珠菌CaCdc37基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达白色念珠菌CaCdc37蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。
抗白色念珠菌CaCdc37蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的白色念珠菌CaCdc37蛋白。
利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与白色念珠菌CaCdc37蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。
本发明还涉及定量和定位检测白色念珠菌CaCdc37蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的。
一种检测检测样品中是否存在白色念珠菌CaCdc37蛋白的方法是利用白色念珠菌CaCdc3蛋白的特异性抗体进行检测，它包括将样品与白色念珠菌CaCdc37蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在白色念珠菌CaCdc37蛋白。
在本发明的一个实施例中，以白色念珠菌毒性因子Crk1为诱饵，利用双杂交技术筛选其靶蛋白，从白色念珠菌双杂交文库中克隆到一个分子伴侣蛋白基因CaCDC37。CaCDC37基因全长由1527个核苷酸组成，编码一个508个氨基酸的蛋白。该蛋白与其他物种的分子伴侣蛋白Cdc37都有较高的同源性。实验表明，CaCDC37转录成约2kb长的转录本，在白色念珠菌中呈组成型表达，不受菌丝诱导条件的影响，说明其对白色念珠菌生长有重要作用。此外，CaCdc37可以互补酿酒酵母cdc37-34突变株的温度敏感表型，说明具有Cdc37的功能。CaCdc37能与白色念珠菌毒性因子Crk1相互作用，并且参与Crk1的折叠与成熟，这提示CaCdc37参与白色念珠菌的致病作用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1CaCDC37基因的克隆(1)材料限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Klenow酶均购自美国Gibco BRL公司；消解酶(Zymolyase 100T)购自日本Seikagaku公司；RNaseA为华美公司的粗产品；β-巯基乙醇(β-mercapto-ethanol)，酸洗玻璃珠(425～600μm)均购自Sigma公司，胶回收试剂盒，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)购自美国Promega公司。
菌种酵母EGY48(MATα trp1 ura3 his3 leu2 LexAop(×6)-LEU2)(购自Clontech公司)。
(2)方法白色念珠菌双杂交文库的构建抽提白色念珠菌染色体DNA，用Sau3AI进行部分酶解，控制酶量，使酶切所得片段主要分布于1～2kb之间，用QiagenII试剂盒回收及纯化1～2kb DNA，溶于TE(pH 8.0)中。用Klenow片段修补缺口。取pB42AD(购自Clontech公司)以XhoI完全酶解，用Klenow片段修补缺口，乙醇沉淀，溶于TE(pH8.0)，使pB42AD产生与染色体DNA互补的缺口，将pB42AD与加工后的染色体DNA连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌XL1-Blue，得到AD融合的表达型质粒文库。收集LB-Amp平板上的大肠杆菌，-70℃冷冻保存。取3×106个细胞，涂于300个LB-Amp平板上，37℃生长16h，收集菌落，抽提质粒，得到扩增的文库。
酵母转化子β-半乳糖苷酶活性的检测取一张Whatman滤纸，覆盖于相应的选择性培养基上(碳源为半乳糖)，用灭菌牙签从选择性培养基平板上挑取酵母转化子菌落(直径1～2mm)点到滤纸上，30℃培养2天，然后取出小心浸入液氮中(菌落面朝上)，约0.5min后取出，置室温几分钟，将滤纸(菌落面朝上)放于用Z缓冲液/X-gal溶液，30℃培养0.5～8h，检验菌落是否显蓝色。8h内显蓝色的菌落β-半乳糖苷酶活性为阳性。
阳性克隆中文库质粒的分离抽提阳性克隆酵母质粒DNA。按分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)的方法制备供电击用的大肠杆菌DH5α感受态细胞，取1μl酵母质粒DNA抽提液与40μl置于冰上的感受态细胞混合，然后移入0.1cm电击杯进行电击。电击参数为2.4kV，200Ω，25μF。用EcoRI、BamHI双酶切鉴定含文库质粒的转化子。
序列测定，查询与比较DNA序列由基康公司测定，DNA序列的翻译和酶切位点分析，二级结构预测等利用DNA Star软件来完成；同源性比较查询通过NCBI(National CenterBiotechnology Information)网络服务完成，检索的数据库包括Stanford的微生物基因组序列库，GenBank等。
结果本发明人通过LexA酵母双杂交系统，以Crk1N端激酶区域(含370个氨基酸)作为诱饵，筛选白色念珠菌双杂交文库，获得一个基因片段NJN1，序列测定分析表明，NJN1与CDC37基因同源，编码一个482个氨基酸的蛋白片段，通过微生物基因组序列数据库检索，分析拼接白色念珠菌核苷酸序列，获得了该全长基因，并推导了它的蛋白序列(图1A)，该基因全长1527bp(SEQ ID NO1)，编码一个508个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO2)，NJN1编码其C端的482个氨基酸(图1B)。
