在植物中赋予胁迫耐受性的基因及其用途的制作方法

专利名称：在植物中赋予胁迫耐受性的基因及其用途的制作方法
技术领域：
一般地，本发明涉及用于对植物赋予胁迫(stress)耐受性的组合物和方法，包括多核苷酸、多肽、载体和宿主细胞。一般地，本发明还涉及通过前述组合物和方法转化的植物。发明背景
遍及全世界的大多数作物物种暴露于对其生长和生产力引起不利影响的各种非生物胁迫，并且干旱、盐和低温是最显著的。盐胁迫扰乱离子和渗透稳态，而低温导致机械损害、大分子活性变化和细胞中降低的渗透势。在暴露于非生物胁迫后，植物激活胁迫耐受性信号传导中牵涉的多种多样的基因。这些胁迫诱导的基因可以分成效应蛋白和调节蛋白，其中的后一种包括转录因子。转录因子基因表达的变化通常导致植物的显著变化，并且许多转录因子基因的过表达在转基因拟南芥属(Arabidopsis)植物中赋予胁迫耐受性。因而，多种转录因子的鉴定和遗传操作已经受到很多关注。已经鉴定并研究的转录因子家族之一是WRKY家族，其以其成员共同的WRKY域命名。此域的长度为约60个氨基酸，并且含有在其N端的高度保守的WRKYGQK七肽及在其C端的锌指样基序。WRKY家族含有拟南芥属中的74名成员和稻中的超过100名成员。WRKY基因也已经在许多其它物种，包括高等植物诸如甘薯(甘薯(Ipomoea batatas))、大麦(大麦(Hordeum vulgare))、石炭酸灌木(creosote bush) (Larrea tridentata)和大豆(大豆(Glycine max))、低等植物诸如蕨类(fern)(水蕨(Ceratopteris richardii))和藓类(moss)(小立碗藓(Physcomitrella patens))、和非植物物种诸如绿藻类(莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii))、双滴虫类(diplomonads)(兰伯贾第虫(GiardiaIamblia))和变形虫门(amoebozoa)(盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum))中得到鉴定。所有鉴定的WRKY蛋白含有一个或两个WRKY域。含有单个WRKY域的蛋白质与含有两个WRKY域的蛋白质的C端比与N端在序列和DNA结合活性方面具有更多相似性。大多数具有WRKYGQK序列的鉴定的WRKY蛋白可以结合W框(TTGAC[C/T])以调节基因表达，而一些其它具有突变WRKYGKK基序的WRKY蛋白可以结合WK框(TTTTCCAC)，而非W框元件。在WRKY域外，一些其它WRKY蛋白拥有核定位信号、亮氨酸拉链、富含丝氨酸-苏氨酸的区域、富含谷氨酰胺的区域、富含脯氨酸的区域、酸性区或TIR-NBS-LRR域，并且这些多种多样的结构反映其多功能性质。许多WRKY基因在植物对水杨酸和生物胁迫，诸如病原性细菌、真菌和病毒的应答中发挥调节作用。还报告了 WRKY基因在种子发育和萌发、衰老和次生代谢中发挥作用。此夕卜，积累的事例表明WRKY基因牵涉植物中对非生物胁迫和ABA信号传导的响应。稻WRKY基因0sWRKY24、-45、-72和-77牵涉ABA信号传导。拟南芥属WRKY基因可以由干旱和冷胁迫(cold stress)诱导。几个报告也已经显示了 WRKY基因在其它植物中响应非生物胁迫和ABA信号传导，并且最近报告了三种大豆WRKY基因在转基因拟南芥属植物中赋予非生物胁迫耐受性。解决前述非生物胁迫在提供可持续的作物生产以供应严重依赖作物物种(例如，稻、小麦)来满足其饮食需要的不断增长的世界人口中不断提供重大挑战。因此，不断需要鉴定并遗传操作非生物胁迫耐受性中牵涉的其它基因以创建改良的作物栽培种。发明概述本发明涉及能够对植物赋予胁迫耐受性(特别是干旱/渗透胁迫、盐胁迫和冷/冷冻胁迫)的分离的小麦WRKY多核苷酸、多肽、载体和表达分离的WRKY多核苷酸的宿主细胞。本文中提供的分离的WRKY多核苷酸包括如下的核酸，其包含(a) SEQ ID NO: I和3中任一项的核苷酸序列；(b)与(a)至少70%相同的核苷酸序列；(C)在严格杂交条件下与(a)的互补物特异性杂交的核苷酸序列；(d)编码WRKY蛋白的可读框，所述WRKY蛋白包含SEQ ID N0:2和4中任一项的多肽序列；(e)编码WRKY蛋白的可读框，所述WRKY蛋白包·含与(d)至少70%相同，并且拥有至少一个WRKY域的多肽序列；及(f)作为(a)-(e)中任一项的互补物的核苷酸序列。本文中提供的分离的WRKY多肽包含(a)SEQ ID NO: 2和4中任一项的氨基酸序列；和(b)与(a)至少70%相同且包含至少一个WRY域的氨基酸序列。本文中提供的宿主细胞包括那些包含本发明的分离的多核苷酸和载体的。宿主细胞可以来自动物、植物、或微生物，诸如大肠杆菌(E.coli)。特别涵盖植物细胞。可以将宿主细胞分离、切出或培养。宿主细胞也可以是植物的部分。本发明进一步涉及包含本发明的宿主细胞的植物或植物部分。特别涵盖单子叶植物诸如诸如小麦、大麦、稻、玉米、高粱、燕麦、和黑麦。本发明还涉及植物的转基因种子。本发明进一步涉及用于生成植物的方法，包括自本发明的宿主细胞再生转基因植物，或者将本发明的转基因植物与另一种非转基因植物杂交。本发明也涵盖通过这些方法生成的植物，并且特别涵盖对干旱/渗透胁迫、盐胁迫和冷/冷冻胁迫具有改善的胁迫耐受性的植物，其是作物植物，诸如小麦、大麦、稻、玉米、高粱、燕麦、和黑麦。本发明进一步涉及使用本发明的分离的多核苷酸、多肽、构建体和载体改变植物或植物部分中性状的方法。这些性状包括对干旱/渗透胁迫、盐胁迫和冷/冷冻胁迫的耐受性。优选地，改变前述性状，使得将它们提高或以其它方式改善。在一个实施方案中，通过在植物中表达分离的核酸来改变植物的一种或多种性状，所述分离的核酸诸如(a) SEQ IDNO: I和3中任一项的核苷酸序列；(b)与(a)至少70%相同的核苷酸序列；(c)在严格杂交条件下与(a)的互补物特异性杂交的核苷酸序列；(d)编码WRKY蛋白的可读框，所述WRKY蛋白包含SEQ ID NO: 2和4中任一项的多肽序列；(e)编码WRKY蛋白的可读框，所述WRKY蛋白包含与(d)至少70%相同，并且拥有至少一个WRKY域的多肽序列；及(f)作为(a)-(e)中任一项的互补物的核苷酸序列。在另一个实施方案中，通过在植物中表达分离的超等位基因WRKY等位基因改变植物的一种或多种性状。在另一个实施方案中，通过在植物中提高WRKY核酸或多肽的表达改变植物的一种或多种性状。在又一个实施方案中，通过在植物中改变WRKY多肽的功能改变植物的一种或多种性状。本发明进一步涉及经由改变植物中性状的前述方法创建的植物、植物部分和转基因种子。可以自前述方法直接创建此类涵盖的植物、植物部分和转基因种子。或者，涵盖的植物、植物部分和转基因种子可以源自宿主细胞(例如，自宿主细胞再生)或者通过将具有一种或多种改变的性状的转基因植物与非转基因植物杂交来生成。本发明进一步涉及改变选自下组的胁迫相关基因的表达的方法DREB2A、RD29A、RD29、C0R15A、STZ和C0R6. 6。在某些实施方案中，通过在宿主细胞、植物或植物部分中提高一种或多种WRKY多肽的表达提高一种或多种这些胁迫相关基因的表达。在其它实施方案中，通过在宿主细胞、植物或植物部分中降低一种或多种WRKY多肽的表达降低一种或多种这些胁迫相关基因的表达。本发明进一步涉及鉴定WRKY结合剂和抑制剂的方法。在一个实施方案中，所述方法包括(a)提供分离的WRKY蛋白；(b)在足以结合的条件下使分离的WRKY蛋白与药剂/剂(agent)接触；(c)测定药剂对分离的WRKY蛋白的结合；并(d)选择表明对分离的WRKY蛋白的特异性结合的药剂。在另一个实施方案中，所述方法包括(a)提供表达WRKY蛋白的宿主细胞；(b)使宿主细胞与药剂接触；(c)测定WRKY蛋白的表达；并(d)选择诱导WRKY蛋白的表达改变的药剂。在又一个实施方案中，所述方法包括(a)提供表达WRKY蛋白的植物或植物部分；(b)使植物或植物部分与药剂接触；(c)测定植物或植物部分的性状改变；并
(d)选择改变性状的药剂。要测定的性状是那些已知受到WRKY表达影响的性状(例如，干旱/渗透胁迫耐受性、盐耐受性、和冷/冷冻耐受性)。优选地，选择提高或以其它方式改善这些性状的药剂。然而，也涵盖负面影响性状的药剂。本发明还涉及抑制植物中WRKY的方法，其使用通过本文中的方法鉴定的结合剂和抑制剂进行。附图简述图I显示了响应各种胁迫和ABA处理的TaWRKY基因表达。(a)用干旱、250mMNaCl、4° C或受伤(wounding)处理的15天龄小麦(栽培种Xifeng 20,抗干旱)幼苗中TaffRKY2和-19基因的表达，如通过RT-PCR揭示的。扩增Taactin基因作为内部对照。(b)用ΙΟΟμΜ ABA处理的小麦幼苗中TaWRKY基因的表达。其它与在(a)中一样。(c) 20天龄小麦幼苗的不同器官中TaWRKY基因的表达，如通过RT-PCR揭示的。扩增Taactin基因作为内部对照。图2显示了 TaWRKY2过表达植物的渗透(干旱)胁迫耐受性。(a)不同转基因系中TaWRKY2的表达。(b)在山梨糖醇处理下三种转基因系(2-12、2-1和2_2)与Col-O植物的生长比较。将来自MS板的7天龄植物在含有300mM山梨糖醇的O. 5xMS上转移，并维持20天。(c)在正常条件(CK)下和渗透胁迫后植物的生长。将来自(b)的幼苗在盆中转移，并维持20天。(d)胁迫恢复后(c)中植物的存活率。(e)胁迫恢复后(c)中植物的抽苔(bolting)率。(f) (c)中胁迫恢复后植物高度的比较。对于(d)、(e)和(f)，数值是三次重复实验(每次实验为36个植物)的平均值土SD。星号标示转基因植物与Col-O间·的显著差异(*P〈0.05;#P〈0.01)。(g)山梨糖醇处理后植物中可溶性糖含量。(h)来自山梨糖醇处理后的植物的叶中的相对电解质渗漏(leakage)。将7天龄幼苗转移到含有山梨糖醇的O. 5xMS板上，并维持5天。对于(g)和(h)，每个数据点代表来自代表三次重复实验的一次的来自三次重复的均值土SD。星号标示转基因植物与Col-O植物间的显著差异(*Ρ〈0·05;**Ρ〈0· 01)。图3显示了 TaWRKY2过表达植物的盐胁迫耐受性。(a)经NaCl处理的转基因系(2-12,2-1和2-2)与Col-O的表型。(b)来自(a)的植物在盆中生长恢复10天。(c)来自(a)的植物在盆中生长恢复25天。(d)来自(b)的植物的存活率。(e)来自(C)的植物的抽苔率。(f) (C)中Col-O和转基因植物的植物高度。对于(d)、(e)和(f)，数值指示三次重复实验(每次实验为36个植物)的平均值土SD。(g)盐胁迫后植物中可溶性糖含量。(h)盐胁迫后植物中MDA含量。(i)来自经盐处理的植物的叶中的相对电解质渗漏。对于(g)、(h)和⑴，将7天龄幼苗转移到含有NaCl的O. 5XMS板上，并且维持5天。每个数据点是来自代表三次重复实验的一次的来自三次重复的均值土SD。从(d)至(i)，星号标示转基因植物与Col-O植物间的显著差异(*P〈0. 05;**P〈0. 01)。图4显示了 TaWRKY19过表达植物的渗透(干旱)胁迫耐受性。(a)TaWRKY19在Col-O和转基因系中的表达。(b)在山梨糖醇处理下转基因系(19-1、19-4、和19-5)与Col-O植物的生长比较。(c)经山梨糖醇胁迫的幼苗在盆中的生长恢复。(d)正常(CK)或胁迫条件下植物的存活率。(e)植物抽苔率的比较。(f)山梨糖醇处理后植物高度的比较。
(g)来自经山梨糖醇处理的Col-O和转基因植物的叶中的相对电解质渗漏。将7天龄幼苗转移到含有300mM山梨糖醇的O. 5XMS板上，并维持5天，然后用于(g)中的分析。其它与在图3中一样。图5显示了 TaWRKY19过表达植物在盐胁迫下的性能。(a)经NaCl处理的Col-O和转基因系(19-1、19-4和19-5)的表型比较。(b)经盐胁迫的植物在10天恢复后的生长。
(c)经盐处理的植物在恢复25天后的生长。(d)经盐胁迫的植物在恢复10天后的存活率。
(e)经盐胁迫的植物在25天恢复后的抽苔率。(f)经盐胁迫的植物在25天恢复后的植物高度。(g)经盐处理的植物中可溶性糖含量。(h)经盐处理的植物中MDA含量。(i)来自经盐处理的植物的叶的相对电解质渗漏。其它与在图2中一样。星号标示转基因植物与Col-O间的显著差异(*P〈0. 05;#P〈0. 01)。图6显示了 TaWRKY19过表达植物的冷冻耐受性。(a)经冷冻处理的Col-O和转基因系(19-1、19-4和19-5)的表型比较。(b)经冷冻处理的植物的存活率。(c)自冷冻恢复后植物的抽苔率。(d)自冷冻恢复后Col-O和转基因植物的植物高度。(e)在正常条件(CK)下和在冷冻后植物中的可溶性糖含量。(f)在正常条件(CK)下和在冷冻后植物中的MDA含量。(g)来自经冷冻处理的Col-O和转基因系的叶中的相对电解质渗漏。其它与在图2中一样。星号标示转基因植物与Col-O植物间的显著差异(*P〈0. 05;**P〈0. 01)。图7显示了 TaWRKY蛋白的亚细胞定位和DNA结合能力。(a) TaWRKY蛋白在拟南芥属原生质体中的亚细胞定位。将单独的GFP蛋白(CK)或TaWRKY-GFP融合物在CaMV 35S启动子控制下在拟南芥属原生质体中瞬时表达。照片是暗视场(左)(对于绿色荧光)和明视场(右)(对于细胞形态学)。箭指向核。(b)融合有MBP的TaWRKY蛋白的SDS-PAGE。在左侧标不蛋白质标志物的大小。箭标不相应的蛋白质条带。(c)TaWRKY蛋白的DNA结合能力。将蛋白质在存在(+)或没有(-)10倍摩尔过量的未标记竞争物的情况中与经Y-32P标记的W框(Wb)或突变的W框(mWb)元件一起温育。蛋白质/DNA复合物以箭标示。Wb和mffb两者均为三重串联重复。W框核心序列加下划线，且星号标示W框元件中的突变碱基。使用MBP作为阴性对照。图8显示了 TaWRKY蛋白的转录激活和反式激活能力。(a)TaWRKY2和TaWRKY19蛋白的转录激活。将TaWRKY基因与GAL4DBD融合以生成pBD_TaWRKY。pBD是阴性对照，而PGAL4是阳性对照。含有测试基因的酵母细胞在SD/-His上的生长和在β -半乳糖苷酶测定法中在存在X-gal的情况中的蓝色指示相应的蛋白质具有转录激活能力。所有转化体在YPAD上在正常条件下良好生长。“ + ”标示蛋白质具有反式激活能力，而标示蛋白质没有此类能力。(b)根据双重萤光素酶报告物测定法在拟南芥属原生质体中TaWRKY蛋白的反式激活活性。GAL4DBD是阴性对照，而VP16是阳性对照。星号标示与阴性对照GAL4DBD相比的显著差异(*P〈0. 05;#P〈0. 01)。图9显示了胁迫相关基因在TaWRKY转基因植物中的表达。(a) STZ和RD29B在TaffRKY2 过表达植物(2-12、2-1 和 2_2)中的表达。(b)DREB2A、RD29A、RD29B 和 Cor6. 6 在TaWRKY2过表达植物(19-1、19-4和19_5)中的表达。“rRNA”标示18S和28S rRNA作为加载对照。

图10显示了 TaWRKY蛋白对下游基因的启动子区中顺式DNA元件的结合。(a)各种W框元件在6种基因的I. 5kb启动子区中的分布。(b)用于DNA结合分析的推定的W 框。STZ-I和STZ-2片段标示在STZ启动子区中分别在位置-1131至-1168和位置-334至-303处的DNA序列。来自Corl5A、Cor6. 6、RD29A和RD29B的启动子区的序列中包含I至3个预测的W框(加下划线)。(C)TaWRKY蛋白结合下游基因的启动子区中的顺式DNA元件。将TaWRKY蛋白在存在(+)或没有(-)10倍摩尔过量的非标记竞争物的情况中与经[Y -32P]-dATP标记的探针一起温育，并且特异性经[Y -32P]-标记的DNA/蛋白质复合物通过箭标示。发明详述WRKY核酸和蛋白质如本文中所使用的，术语“核酸”、“多核苷酸”、“多核苷酸分子”、“多核苷酸序列”及复数变型可互换使用，指极其多种分子，包括单链和双链DNA和RNA分子、cDNA序列、外显子和内含子的基因组DNA序列、化学合成的DNA和RNA序列、和有义链和相应的反义链。本发明的多核苷酸还可以包含与参照天然核酸具有相似特性的天然核苷酸的已知类似物。如本文中所使用的，术语“多肽”、“蛋白质”及复数变型可互换使用，指由通过肽键连接的氨基酸的单链构成的化合物。本发明的多肽可以包含天然存在的氨基酸、合成的氨基酸、遗传编码的氨基酸、非遗传编码的氨基酸及其组合。多肽可以包含L型和D型氨基酸两者。代表性的非遗传编码的氨基酸包括但不限于2-氨基己二酸；3-氨基己二酸；β -氨基丙酸；2_氨基丁酸；4_氨基丁酸(哌唳酸(piperidinic acid)) ;6_氨基己酸；2-氨基庚酸；2_氨基异丁酸；3_氨基异丁酸；2_氨基庚二酸；2，4- 二氨基丁酸；锁链素；2，2’ - 二氨基庚二酸；2，3- 二氨基丙酸；N-乙基甘氨酸；N-乙基天冬酰胺；羟赖氨酸；别羟脯氨酸；3_羟脯氨酸；4_羟脯氨酸；异锁链素；别异亮氨酸；N-甲基甘氨酸(肌氨酸)；N-甲基异亮氨酸；N-甲基缬氨酸；正缬氨酸；正亮氨酸；和鸟氨酸。代表性的衍生化氨基酸包括例如那些其中的游离氨基基团已经衍生化成形成胺氢氯酸盐、对甲苯磺酰基基团、苄氧羰基基团、叔丁氧羰基基团、氯乙酰基基团或甲酰基团的分子。游离的羧基基团可以衍生化为形成盐、甲酯和乙酯或其它类型的酯或酰肼。游离的羟基基团可以衍生化为形成O-酰基或O-烃基衍生物。组氨酸的咪唑氮可以衍生化为形成N-im-苄基组氨酸。
如本文中所使用的，术语“分离的”指要不是至少一种人为作用，不以其存在的无论何种形式或量存在的多核苷酸和多肽。例示性的实施方案包括与其它分子种类部分、基本上或完全纯化的多核苷酸和多肽；对于特定细胞、生物体或生物体的部分而言异源的多核苷酸和多肽；对于特定细胞、生物体或生物体的部分而言不是异源的，但是由于至少一种人为作用而以改变的水平表达的多核苷酸和多肽；和在受到至少一种人为作用的细胞、生物体或生物体的部分的后代或其它下游产物(例如，果实)中表达的多核苷酸和多肽。本发明的例示性WRKY多核苷酸以SEQ ID NO: I和3及编码能够改变植物的性状，例如，干旱/渗透胁迫耐受性、盐胁迫耐受性和冷/冷冻胁迫耐受性的WRKY蛋白的基本上相同的序列列出。本发明的例示性WRKY多肽以SEQ ID NO: 2和4及能够改变植物的性状，例如，干旱/渗透胁迫耐受性、盐胁迫耐受性和冷/冷冻胁迫耐受性的基本上相同的蛋白质列出。
基本上相同的序列是那些在使用序列比较算法或者通过目视检查为了最大对应而比较和比对时具有至少60%，优选地至少80%，优选地至少85%，更优选地至少90%，甚至更·优选地至少95%，且最优选地至少99%核苷酸或氨基酸残基同一性的。优选地，实质性同一性存在于长度为至少约50个残基的序列区里，更优选地在至少约100个残基的区域里，且最优选地，序列在至少约150个残基里是基本上相同的。在一个特别优选的实施方案中，序列在编码区的整个长度里是基本上相同的。此外，基本上相同的核酸或蛋白质执行基本上相同的功能。基本上相同的序列可以是多态性序列，即群体中的备选序列或等位基因。等位差异可以小到一个碱基对。基本上相同的序列也可以包含诱变的序列，包括包含沉默突变的序列。突变可以包含一处或多处残基变化、一个或多个残基的删除、或一个或多个额外残基的插入。基本上相同的核酸也鉴定为与参照序列核酸(例如，SEQ ID NO: I)特异性杂交或实质性杂交的核酸。对于序列比较，通常一个序列充当测试序列比较的参照序列。在使用序列比较算法时，将测试和参照序列输入计算机中，若必要的话，指定亚序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数计算测试序列相对于参照序列的百分比序列同一性。可以进行比较序列的最佳比对，例如通过Smith和Waterman, Adv.Appl. Math. , 2:482 (1981)的局部同源性算法，通过 Needleman 和 Wunsch, J. Mol.Biol, 48:443 (1970)的同源性比对算法，通过 Pearson 和 Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 85:2444(1988)相似性搜索方法，通过这些算法(威斯康星遗传学软件包(WisconsinGenetics Software Package), Genetics Computer Group, 575 Science Dr. , Madison, WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)的计算机化执行，或者通过目视检查(见Ausubel等，下文)来进行。适合于测定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一个例子是BLAST算法，其记载于Altschul等，J. Mol Biol, 215:403-410(1990)。用于实施BLAST分析的软件经由国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi. nlm. nih. gov/)公开可获得。此算法牵涉首先通过鉴定询问序列中在与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足一些正取值的阈值得分T的长度W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)。