氨基酸序列比较表明，它与酿酒酵母Cdc37蛋白同源性高达41％，而且与其他物种的Cdc37也有较高同源性(与裂殖酵母的Cdc37同源性35％，与果蝇的Cdc37同源性26％，与人的Cdc37同源性20％)。它的N端存在一个60个氨基酸的保守区域，这一区域在各个物种的Cdc37蛋白之间同源性高达80％以上(图1C)。基于序列上的同源性，该基因被命名为CaCDC37。
实施例2PCR获得CaCDC37的全长编码序列根据CaCDC37的全长序列，设计和合成两条引物引物1ATGCCAATAGATTACTCCAAGT(SEQ ID NO3)引物2TTAATCAACTGTATCTTCAACT(SEQ ID NO4)以抽提的白色念珠菌染色体DNA为模板，按常规条件进行PCR扩增，获得了长度为1.5kb的扩增产物。并对扩增产物进行了序列测定，结果证实扩增产物的序列与SEQ ID NO1相符。
实施例3CaCDC37的表达利用Northern杂交检测CaCdc37在普通生长条件与菌丝诱导生长条件下的表达情况，抽提白色念珠菌RNA，电泳，利用毛细法转膜，转膜液用15-20×SSC。转膜过夜后，取出膜，不能使膜干透，用Bio-Rad GS Gene Linker C3protocol紫外交联，加入10ml预杂交液，42℃，2h后更换为10ml杂交液，加入探针42℃杂交过夜。用1×SSC，0.1％SDS，42℃洗膜两次，每次30min。杂交好的膜不要晾干，用保鲜膜包好后-70℃压片。具体方法按照Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)。
结果在本实施例中检测了CaCDC37在白色念珠菌中的表达情况，并且检测了在酵母形态生长条件(30℃，YPD)与菌丝生长条件(37℃，YPD+血清)下CaCDC37的表达变化，结果表明，CaCDC37的表达在酵母形态生长条件与菌丝生长条件下的表达没有显著差异(图1E)，这说明CaCDC37是一个组成型表达的基因，为白色念珠菌的正常生理活动所需要。
实施例4CaCdc37与Crk1相互作用LexA抗体，HA抗体及第二抗体均购自Santa Cruz公司，荧光检测试剂购自Pierce公司。首先利用β半乳糖苷酶活性反应检测Crk1与CaCdc37相互作用，方法如实施例1所述。之后以免疫共沉淀德方法检测相互作用，酵母细胞接种于基本培养基中，生长至A600为0.8-1.0，每50ml菌液离心，以无菌水洗涤，再以0.6ml裂解液(50mmol/L Tris-HCl，pH7.5；50mmol./L NaCl；10％甘油；1mmol/L EDTA；0.5％NP-40；2mmol/L DTT；2mmol/L苯扎嘧啶；1mmol/LPMSF；2mg/L胃蛋白酶抑制剂；2mg/L亮抑制肽；4mg/L抑蛋白酶肽；2mg/L木瓜蛋白酶抑制剂；10mmol/L NaF；25mmol/L Na-PPi)洗涤一次，悬浮于0.35ml裂解液中，加入0.6ml酸处理的玻璃珠，4℃下剧烈振荡6次，每次30s，间歇30s，离心15min，上清再离心15min，上清测蛋白质浓度。-20℃保存。利用Anti-HA抗体免疫沉淀HA融合蛋白，利用Anti-LexA抗体检测LexA-CaCdc37融合蛋白是否被免疫沉淀，验证了CaCdc37与Crk1的相互作用，具体方法按照Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)结果本实施例中，先通过双杂交系统验证了CaCdc37蛋白与Crk1的相互作用。结果发现CaCdc37与Crk1N端激酶区域存在较强的相互作用，与Crk1的C端区域不存在相互作用，而与全长Crk1蛋白有较弱的相互作用(图2A)，推测CaCdc37识别裸露的激酶活性区并且与之结合，当C端蛋白被翻译后它覆盖了激酶结构域，使其与CaCdc37的相互作用减弱。
进一步利用免疫共沉淀的方法确定了它们之间的相互作用。结果表明CaCdc37能够与Crk1N端激酶区域和Crk1全长蛋白免疫共沉淀，但是不能与Crk1C端区域共沉淀(图2B)，该结果与双杂交试验的结果吻合。
实施例5CaCdc37回复酿酒酵母cdc37-34温度敏感表型Cdc37-34突变株8A7来自Geneve大学Picard教授实验室(Dey B，Lightbody JJ，Boschelli F.1996.CDC37 is required for p60v-src activityin yeast.Mol.Biol.Cell 71405-1417.)，在8A7中表达CaCdc37，使其分别在25℃与37℃下培养，观察生长情况。
结果在本实施例中，测试了CaCDC37能否回复酿酒酵母cdc37突变株的温度敏感表型。酿酒酵母中cdc37的完全缺失是致死的，cdc37-34是酿酒酵母Cdc37的突变株，在Cdc37的N端存在一个点突变，使菌株表现出温度敏感表型，在37℃时无法生长，而在25℃时正常生长。实验证明，在cdc37-34中外源表达CaCdc37能够回复其温度敏感表型，使菌株在37℃下恢复生长(图3)。这表明CaCdc37能互补酿酒酵母Cdc37的功能。
实施例6CaCdc37参与Crk1的成熟在野生型酿酒酵母，cdc37-34突变株以及含有CaCdc37的cdc37-34突变株中分别表达HA-Crk1，利用Western检测HA-Crk1的表达水平。具体步骤按照Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)进行。