T称为邻域字得分阈值(Altschul等，1990)。这些初始邻域字命中充当启动搜索以寻找含有其的更长HSP的种子。然后，将字命中以两个方向沿着每个序列延伸，直到累积的比对得分可以得到增加。对于核苷酸序列，使用参数M(匹配残基对的奖励得分；总是大于O)和N(错配残基的罚分得分；总是小于O)计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。在累积比对等分自其最大实现数值下降数量X，积累得分由于积累一个或多个负评分残基比对而转到O或之下，或达到任一序列的末端时，停止字命中以每个方向的延伸。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏性和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)为11、期望(E)为10、截留为100、M=5、N=_4、和两条链的比较作为缺省。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长(W)为3、期望(E)为10、和BLOSUM62评分矩阵(见 Henikoff 和 Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915 (1989))作为缺省。在计算百分比序列同一性外，BLAST算法还实施对两个序列间相似性的统计学分析(见例如 Karlin 和 Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5787 (1993))。由BLAST算法提供的一种相似性测量是最小和概率(smallest sum probability, P (N)),其 提供两个核苷酸或氨基酸序列间匹配偶然会发生的概率的指标。例如，若测试核酸序列与参照核酸序列的比较中最小和概率小于约O. 1，更优选地小于约O. 01，且最优选地小于约O. 001，则认为测试核酸序列与参照序列相似。基本上相同的序列可以是多态性序列，S卩，群体中的备选序列或等位基因。等位差异可以小到一个碱基对。基本上相同的序列也可以包含诱变的序列，包括包含沉默突变的序列。突变可以包含一处或多处残基变化、一个或多个残基的删除、或一个或多个额外残基的插入。两个核酸序列基本上相同的另一种指标是两个分子在严格条件下彼此杂交。严格条件是核酸探针通常会与其靶序列，而不是其它序列(在所述序列存在于复杂的核酸混合物(例如总细胞DNA或RNA)中时)的那些条件。在核酸杂交实验诸如Southern和Northern印迹分析的上下文中的严格杂交条件和严格杂交清洗条件是序列和环境两者依赖的。核酸杂交的广泛指导参见 Tssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes,第 I 部分第 2 章，Elsevier, NewYork (1993)。一般地，高度严格杂交和清洗条件选择为在限定的离子强度和pH比特定序列的热熔点(Tm)低约5° C。Tm是50%的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在限定的离子强度和pH下)。非常严格的条件选择为与特定探针的Tm相等。在Southern或Northern印迹中在滤膜上具有超过100个互补残基的互补核酸的杂交的严格杂交条件的例子是于42° C具有Img肝素的50%甲酰胺，其中杂交实施过夜。高度严格清洗条件的例子是O. 15M NaCl于72° C持续约15分钟。严格清洗条件的另一个例子是于65° C用O. 2X SSC清洗15分钟(关于SSC缓冲液的描述，见Sambrook，下文)。经常，高严格性清洗前面有低严格性清洗以除去背景探针信号。例如超过100个核苷酸的双链体的例示性中等严格性清洗是IX SSC于45° C持续15分钟。例如超过100个核苷酸的双链体的低严格性清洗的例子是4X-6XSSC于40° C持续15分钟。对于短探针(例如，约10至50个核苷酸)，严格条件通常牵涉于pH 7. O至
8.3的小于约I. OM钠离子，通常约O. 01至I. OM钠离子浓度(或其它盐)的盐浓度，且温度通常是至少约30° C。严格条件也可以通过添加脱稳定剂诸如甲酰胺来实现。一般地，在特定杂交测定法中对无关探针观察到的信噪比的2x(或更高)的信噪比指示特异性杂交的检出。若核酸编码的蛋白质是基本上相同的，则在严格条件下没有彼此杂交的核酸仍然是基本上相同的。例如，这在使用由遗传密码容许的最大密码子简并性创建核酸拷贝时发生。以下是杂交和清洗条件的例子，其可以用于鉴定与本发明的参照核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列。基本上相同的核苷酸序列在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4UmMEDTA中于50° C与参照核苷酸序列完全杂交，在2X SSC、0. 1%SDS中于50° C，更优选地在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0· 5M NaPO4UmM EDTA 中于 50° C清洗，在 IX SSC,O. 1%SDS 中于50° C，仍更优选地在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4UmM EDTA中于50° C清洗，在O. 5X SSC, O. 1% SDS中于50。C，甚至更优选地在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0· 5M NaPO4'ImM EDTA中于50° C清洗，在O. IX SSC, O. 1%SDS中于50° C，且最优选地在7%十二烷基硫酸钠(SDS)，O. 5M NaPO4UmM EDTA 中于 50° C 清洗，在 O. IX SSC, O. 1% SDS 中于 65° C清洗。两个核酸序列或蛋白质基本上相同的又一个指标是由核酸编码的所述蛋白质是 基本上相同的，共享总体三维结构，是生物学功能性等同物，或者是彼此免疫学杂交反应的或者特异性结合。若相应的蛋白质是基本上相同的，则在严格条件下没有彼此杂交的核酸分子仍然是基本上相同的。例如，这可以在两个核苷酸序列包含如由遗传密码容许的保守取代变体时发生。这还包括简并密码子取代，其中一个或多个选定的(或所有)密码子的第三位用混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(见Batzer等，Nucleic AcidsRes.，19:5081(1991) ;Ohtsuka 等，J. Biol. Chem.，260:2605-2608(1985);及 Rossolini 等Mol.Cell Probes, 8:91-98(1994)) ο然而，本发明的多核苷酸和多肽两者可以在一个或多个残基处保守取代。保守氨基酸取代的例子包括用一个非极性(疏水性)残基诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代另一种；用一种极性(亲水性)残基取代另一种，诸如在精氨酸和赖氨酸间、在谷氨酰胺和天冬酰胺间、在甘氨酸和丝氨酸间；用一种碱性残基，诸如赖氨酸、精氨酸或组氨酸取代另一种；或用一种酸性残基诸如天冬氨酸或谷氨酸取代另一种。本发明的核酸还包括与SEQ ID NO: I和3互补的核酸和SEQ ID NO: I和3的亚序列和延长的序列及其互补的序列。互补序列是包含能够在碱基对间形成氢键后彼此配对的反平行核苷酸序列的两个核苷酸序列。与依照本发明的其它多核苷酸一样，互补序列可以是彼此基本上相似的，如先前所描述的。互补核酸段的一个具体的例子是反义寡核苷酸。亚序列是核酸中包含较长核酸序列的一部分的序列。一种例示性的亚序列是探针或引物。延长的序列是其中将核苷酸(或其它类似的分子)添加至核酸序列的。例如，聚合酶(例如，DNA聚合酶)可以在核酸分子的3’端添加序列。另外，核苷酸序列可以与其它DNA序列，诸如启动子、启动子区、增强子、多聚腺苷酸化信号、内含子、其它限制酶位点、多克隆位点、和其它编码段组合。如此，本发明还提供了包含公开的核酸的载体，包括重组表达的载体，其中本发明的核酸与功能性启动子可操作连接。在与核酸可操作连接时，启动子与核酸处于功能性组合，使得核酸的转录受到启动子区控制和调节。载体指能够在宿主细胞中复制的核酸，诸如质粒、粘粒和病毒载体。可以将本发明的多核苷酸克隆、合成、改变、诱变或其组合。用于分离核酸的标准的重组DNA和分子克隆技术是本领域中已知的。产生碱基对变化的定点诱变、删除或小插入也是本领域中已知的(见例如 Sambrook等(编)Molecular Cloning:A Laboratory Manual1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York;Silhavy等，Experiments with Gene Fusions. 1984, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, New York;Glover & Hames, DNA Cloning:A Practical Approach. 2nded. , 1995, IRL Press at Oxford University Press, Oxford/New York;Ausubel (编)ShortProtocols in Molecular Biology.第 3 版，1995，Wiley, New York)。可以使用熟练技术人员已知的多种标准技术纯化并表征本发明的分离的多肽(见例如 Schroder 等，The Peptides. 1965, Academic Press, New York ;Bodanszky, Principlesof Peptide Synthesis.第 2 次修订版 1993，Springer-Verlag, Berlin/NewYork; Ausubel (编)，Short Protocols in Molecular Biology.第 3 版，1995，Wiley, NewYork)。本发明还涵盖用于检测编码WRKY蛋白的核酸分子的方法。可以使用此类方法来 检测WRKY基因变体或改变的基因表达。可以使用通常应用于检测特定DNA序列的任何方法通过本领域中公知的任何措施将通过本发明的方法检测的序列检出、亚克隆、测序，并进一步评估。如此，可以使用本发明的核酸来克隆包含公开的序列的基因和基因组DNA。或者，可以使用本发明的核酸来克隆相关序列的基因和基因组DNA。例如，可以使用RT-PCR测定法测量 WRKY 核酸分子的水平(见例如 Chiang, J. Chromatog r. A. , 806:209-218 (1998)及其中应用的参考文献)。本发明还涵盖使用WRKY核酸进行数量性状基因座(QTL)分析及筛选遗传变体，例如通过等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针分析(Conner等，Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 80 (I) : 278-282 (1983))、寡核苷酸连接测定法(OLA) (Nickerson 等，Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 87 (22) : 8923-8927 (1990))、单链构象多态性(SSCP)分析(Orita等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 (8) : 2766-2770 (1989))、SSCP/ 异双链体分析、酶错配切割、对扩增外显子的直接序列分析(Kestila等，Mol. Cell, 1(4) :575-582(1998) ;Yuan等，Hum. Mutat. , 14 (5) : 440-446 (1999))、等位基因特异性杂交(Stoneking 等，Am. J. Hum.Genet. ,48(2) : 370-382 (1991))、和对含有特定突变的扩增基因组DNA的限制性分析进行的遗传测定法。自动化方法也可以应用于单核苷酸多态性的大规模表征(Wang等，Am.J.Physiol,1998, 274(4Pt 2) :H1132_1140 (1992);Brookes, Gene, 234(2):177-186(1999))。优选的检测方法是非电泳的，包括例如TAQMAN 等位辨别测定法、PCR-OLA、分子信标、挂锁(padlock)探针、和适当的突光(见 Landegren 等，Genome Res.，8:769-776 (1998)及其中应用的参考文献)。本发明还涵盖WRKY多肽的功能性片段，例如，具有与SEQ ID N0:2或4相似的改变植物性状的能力的片段。也涵盖比公开的序列长度的功能性多肽序列。例如，可以对抗体多肽的N端或C端添加一个或多个氨基酸。此类额外的氨基酸可以在多种应用，包括但不限于纯化应用中采用。制备延长的蛋白质的方法是本领域中公知的。本发明还涵盖用于检测WRKY多肽的方法。可以使用此类方法，例如来测定WRKY蛋白表达的水平，并将表达水平与表型、性状或不同基因或基因产物的表达水平的存在或变化联系起来。在某些实施方案中，所述方法牵涉用特异性识别WRKY蛋白的抗体的免疫化学反应。用于检测此类抗体-抗原缀合物或复合物的技术是本领域中已知的，并且包括但不限于离心、亲和层析和其它免疫化学方法(见例如Ishikawa Ultrasensitiveand Rapid Enzyme Immunoassay. 1999, Elsevier, Amsterdam/New York, United Statesof America;Law, Immunoassay:A Practical Guide. 1996, Taylor & Francis, London/Bristol,Pennsylvania,United States of Ameri ca;Lidde 11 等,AntibodyTechnology. 1995, Bios Scientific Publishers, Oxford, United Kingdom;及其中应用的参考文献)。WRKY表达系统表达系统指包含异源核酸和由异源核酸编码的蛋白质的宿主细胞。例如，异源表达系统可以包含用包含编码与启动子可操作连接的WRKY蛋白的WRKY核酸的构建体转染的宿主细胞或通过将WRKY核酸引入宿主细胞基因组中生成的细胞系。表达系统可以进一步包含一种或多种与WRKY功能相关的其它异源核酸，诸如WRKY转录激活或阻抑活性的靶物。这些其它核酸可以以单一构建体或多种构建体表达。
用于表达WRKY蛋白的构建体可以包含载体序列和WRKY核苷酸序列，其中WRKY核苷酸序列与启动子序列可操作连接。用于重组WRKY表达的构建体还可以包含转录终止信号和核苷酸序列的正确翻译需要的序列。表达构建体的制备，包括添加翻译和终止信号序列是本领域技术人员已知的。启动子可以是在选定的植物细胞、植物部分或植物中显示转录活性的任何多核苷酸序列。启动子对于植物宿主和/或对于本发明的DNA序列而言可以是天然的或类似的，或者外来的或异源的。在启动子对于植物宿主是天然的或内源的情况中，意图启动子存在于接受启动子导入的天然植物中。在启动子对于本发明的DNA序列而言是外来的或异源的情况中，启动子不是可操作连接的本发明的DNA序列的天然的或天然存在的启动子。启动子可以是诱导型的或组成性的。它可以是天然存在的，可以由各种天然存在的启动子的各部分构成，或者可以是部分或完全合成的。用于设计启动子的指导通过启动子结构的研究，诸如Harley等，Nucleic Acids Res.，15:2343-61 (1987)的研究提供。还有，可以优化启动子相对于转录起始的位置(见例如Roberts等，Proc. Natl Acad.Sci. USA，76:760-4(1979))。许多适合于用于植物中的启动子是本领域中公知的。例如，适合于用于植物中的组成性启动子包括来自植物病毒的启动子，诸如花生褪绿条纹病(chlorotic streak)花椰菜花叶病毒(PClSV)启动子(美国专利No. 5，850, 019);来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S和19S启动子(Odell等，Nature, 313:810-812(1985)和美国专利 No. 5，352，605);小球藻(Chlorella)病毒甲基转移酶基因的启动子(美国专利No. 5，563，328)和来自玄参花叶病毒(FMV)的全长转录物启动子(美国专利No. 5，378，619);来自诸如稻肌动蛋白的基因的启动子(McElroy等，Plant Cell, 2:163-171(1990));泛素(Binet 等，Plant Science, 79:87-94(1991))、玉米(Christensen 等,Plant Molec. Biol, 12:619-632 (1989))和拟南芥属(Norris等，Plant Molec. Biol, 21:895-906 (1993);及 Christensen 等，Plant Mo I.Biol,18:675-689(1982)) ；pEMU(Last 等，Theor.Appl.Genet,81:581-588 (1991))；MAS (Velten 等，EMBO J, 3:2723-2730 (1984));玉米 H3 组蛋白(Lepetit 等，Mol. Gen.Genet, 1992，231:276-285(1992);及 Atanassova 等，Plant J.，2 (3) : 291-300 (1992));欧洲油菜(Brassica napus) ALS3 (PCT国际公开文本No. WO 97/41228);和各种土壤杆菌属(Agrobacterium)基因的启动子(例如,美国专利 No. 4，771，002; 5，102，796; 5, 182，200;和5，428，147)。合适于用于植物的诱导型启动子包括响应铜的来自ACEl系统的启动子(Mett等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:4567-4571 (1993));响应苯磺酰胺除草剂安全剂的玉米In2 基因的启动子(Hershey 等，Mol. Gen. Genetics, 227:229-237 (1991);及 Gatz 等，Mol.Gen. Genetics, 243:32-38 (1994));和来自 TnlO 的 Tet 阻抑物的启动子(Gatz 等，Mol. Gen.Genet.，227:229-237 (1991))。用于植物的另一种诱导型启动子是响应植物通常不响应的诱导剂的。此类的一种例示性诱导型启动子是在由雌二醇激活的基于雌激素受体的诱导型植物表达系统中使用的来自类固醇激素基因(其转录活性受到糖皮质类固醇激素诱导)(Schena 等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:10421 (1991))或最近应用的嵌合转录激活物XVE诱导)的诱导型启动子(Zuo等，Plant J.，24:265-273 (2000))。其它用于植物的 诱导型启动子记载于EP 332104、PCT国际公开文本No. WO 93/21334和WO 97/06269。也可以使用由其它启动子的各部分构成的启动子和部分或完全合成的启动子(见例如Ni等，PlantJ. ,7:661-676(1995)和PCT国际公开文本No. WO 95/14098，其描述用于植物的此类启动子)。可用于在植物中表达本发明的基因的组织特异性或组织优先性启动子。此类启动子披露于WO 93/07278。可用于本发明的其它组织特异性启动子包括美国专利No. 6，040，504中披露的棉rubisco启动子；美国专利No. 5，604，121中披露的稻蔗糖合酶启动子；和PCT国际公开文本No. WO 01/73087中披露的洋丁香属黄叶卷曲(cestrumyellow leaf curling)病毒启动子。可用于指导新的密集的且直立的圆锥花序基因在植物中表达的化学诱导型启动子披露于美国专利No. 5，614，395。启动子可以包含，或者修饰为包含一种或多种增强子元件，由此提供更高的转录水平。适合于用于植物的增强子元件包括PClSV增强子元件(美国专利No. 5，850，019)、CaMV 35S增强子元件(美国专利No. 5，106，739和5，164，316)和FMV增强子元件(Maiti等，Transgenic Res. , 6:143-156 (1997)) 还可见 PCT 国际公开文本 No. WO 96/23898。此类构建体可以含有“信号序列”或“前导序列”以便于感兴趣的肽向某些细胞内结构诸如叶绿体(或其它质体)、内质网、或高尔基体的共翻译或翻译后转运，或者被分泌。例如，构建体可以工程化改造成含有信号肽以便于肽转移至内质网。已知或怀疑信号序列导致共翻译或翻译后肽转运通过细胞膜。在真核生物中，这通常牵涉分泌入高尔基体中，伴随一些所得的糖基化。前导序列指在翻译时生成足以触发肽链共翻译转运至亚细胞细胞器的氨基酸序列的任何序列。如此,这包括通过通入内质网中,通到液泡,质体,包括叶绿体、线粒体等靶向转运和/或糖基化的前导序列。植物表达盒还可以含有内含子，使得对内含子的mRNA加工是表达需要的。