结果Cdc37作为一种分子伴侣，主要参与激酶的成熟与折叠，提高蛋白的稳定性。为了研究CaCdc37对Crk1表达的作用，本实施例中分别在野生型酿酒酵母，cdc37-34突变株以及外源表达CaCdc37的cdc37-34菌株中表达HA融合的Crk1，通过抗HA抗体检测Crk1的表达情况。结果表明，在25℃非限制性条件下，Crk1在三种菌株中的表达量基本相同，而在37℃限制条件下，cdc37-34中Crk1的表达量大大减少，说明在Cdc37功能缺陷情况下，Crk1表达蛋白的稳定性降低，易被降解，而CaCdc37的存在使细胞中Crk1的稳定性增加，蛋白含量恢复到野生型的水平(图4)，说明CaCdc37参与了Crk1的成熟，提高了Crk1的稳定性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>中国科学院上海生命科学研究院<120>白色念珠菌分子伴侣基因及其用途<130>027885<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1527<212>DNA<213>白色念珠菌(Candida albicans)<400>1atgccaatag attactccaa gtgggataag atagaaattt ctgatgattc tgatgtggaa 60gttcatccaa atgtcgataa acaatcattt atcagatgga agcaacgtga tattcatgaa 120aaaagaatgc aaagaaacat tgaaatcaag agtattttga tccaattgac catgtatgct 180aagcttaacg aaagggtcga ctatttgttg gaaaagttaa catccactga attattggat 240agtgaaaaag tcatgtcaaa gttgaattca gaatttgatc ctcaagaaaa attcgattat 300gataaattga ttaaagacaa gggtctgacc ttgagaaaag gattgaaaga tttgaaattc 360gatagagaag agattgaaaa tactccttgc tataatgaaa tgattgaaga tttgtttgtt 420caaatcaagg atgatcatcc agagacaaaa accgatggcg acaaattgat tgaatactta 480aaagaacata gaaacaggat cgacgatgtt ttgtctaaac agactataaa attggatgat 540ttattgtacc agaaagctca attgatagta agtgatgatt tgcatacggg gtttgataga 600tcatttttaa ataaagataa accagaggaa aaagaagaaa atcaagataa accaaaagct 660ccagaagcta aaaagacaac tgttactaca actgaaacta tcaatctgcc aaaaccagtt 720gaagaaaaca ctgataaaga aatcttggat gaattggaaa tcttgcctgc cactaaagaa 780tttgccaaaa tacccagtga caatctttca aaagcagctg aattcttgat taaacatcct 840tcaatatgta ctgagcaaca aaaagacgct ttaataatga cggcatttga ccttcaattg 900gaaaacaaat ctgatgaagc taaacatatt gtccaccaat cattattatt acaatacgtt 960ggccaattat cagataacgg taaagcagca ccagctaatg tgataaatgc tatcaagtta 1020
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<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<222>(1)..(22)<223>引物<400>4ttaatcaact gtatcttcaa ct 2权利要求
1.一种分离的白色念珠菌CaCdc37多肽，其特征在于，该多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有互补酿酒酵母cdc37-34突变株的温度敏感表型的功能和具有参与Crk1的折叠与成熟功能的由(a)衍生的多肽。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，它具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组(a)编码如权利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列具有SEQID NO1中1-1527位。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
7.一种能与权利要求1所述的白色念珠菌CaCdc37蛋白特异性结合的抗体。
全文摘要
本发明提供了一种参与白色念珠菌致病作用的新的白色念珠菌分子伴侣基因CaCDC37及其编码蛋白CaCdc37。本发明还提供了所述蛋白及其编码序列的用途。CaCDC37在白色念珠菌中呈组成型表达。CaCdc37具有Cdc37的功能，可互补酿酒酵母cdc37－34突变株的温度敏感表型。CaCdc37能与白色念珠菌毒性因子Crk1相互作用，并且参与Crk1的折叠与成熟，这提示CaCdc37参与白色念珠菌的致病作用。
文档编号C07K14/40GK1511845SQ0216057
公开日2004年7月14日 申请日期2002年12月30日 优先权日2002年12月30日
发明者陈红野, 倪坚 申请人:中国科学院上海生命科学研究院