此类构建体还可以含有5’和3’非翻译区。3’非翻译区是位于编码序列下游的多核苷酸。多聚腺苷酸化信号序列和编码能够影响多腺苷酸束添加至mRNA前体3’端的调节信号的其它序列是3’非翻译区。5’非翻译区是位于编码序列上游的多核苷酸。终止区可以与转录起始区一起是天然的，可以与本发明的序列一起是天然的，或者可以源自另一种来源。常规的终止区可获自根癌土壤杆菌(A. tumefaciens)的Ti质粒，诸如章鱼碱合酶和胭脂氨酸合酶终止区(见例如Guerineau等，Mol.Gen.Genet,262:141-144 (1991) ;Proudfoot,Cell,64:671-674 (1991) ;Sanfacon等，Genes Dev.,5:141-149 (1991);Mogen 等，Plant Cell,2:1261-1272(1990);Munroe等，Gene, 91:151-158 (1990) ;Ballas 等，Nucleic Acids Res.，17:7891-7903 (1989);及Joshi 等，Nucleic Acids Res.，15:9627-9639 (1987))。在适当时，可以为了在经转化的宿主细胞中升高的表达而优化载体和WRKY序列。也就是说，序列可以使用宿主细胞优选的密码子合成以改善表达，或者可以以宿主优选的密码子选择频率使用密码子合成。一般地，会增加多核苷酸的GC含量(关于宿主优选的密码子选择的讨论，见例如Campbell等,Plant Physiol, 92:1-11 (1990))。用于合成宿主优选的多核苷酸的方法是本领域中已知的(见例如美国专利No. 6，320，100; 6，075，185; 5，380，831;和 5，436，391，美国申请公开文本 No. 20040005600 和 20010003849，及 Murray等，Nucleic Acids Res.，17:477-498 (1989)。在某些实施方案中，将感兴趣的多核苷酸靶向至叶绿体以进行表达。在此方式中，在感兴趣的多核苷酸不直接插入叶绿体中的情况中，表达盒另外可以含 有编码转运肽(transit peptide)的多核苷酸以将感兴趣的多核苷酸引导至叶绿体。此类转运肽是本领域中已知的(见例如Von Hei jne等，Plant Mol. Biol.Rep.，9:104-126 (1991);Clark 等，J. Biol. Chem.，264:17544-17550 (1989);Della-Cioppa 等，Plant Physiol,84:965-968(1987) ;Romer 等，Biochem. Biophys. Res.Commun.，196:1414-1421(1993);及 Shah 等，Science, 233:478-481 (1986))。为了在叶绿体中表达可以优化要靶向至叶绿体的感兴趣的多核苷酸，从而造成植物细胞核与此细胞器间的密码子选择的差异。在此方式中，可以使用叶绿体优选的密码子合成感兴趣的多核苷酸(见例如美国专利No. 5，380，831)。可以将植物表达盒(即，与启动子可操作连接的WRKY可读框)插入植物转化载体，其容许将DNA转化入细胞中。此类分子可以由一种或多种表达盒组成，并且可以组织成超过一种载体DNA分子。例如，二元载体是植物转化载体，其利用两种非连续DNA载体来编码植物细胞转化所有必要的顺式和反式作用功能(Hellens等，Trends in PlantScience, 5:446-451(2000))。植物转化载体包含一种或多种DNA载体以实现植物转化。例如，本领域中常见的实践是利用包含超过一个连续的DNA段的植物转化载体。这些载体在本领域中经常成为二元载体。二元载体及具有辅助质粒的载体最常用于土壤杆菌属介导的转化，其中实现有效转化需要的DNA段的大小和复杂性是相当大的，并且有利的是将功能分到不同DNA分子上。二元载体通常含有质粒载体，其含有T-DNA转移需要的顺式作用序列(诸如左侧边界和右侧边界)、工程化改造成能够在植物细胞中表达的选择标志、和感兴趣的多核苷酸(即，工程化改造成能够在期望生成转基因植物的植物细胞中表达的多核苷酸)。对于某些目标物种，不同抗生素或除草剂选择标志可以是优选的。转化中常规使用的选择标志包括nptll基因(其赋予对卡那霉素及相关抗生素的抗性)(Messing和 Vierra, Gene, 19:259-268 (1982);及 Bevan 等，Nature, 304:184-187 (1983))、bar基因(其赋予对除草剂草胺膦(phosphinothricin)的抗性)(White等，Nucl.Acids Res. , 18:1062(1990),及 Spencer 等，Theor. Appl. Genet, 79:625-631 (1990))、hph基因(其赋予对抗生素潮霉素的抗性)(Blochinger和Diggelmann, Mol. Cell.Biol, 4:2929-2931 (1984))、dhfr 基因(其赋予对甲氨蝶呤的抗性)(Bourouis 等，EMBOJ，2 (7) :1099-1104 (1983))、EPSPS基因(其赋予对草甘膦(glyphosate)的抗性)(美国专利No. 4，940，935和5，188，642)、和甘露糖_6_磷酸异构酶基因(其提供代谢甘露糖的能力)(美国专利 No. 5，767，378 和 5，994，629)。也存在于此质粒载体上的是细菌复制需要的序列。顺式作用序列以如下的方式排列，以容许有效转移入植物细胞中及在其中表达。例如，选择标志序列和感兴趣的序列位于左侧和右侧边界间。经常，第二质粒载体含有反式作用因子，其介导T-DNA自土壤杆菌属转移至植物细胞。此质粒经常含有毒力功能(Vir基因)，其容许植物细胞被土壤杆菌属感染，及通过在边界序列处的切割转移DNA和vir介导的DNA转移，如本领域中了解的(Hellens等，2000)。几类土壤杆菌属菌株(例如，LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105，等等)可以用于植物转化。第二质粒载体对于通过其它方法诸如例如显微投射、微注射、电穿孔和聚乙二醇将多核苷酸导入植物中是不必要的。在另一个实施方案中，将本发明的核苷酸序列直接转化入质体基因组中。质体转化的主要优点在于质体一般能够在没有实质性修饰的情况中表达细菌基因，而且质体能够 在单一启动子控制下表达多个可读框。质体转化技术广泛记载于美国专利No. 5，451，513、5，545，817 和 5，545，818、PCT 国际申请公开文本 WO 95/16783、及 McBride 等，Proc.NatI. Acad. Sci. USA, 91:7301-7305(1994)。用于叶绿体转化的基本技术牵涉与感兴趣的基因一起将克隆的质体DNA中在选择标志侧翼的区域导入合适的目标组织中，例如使用生物射弹或原生质体转化(例如，氯化钙或PEG介导的转化)进行。I至1.5kb侧翼区(称作靶向序列)便于与质体基因组的同源重组，并且如此容许替换或修饰质体组(plastome)的特定区域。最初，利用叶绿体16S rRNA中的点突变和赋予对大观霉素和/或链霉素的抗性的rpsl2基因作为转化的选择标志(Svab等，Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 87:8526-8530(1990) ; Staub 等,Plant Cell, 4:39-45 (1992)) 这以每 100 次对目标叶的轰击为约I的频率导致稳定的同质转化体。这些标志物间的克隆位点的存在容许创建质体靶向载体以导入外来基因(Staub等，EMBO J，12:601-606 (1993))。通过用显性选择标志，即编码大观霉素解毒酶氨基糖苷-3’ -腺苷酰转移酶(adenyltransferase)的细菌aadA基因替换隐性rRNA或r_蛋白抗生素抗性基因获得转化频率的实质性增加(Svab 等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:913-917 (1993))。先前，此标志物已经成功用于绿藻莱茵衣藻的质体基因组的高频率转化(Goldschmidt-Clermont, Nucl. AcidsRes.，19:4083-4089 (1991))。可用于质体转化的其它选择标志是本领域中已知的。通常，转化后约15-20个细胞分裂周期是达到同质状态需要的。质体表达(其中通过同源重组将基因插入每个植物细胞中存在的所有几千拷贝的环状质体基因组中)利用与细胞核表达的基因相比大量的拷贝数优点以容许可以容易地超过占总可溶性植物蛋白质10%的表达水平。在一个优选的实施方案中，将本发明的核苷酸序列插入质体靶向载体中，并转化入期望植物宿主的质体基因组中。获得在含有本发明的核苷酸序列的质体基因组上同质的植物，并且其优先能够高度表达该核苷酸序列。宿主细胞宿主细胞是可以接受本发明的异源核酸分子导入的细胞。代表性的真核宿主细胞包括酵母和植物细胞，以及原核宿主诸如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(B. subtilis)。功能性测定法优选的宿主细胞基本上或完全缺乏WRKY蛋白的内源表达。
可以选择如下的宿主细胞菌株，其调控重组序列的表达，或者以特定的方式修饰并加工基因产物。例如，不同宿主细胞具有用于翻译和翻译后加工和修饰(例如，甲基化、蛋白质的磷酸化)的特征性且特定的机制。合适的细胞系或宿主细胞可以选择为确保对表达的外来蛋白质的期望的修饰和加工。例如，可以使用在细菌系统中的表达来生成非糖基化的核心蛋白产物，而在酵母中的表达会生成糖基化产物。本发明进一步涵盖WRKY蛋白在稳定细胞系中的重组表达。在将异源构建体转化入宿主细胞中后生成稳定细胞系的方法是本领域中已知的(见例如Joyner, GeneTargeting:A Practical Approach. 1993, Oxford University Press,Oxford/New York)。如此，经转化的细胞、组织和植物理解为不仅涵盖转化过程的终产物，而且还有其转基因后代或增殖形式。WRKY敲除植物本发明还提供了包含WRKY基因座的破坏的WRKY敲除植物。破坏的基因可以导致全长WRKY蛋白的水平改变的表达或突变的变体WRKY蛋白的表达。例如，可以通过在植物中表达无效(即无效突变)或下效WRKY等位基因生成WRKY基因完全或部分功能失活的植物。 也可以使用反义双链RNA或核酶WRKY构建体(其由通用或组织特异性启动子驱动以降低体细胞中WRKY基因表达的水平，如此实现敲低表型)制备依照本发明的敲除植物。本发明还提供了生成WRKY条件性或诱导型失活的植物。本发明还涵盖在公开的WRKY基因中具有特定的敲入(knock-in)修饰的转基因植物。在某些实施方案中，敲入的转基因植物表达反效(即显性阴性)等位基因。在其它实施方案中，敲入的转基因植物表达超效(即，功能获得)等位基因。WRKY敲除植物may be prepared in单子叶或双子叶植物，诸如玉米(maize)、小麦(wheat)、大麦(barley)、黑麦(rye)、甘薯(sweet potato)、豆(bean)、豌豆(pea)、菊苣(chicory)、莴苣、甘蓝(cabbage)、花椰菜(cauliflower)、花莖甘蓝(broccoli)、芜菁(turnip)、萝卜(radish)、菠菜(spinach)、石习柏(asparagus)、洋葱(onion)、大蒜(garlic)、胡椒(pepper) ,ffM (celery)、西葫芦(squash)、南瓜(pumpkin)、大麻(hemp)、小胡瓜(zucchini)、苹果(apple)、梨(pear)、媪梓(quince)、甜瓜(melon)、李(plum)、楼桃(cherry)、桃(peach)、油桃(nectarine)、杏(apricot)、草莓(strawberry)、葡萄(grape)、树莓(raspberry)、黑莓(blackberry)、凤梨(pineapple)、鳄梨(avocado)、番木瓜(papaya)、芒果(mango)、香蕉(banana)、大 (soybean)、番爺(tomato)、高梁(sorghum)、甘鹿(sugarcane)、甜菜(sugar beet)、向日葵(sunflower)、油菜杆(rapeseed)、三叶草(clover)、烟草(tobacco)、胡萝卜(carrot)、棉花(cotton)、苜猜(alfalfa)、稻(rice)、马铃薯(potato)、爺子(eggplant)、黄瓜(cucumber)、拟南芥属、和木本植物诸如针叶和落叶树。特别涵盖稻、小麦、大麦、燕麦、大豆和黑麦。如本文中所使用的，植物指全植物、植物器官(例如，根、茎、叶、花芽、或胚)、种子、植物细胞、繁殖体、胚、其它植物部分(例如，原生质体、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、合子)及其后代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如，愈伤组织(callus)、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞、花粉)。·
为了制备WRKY敲除植物，通过本领域中已知的几种技术之一，包括但不限于电穿孔或化学转化(见例如Ausubel 编(1994) Current Protocols in Molecular Biology. JohnWiley and Sons, Inc. , Indianapolis, Indiana)实现多核苷酸对植物细胞的导入。赋予对毒性物质的抗性的标志物可用于鉴定经转化的细胞(已经摄取并表达测试多核苷酸序列)与非转化细胞(那些不含或不表达测试多核苷酸序列的)。在本发明的一方面，基因作为标志物可用于帮助将DNA导入植物细胞中。转基因植物、经转化的植物、或稳定转化的植物、或任何前述物质的细胞、组织或种子指已经将外源多核苷酸掺入或整合入植物细胞中的植物。稳定的转化指将多核苷酸构建体导入植物中，使得它整合入植物基因组中，并且能够由其后代继承。一般地，植物转化方法牵涉将异源DNA转移至目标植物细胞(例如未成熟的或成熟的胚、悬浮培养物、未分化的愈伤组织、原生质体等)中，接着应用最大阈值水平的合适的选择(取决于选择标志基因)以自一组未转化的细胞团回收经转化的植物细胞。通常将外植体转移至新鲜供应的相同培养基，并常规培养。随后，在放置于补充有最大阈值水平的选择剂(即，温度和/或除草剂)的再生培养基后将经转化的细胞分化成枝条。然后，将枝条转移至选择性生根培养基以回收生根的枝条或小植株。然后，转基因小植株 生长成成熟的植物，并生成能育种子(见例如Hiei等，Plant J. , 6:271-282 (1994);及Ishida等，Nat. Biotechnol, 14:745-750(1996))。用于生成转基因植物的技术和方法的一般性描述参见 Ayres 等，CRC Crit. Rev. Plant Sci.，13: 219-239 (1994);及 Bommineni等，Maydica, 42:107-120 (1997)。因为经转化的材料含有许多细胞，所以经转化的和非转化的细胞两者存在于受试的目标愈伤组织或组织或细胞组的任何部分中。杀死非转化的细胞并容许经转化的细胞增殖的能力导致经转化的植物培养物。经常，除去非转化细胞的能力是快速回收经转化的植物细胞并成功生成转基因植物的限制。然后，可以使用分子和生物化学方法来确认转基因植物基因组中感兴趣的整合核苷酸的存在。可以通过几种方法之一，包括但不限于通过土壤杆菌属将异源DNA导入植物细胞中(土壤杆菌属介导的转化)、用粘附于颗粒的外源外来DNA轰击植物细胞、和转移DNA的各种其它非颗粒直接介导的方法(见例如Hiei等，PlantJ. 6:271-282 (1994) ; Ishida等，Nat.Biotechnol.，14:745-750 (1996) ;Ayres 等,CRC Crit.Rev.PlantSet, 13:219-239 (1994);及 Bommineni 等，Maydica, 1997，42:107-120 (1997))实施转基因植物的生成。存在着用土壤杆菌属转化植物细胞的三种常见的方法。第一种方法是将土壤杆菌属与培养的分离的原生质体共培养。此方法需要建立的培养系统，其容许培养原生质体和自培养的原生质体的植物再生。第二种方法是用土壤杆菌属转化细胞或组织。此方法需要(a)植物细胞或组织可以被土壤杆菌属转化和(b)可以诱导经转化的细胞或组织以再生成全植物。第三种方法是用土壤杆菌属转化种子、顶端(apices)或分生组织。此方法需要微增殖(micropropagation)。可以通过使用本领域中已知的许多方法来增强土壤杆菌属转化的效率。例如，已经显示了将天然伤口响应分子诸如乙酰丁香酮(AS)纳入土壤杆菌属培养物增强用根癌土壤杆菌的转化效率(Shahla等，Plant Molec. Biol, 8:291-298 (1987))。或者，可以通过使要转化的目标组织受伤增强转化效率。例如，可以通过冲孔、浸溃、用微粒轰击实现植物组织的受伤(见例如 Bidney 等，Plant Molec. Biol.，18:301-313 (1992)。
在一个实施方案中，经由颗粒轰击(即，用基因枪)用载体转染植物细胞。颗粒介导的基因转移法是本领域中已知的，是商品化的，并且包括但不限于记载于美国专利No. 5，584，807的气体驱动的基因递送仪。此方法牵涉将感兴趣的多核苷酸序列包被至重金属颗粒上，并在压缩气体的压力下加速包被颗粒假设以递送至目标组织。其它颗粒轰击方法也可用于将异源多核苷酸序列导入植物细胞中。一般地，这些方法牵涉将感兴趣的多核苷酸序列沉积于材料诸如金、钼、或钨的小的密集的颗粒的表面上。然后，将包被的颗粒自身包被至刚性表面，诸如金属板上，或者至由易碎材料诸如聚酯薄膜(mylar)制成的载体片上。然后，将包被片向目标生物组织加速。平片的使用对加速颗粒产生一致的扩散，其使在一致的条件下接受颗粒的细胞的数目最大化，导致将多核苷酸样品导入目标组织中。也可以使用特定的起始信号来实现编码感兴趣的多肽的序列的更有效的翻译。 此类信号包括ATG起始密码子及相邻序列。在将编码感兴趣的多肽的序列、其起始密码子和上游序列插入合适的表达载体中的情况中，可以不需要其它转录或翻译控制信号。然而，在仅插入编码序列或其部分的情况中，应当提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。此外，起始密码子应当在正确的阅读框中以确保翻译整个插入物。外源翻译元件和起始密码子可以是多种起源的(天然的和合成的两者)。可以通过纳入适合于使用的特定细胞系统的增强子，诸如那些记载于文献的(Scharf等，Results Probl. CellDiffer.，20:125(1994))来增强表达效率。可以依照常规方式将已经转化的细胞培养成植物(见例如McCormick等，PlantCell Rep. ,5:81-84(1986))。然后，可以培养这些植物，并用相同的经转化品系或不同品系传粉，并鉴定具有期望的表型特征组成性表达的所得杂种。可以培养两代或更多代以确保期望的表型特征的表达得到稳定维持和遗传，然后收获种子以确保已经实现期望的表型特征的表达。在此方式中，本发明提供了具有稳定整合入其基因组中的本发明的多核苷酸，例如本发明的表达盒的经转化的种子(又称为转基因种子)。本发明的转基因植物在添加的多核苷酸方面可以是纯合的；即，含有两个添加的序列(在染色体对的每条染色体上的相同基因座处的一个序列)的转基因植物。可以如下获得纯合转基因植物，即将含有依照本发明的添加序列的独立分离子转基因植物有性交配(自交)，萌发生成的一些种子，并相对于对照(天然的、非转基因的)或独立分离子转基因植物，对所生成的所得植物分析增强的酶活性(即，除草剂抗性)和/或升高的植物产量。应当理解，也可以将两种不同转基因植物交配以生成含有两种独立分离的添加的、外源多核苷酸的后代。合适的后代的自交可以生成在所有添加的编码本发明的多肽的外源多核苷酸方面纯合的植物。还涵盖与亲本植物的回交和与非转基因植物的异型杂交。在将DNA导入植物细胞中后，通过多种方法，诸如分析与整合序列有关的多核苷酸、多肽和代谢物来确认多核苷酸对植物基因组的转化或整合。WRKY 抑制剂本发明进一步公开了鉴定WRKY结合配偶体和WRKY抑制剂的测定法。WRKY拮抗剂/抑制剂是例如通过改变化学和生物学活性或特性来改变WRKY蛋白功能的药剂。鉴定抑制剂的方法牵涉在存在一种或多种药剂的情况中测定WRKY功能的水平或质量的降低。例示性的WRKY抑制剂包括小分子及生物抑制剂，如下文所描述的。
如本文中所使用的，术语“药剂”指与WRKY核酸或蛋白质潜在相互作用的任何物质，包括任何合成的、重组的、或天然的起源的。可以使用本文中公开的方法对怀疑与蛋白质相互作用的药剂评估此类相互作用。例示性的药剂包括但不限于肽、蛋白质、核酸、小分子(例如，化学化合物)、抗体或其片段、核酸-蛋白质融合物、任何其它亲和剂、及其组合。要测试的药剂可以是纯化的分子、同质样品、或分子或化合物的混合物。小分子指具有小于约1，000道尔顿，更优选地小于约750道尔顿，还更优选地小于约600道尔顿，且还更优选地小于约500道尔顿的分子量的化合物，例如有机化合物。优选地，小分子还具有范围为约-4至约+14，更优选地范围为约-2至约+7. 5的计算的对数辛醇-水分配系数。可以用于破坏WRKY功能的例示性核酸包括反义RNA和小干扰RNA(SiRNA)(见例如美国申请公开文本No. 20060095987)。这些抑制性分子可以基于WRKY基因序列和抑制性核酸的已知特征制备(见例如 Van der Krol 等，Plant Cell, 2:291-299 (1990) ; Napoli等,Plant Cell, 2:279-289(1990);English 等,Plant CelI,8:179-188(1996);及Waterhouse 等，Nature Rev. Genet, 2003, 4:29-38(2003)。药剂可以以分子文库或集合获得或制备。文库可以含有几种或大量不同分子，从约10种分子变化至几十亿种分子或更多。分子可以包括天然存在的分子、重组分子、或合成的分子。可以同时测定文库中的多种药剂。任选地，可以合并源自不同文库的药剂以进行同时评估。代表性的文库包括但不限于肽文库(美国专利No. 6，156，511，6，107，059，5，922，545和 5，223，409)、寡聚物文库(美国专利No. 5，650，489和 5，858，670)、适体文库(美国专利 No. 7，338，762; 7，329，742; 6，949，379; 6，180，348;及5，756，291)、小分子文库(美国专利No. 6，168，912和5，738，996)、抗体或抗体片段的文库(美国专利 No. 6，174，708，6，057，098，5，922，254，5，840，479，5，780，225，5，702，892 和5，667988)、核酸_蛋白质融合物的文库(美国专利No. 6，214，553)、和可以潜在结合WRKY蛋白的任何其它亲和剂的文库。文库可以包含分子的随机集合。或者，例如，就抑制性核酸而言，文库可以包含具有特定序列、结构、或构象偏爱的分子集合(见例如美国专利No. 5，264，563和5，824，483)。用于制备含有各类分子的多样群体的文库的方法是本领域中已知的，例如如上文应用的美国专利中所描述的。许多文库也是商品化的。WRKY活性的对照水平或质量指例如在使用包含SEQ ID NO:2表达的重组表达系统时野生型WRKY活性的水平或质量。在评估药剂的抑制性能时，WRKY活性的对照水平或质量包含在没有药剂的情况中活性的水平或质量。对照水平也可以通过表型或其它可测量性
状建立。鉴定WRKY抑制剂的方法还需要测定药剂的抑制性能。测定药剂的抑制性能可以包括测定WRKY基因表达的水平；测定重组表达的WRKY蛋白的DNA结合活性；测定WRKY蛋白的活性构象；或者测定响应WRKY抑制剂结合的性状变化(例如，干旱/渗透胁迫耐受性、盐胁迫耐受性和冷/冷冻胁迫耐受性)。在具体的实施方案中，鉴定WRKY抑制剂的方法可以包括(a)提供表达WRKY蛋白的细胞、植物或植物部分；(b)使细胞、植物或植物部分与药剂接触；(C)与对照相比，对细胞、植物或植物部分检查性状变化；并(d)选择与对照相比诱导性状变化的药剂。随后，在期望时，可以将在公开的抑制或结合测定法(见下文)中如此鉴定的任何药剂应用于细胞、植物或植物部分以实现所述细胞、植物或植物部分的变化。例如，WRKY基因(例如，SEQ ID NO: I)的破坏或对WRKY多核苷酸或多肽(例如，SEQ ID NO: 2)的抑制有可能会以非期望的方式改变一种或多种植物性状(例如，降低胁迫耐受性)。本发明还涵盖依赖于本文中所描述的方法的快速的且高通量的筛选方法。此筛选方法包括使WRKY蛋白分开与多种药剂接触。在此类筛选方法中，多种药剂可以包含超过约IO4种样品、或超过约IO5种样品、或超过约IO6种样品。本发明的体外和细胞测定法可以包括可溶性测定法，或者可以进一步包括用于固定化测定法的一种或多种组分的固相基片。例如，可以经由共价或非共价连接将WRKY蛋白，或表达WRKY蛋白的细胞直接结合至固体状态的组分。任选地，结合可以包括介导WRKY蛋白间接结合至基片的接头分子或标签。WRKY结合测定法本发明还涵盖鉴定WRKY抑制剂的方法，其通过测定物质(例如，先前所描述的药剂)对WRKY蛋白的特异性结合来进行。例如，鉴定WRKY结合配偶体的方法可以包括(a)提供SEQ ID NO: 2和4中任一项的WRKY蛋白；(b)在足以结合的条件下使WRKY蛋白与一种或多种药剂接触；(c)测定药剂对分离的WRKY蛋白的结合；并(d)选择表明对WRKY蛋白的特异性结合的药剂。特异性结合也可以涵盖相互作用的质量或状态，使得药剂对WRKY蛋白的结合是抑制性的。特异性结合指在蛋白质的异质群体和其它生物材料中确定蛋白质存在的结合反应。若结合亲和力是约IxIO4M4至约IxlO6M-1或更大，则可以认为药剂对WRKY蛋白的结合是特异性的。特异性结合也指可饱和结合。为了表明药剂对WRKY蛋白的可饱和结合，可以实施 Scatchard 分析，如例如 Mak 等，J. Biol. Chem.，264:21613-21618(1989)所描述的。可以使用几种技术在不采用已知竞争性抑制剂的情况中检测WRKY蛋白与药剂间的相互作用。代表性的方法包括但不限于荧光相关光谱学、表面增强激光解吸/离子化飞行时间光谱学、和BIACORl^R:;技术，每种技术在下文中描述。这些方法可适用于自动化高通量筛选。荧光相关光谱学(FCS)测量小样品体积内荧光分子的平均扩散率。样品大小可以低到IO3种荧光分子，而样品体积低到单一细菌的胞质。扩散率是分子质量的函数，并且随质量增加而降低。因此，FCS可以应用于蛋白质-配体相互作用分析，其通过测量结合后分子的质量并且因此扩散率的变化来进行。在一个典型的实验中，要分析的靶物(例如，WRKY蛋白)以具有在N端或C端插入的序列标签，诸如多组氨酸序列的重组蛋白表达。在宿主细胞，诸如大肠杆菌、酵母、非洲蟾蜍属(Xenopus)卵母细胞、或哺乳动物细胞中介导表达。使用层析方法纯化蛋白质。例如，可以使用多组氨酸标签来将表达的蛋白质结合至金属螯合物柱，诸如亚氨二乙酸琼脂糖上螯合的Ni2+。然后，用荧光标签诸如羧基四甲基罗丹明或B0DIPY 试剂(可购自Molecular Probes of Eugene, Oregon)标记蛋白质。然后，将蛋白质在溶液中暴露于潜在的配体，并且使用可购自Carl Zeiss, Inc. (Thornwood of NewYork, New York)的仪器通过FCS测定其扩散率。通过蛋白质扩散率的变化测定配体结合。表面增强激光解吸/ 离子化(SELDI)由 Hutchens 和 Yip, Rapid Commun. MassSpectrom.，1993，7:576-580开发。在与时间飞行质谱仪(TOF)偶联时，SELDI提供了一种快速分析芯片上保留的分子的技术。它可以应用于配体-蛋白质相互作用分析，其通过在芯片上共价结合靶蛋白或其部分，并通过质谱术分析结合此蛋白质的小分子进行(Worrall等，Anal Chem. ,1998，70 (4) :750-756 (1998))。在一种典型的实验中，将靶蛋白(例如，WRKY蛋白)重组表达并纯化。通过利用多组氨酸标签或者通过其它相互作用，诸如离子交换或疏水性相互作用将靶蛋白结合至SELDI芯片。然后，经由例如能够以序贯方式将配体移液的投递系统(自动取样仪)将如此制备的芯片暴露于潜在的配体。然后，将芯片在增加的严格性的溶液中清洗，例如用含有增加的离子强度的缓冲溶液的一系列清洗。在每次清洗后，通过将芯片提交给SELDI-T0F分析结合的材料。特异性结合靶蛋白的配体通过其洗脱需要的洗液的严格性来鉴定。BiACCmmH衣赖于表面层上在配体与该层上固定化的靶蛋白(例如WRKY蛋白)的结合后的折射率变化。在此系统中，将小配体的集合在2-5微升细胞中序贯注射，其中靶蛋白在细胞内固定化。通过记录自表面折射的激光通过表面等离振子共振(SPR)检测结合。一般地，表面层上质量浓度的给定变化的折射率变化对于所有蛋白质和肽实际上是相同的，容许单一方法对于任何蛋白质是可应用的。在一个典型的实验中，将靶蛋白重组表达，纯化，并结合至:BIACORI^芯片。可以通过利用多组氨酸标签或者通过其它相互作用，诸如离子交换或疏水性相互作用促进结合。然后，经由由Biacore (Uppsala, Sweden)出售的仪器中整合的用于以序贯方式将配体移液的递送系统(自动取样仪)将如此制备的芯片暴露于一种或多种潜在的配体。记录芯片上的SPR信号，并且折射率的变化指示固定化的祀物与配体间的相互作用。对结合速率(on rate)和解离速率(off rate)的信号动力学的分析容许辨别非特异性和特异性相互作用(还可见Homola等，Sensors andActuators, 54:3-15(1999)及其中的参考文献)。构象测定法本发明还涵盖鉴定WRKY结合配偶体和抑制剂的方法，其依赖于在被物质(例如先前所描述的药剂)结合或与其以其它方式相互作用时WRKY蛋白的构象变化。例如，对大分子的溶液应用圆二色性揭示这些大分子的构象状态。该技术可以区别无规卷曲、alpha螺旋、和beta链构象状态。为了鉴定WRKY蛋白的抑制剂，可以使用重组表达的WRKY蛋白实施圆二色性分析。将WRKY蛋白例如通过离子交换和大小排阻层析纯化，并与药剂混合。将混合物进行圆二色性。将在存在药剂的情况中WRKY蛋白的构象与在没有药剂的情况中WRKY蛋白的构象比较。在存在药剂的情况中WRKY蛋白的构象状态的变化鉴定出WRKY结合配偶体或抑制剂。代表性方法记载于美国专利No. 5，776，859和5，780, 242。可以使用功能性测定法评估抑制剂的拮抗活性，诸如测定改变的胁迫耐受性，如本文中描述的。依照公开的方法，表达WRKY的细胞可以在可用于实施WRKY功能的测定法的试剂盒形式中提供。例如，用于检测WRKY的试剂盒可以包括用编码全长WRKY蛋白的DNA转染的细胞和用于培养细胞的培养基。采用瞬时转染的细胞的WRKY活性测定法可以包括区别经转染的细胞与非转染的细胞的标志物。标记物可以由用于WRKY表达的构建体编码或与其以其它方式关联，使得用编码WRKY和标志物的核酸分子同时转染细胞。可用作标志物的代表性可检测分子包括但不限于异源核酸，由转染的构建体编码的蛋白质(例如，酶或荧光蛋白)、结合蛋白、和抗原。另外，采用表达重组WRKY的细胞或表达WRKY的植物的测定法可以采用基本上缺乏天然的WRKY和任选地与WRKY蛋白基本上相似的蛋白质的对照细胞或植物。在使用瞬时转染的细胞时，对照细胞可以包含例如，未转染的宿主细胞。在使用表达WRKY蛋白的稳定细胞系时，对照细胞可以包含例如，用于衍生WRKY表达细胞系的亲本细胞系。抗WRKY 抗体在本发明的另一方面，提供了用于生成特异性结合WRKY蛋白的抗体的方法。依照该方法，将全长重组WRKY蛋白配制为使得它可以作为有效的免疫原使用，并且用于免疫动物，使得在动物中产生免疫应答。免疫应答以生成可以自动物的血清收集的抗体为特征。抗体是免疫球蛋白蛋白质，或者包含抗原结合位点的抗体片段(例如，Fab、经修饰的Fab、Fab’、F(ab’)2 *Fv片段、或具有至少一个免疫球蛋白轻链可变区或至少一个免疫球蛋白重链区的蛋白质)。本发明的抗体包括双抗体、四聚抗体、单链抗体、四价抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、和识别特定表位的域特异性抗体。本发明还涵盖生成抗WRKY抗体的细胞系。抗体对WRKY蛋白的特异性结合指在包含多种不同抗原的异质样品中优先结合WRKY蛋白。基本上缺乏结合描述了抗体对对照蛋白或样品的结合，S卩，表征为非特异性或背景结合的结合水平。若结合亲和力是至少约10_7M或更高，诸如至少约10_8M或更高，包括至少约KT9M或更高、至少约KT11M或更高，或至少约KT12M或更高，则抗体对抗原的结合是特异性的。可以在涉及WRKY蛋白表达和活性的本领域中已知的方法中使用如本文中所公开的那样制备的WRKY抗体，例如以克隆编码WRKY蛋白的核酸、免疫纯化WRKY蛋白、和检测植物样品中的WRKY蛋白、以及测量植物样品中WRKY蛋白的水平。为了实施此类方法，本发明的抗体可以进一步包含可检测标记物，包括但不限于放射性标记物、荧光标记物、表位标记物、和可以在体内检测的标记物。用于选择适合于特定检测技术的标记物的方法和用于与抗体偶联或以其它方式联合可检测标记物与抗体的方法是本领域技术人员已知的。
实施例本发明现在参考以下实施例进行描述。这些实施例仅为了例示目的提供，并且本发明不限于这些实施例，而是涵盖由于本文中提供的教导而明显的所有变型。实施例I鉴定来自小麦的WRKY基因WRKY蛋白含有保守的WRKY基序(WRKYGQK)和新的锌指样基序(C2-H2或C2-H-C基序)。通过使用两种基序的共有序列针对来自小麦的494，195种表达的序列标签(ESTs)进行基本局部比对搜索(basic local alignment search, BLAST),鉴定出许多EST。在序列装配及随后除去那些没有WRKY基序的序列后，推定的WRKY单基因(unigene)。通过使用RT-PCR 和 RACE 获得 TaWRKY-2 (SEQ ID NO: I)和 TaWRKY-19 (SEQ ID NO: 3)的全长编码区。TaffRKY2和TaWRKY19的可读框的长度都是1407bp，并且编码长度为468个氨基酸的蛋白质(即，TaWRKY-2 (SEQ ID NO: 2)和 TaWRKY-19 (SEQ ID NO: 4))。除了 WRKY 域外，TaWRKY-2 和TaffRKY-19共享很少的同一性。
实施例2响应各种非生物胁迫的TaWRKY基因表达于37。C在水中浸没2天后,将小麦(普通小麦(Triticicum aestivum L.)栽培种Xifeng 20)的种子在湿润的纱布上于25° C萌发，然后在培养皿中于25° C在连续光(约2500勒克斯)下在水中浸没的纱布上以溶液培养方式培养。然后，将15天龄幼苗受到干旱、250mM NaCl、4° C、受伤和100 μ MABA处理。在干旱胁迫实验中，将幼苗转移到滤纸上，并于25° C和20%相对湿度干燥O、I、3、6、12、和24小时。对于NaCl和ABA处理，将幼苗根在分别含有200mM NaCl和100 μ M ABA的水中浸没0、1、3、6、12、和24小时。对于4° C处理，将幼苗于4° C以溶液培养方式培养0、1、3、6、12、和24小时。在处理后，将叶收集，并在液氮中立即冷冻，并于-70° C贮存，用于总RNA制备。还将来自在正常生长条件下培养的20天龄幼苗的根、茎和叶收获以进行分析。将冷冻的组织在液氮中用研钵和杵棒研磨成细粉末以进行总RNA分离。将总RNA通过使用硫氰酸胍法分离，并通过酚-氯仿提取纯化。遵循第一链cDNA合成试剂盒(Promega)的用法说明书合成第一链cDNA，即用于RT-PCR中扩增的模板。设计匹配TaWRKY基因序列的特异性引物。PCR反应混合物的总体积是15μ 1，其包含1μ I第一链cDNA、O. 2 μ M每种引物、Ix PCR缓冲液(其含有I. 5mM Mg2+)、0· 2mM dNTP和I个单位的Taq DNA聚合酶(Takara)。以如下程序实施扩增94° C持续3分钟进行变性；94° C持续I分钟，58° C(TaWRKY2)、52° C(TaWRKY 19)，或 54° C(肌动蛋白)持续 I 分钟，及 72° C 持续 I分钟的30个循环；和72° C持续10分钟进行最终的延伸。扩增小麦肌动蛋白基因作为对照。将扩增产物在l%w/v琼脂糖凝胶上分开，用溴化乙啶染色，并通过使用Gel Doc GS670凝胶成像系统(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)评估。在鉴定的TaWRKY基因中，通过4或5种前述处理诱导TaWRKY2和19(见图Ia和lb)。在干旱胁迫下，TaWRKY2得到高度诱导，而TaWRKY19仅得到适度诱导。在盐胁迫下，TaffRKY2和TaWRKY19得到诱导。响应低温，TaWRKY19得到中等诱导，但是TaWRKY2表达不受影响。在受伤后，TaWRKY2和TaWRKY 19表达得到较弱或适度诱导。ABA诱导这两种基因的表达。还在小麦植物的不同器官中检查两种基因的表达。TaWRKY19在根、茎和叶中较弱表达。然而，TaWRKY2的表达水平在根和叶中相对较高，但是在茎中较低(见图lc)。实施例3TaffRKY基因在转基因拟南芥属植物中的过表达将pGEM⑩-T-TaWRKY2构建体用BamHI和SacI分开消化，并将所得的TaWRKY2编码序列连接入由组成性CaMV 35S启动子驱动的植物表达载体pBIN121中，生成pBIN121-pBIN121-TaWRKY2构建体。以相同的方式，将来自初始pGEM -T-TaffRKY19构建体的全长TaWRKY19连接至pBIN121载体的Smal/SacI位点，生成pBIN121_TaWRKY19构建体。将所得的构建体通过测序确认，然后通过电穿孔分开转化入根癌土壤杆菌GV3101中，接着通过记载于例如 Bechtold 和 Pelletier, Methods Mo I. Biol. 82, 259-66 (1998)的真空渗入法转染入拟南芥属生态型Columbia植物(Col-O)中。将转基因植物在加有3%(w/v)鹿糖和50mg/L卡那霉素的Murashige和Skoog琼脂(MS琼脂)上选择。对TaWRKY2 (48个系)和TaWRKY19 (8个系)创建独立的转基因系。基于所有T1转基因系的全长TaWRKY基因使用特异性引物通过RT-PCR检查每个系中TaWRKY转基因的表达。实施总RNA分离和RT-PCR分析，如上文所描述的。使用Col-O作为阴性对照。使用AtActin-7基因作为内部对照。对于具有高表达水平的TaWRKY基因的T1转基因系，通过Northern印迹分析进一步确认转基因表达。将总RNA(25 μ g)通过含有甲醛的I. 0%琼脂糖凝胶分开，转移至Hybond尼龙膜上，并杂交,如先前记载于Zhang等，Theor. Appl.Genet, 99:1006-1011 (1999)的。通过随机引发法用a -32P-dCTP标记含有来自初始pGEM-T_TaWRKY构建体的全长TaffRKY基因的BamHI/SacI和Smal/SacI片段，并作为探针用于Northern印迹分析。使用18S和28S RNA作为内部对照。通过使用Typhoon Trio扫描仪(Amersham Biosciences/GE Healthcare, USA)显现特定条带。用独立的RNA样品将RT-PCR和Northern印迹分析重复两次。对过表达TaWRKY2或TaWRKY19的转基因系详细调查其在不同非生物胁迫下的性倉泛。实施例4TaffRKY2转基因拟南芥属植物的性能对过表达TaWRKY2的三种转基因拟南芥属系(2_12、2_1和2_2);见图2a)的纯合T3或T4种子检查其在干旱、盐和冷胁迫下的性能。通过70%(v/v)乙醇持续3-5分钟和15%(v/v)漂白剂(KaoCorporation, Tokyo, Japan)持续10分钟，接着用无菌水漂洗5次将Col-O和TaWRKY2转基因系的种子表面灭菌。将经灭菌的种子于4° C在黑暗中春化3天，然后在MS琼脂上于pH5. 8，随后在蛭石上于23° C在连续光下在生长室中培养。为了评估干旱和盐耐受性，将在水平放置的MS琼脂上生长的Col-O和转基因系的7天龄幼苗小心转移到O. 5x MS琼脂或加有300mM山梨糖醇或150mM NaCl的O. 5x MS琼脂上，接着水平生长生长。在山梨糖醇处理20天或NaCl处理15天后，观察到所得的表型变化。将经处理的幼苗转移至蛭石上以自山梨糖醇处理恢复20天和自NaCl处理恢复10天和25天。将在MS琼脂上生长的Col-O和转基因植物的17周龄幼苗转移至蛭石中，于正常的生长温度培养4天，然后用于评估转基因植物的耐受性。将3周龄幼苗移入于4° C在光照中的冷室中，冷驯化(acclimation) 16小时，然后移入于-4° C在光照中的温度受调节的冰箱中，冷冻4天,之后在冷室中于4° C去驯化(deacclimation) 24小时。随后,将经低温处理的幼苗转移至正常的生长温度，恢复20天。为了评估自山梨糖醇、NaCl和低温处理恢复后植物的存活和生长，评估所得的存活率、抽苔率、和植物高度。存活率代表在恢复指定时间后存活植物相对于经处理植物的数目的百分比。抽苔率指示具有抽苔物(bolt)(大于等于5mm)的植物的数目相对于恢复后存活植物的数目的百分比。植物高度表示在恢复后具有超过5-mm长度抽苔物的植物的峰抽苔物的平均值。为了评估与植物响应干旱和盐胁迫有关的其它指标，将Col-O和转基因TaWRKY2植物的7天龄幼苗小心转移到O. 5x MS琼脂和加有各种浓度的山梨糖醇(200mM和300mM)或似(1(1251111和1501111)的O. 5x MS琼脂上达5天。收获来自经山梨糖醇处理的、经NaCl处理的、和未处理的对照的莲座丛(Rosette)叶以测量丙二醛(MDA)含量、可溶性糖含量、和电解质渗漏。通过由Cui 和 Wang, Plant Soil Environ.，52:523-529 (2006)描述的硫代巴比土酸反应性物质(TBARS)测定法的改良型式评估MDA含量和可溶性糖含量。将叶(约O. 4g, Μ)称重,在液氮中用件棒和含有石英纱的研钵研磨，然后添加至4ml (V) 10%(w: v)三氯乙酸(TCA)。将匀浆以8000x g离心20分钟，并将200 μ I上清液与200 μ I在10%TCA中的O. 6%(w:v)硫代巴比土酸(TBA)混合以在沸水中反应15分钟。将产物冷却至室温，并以 10, OOOx g 离心 10 分钟。用 UV-VIS 分光光度计(Shimadzu, Japan)于 450nm(A450)、532nm (A532)和600nm (A600)检查上清液的吸光度。以下式评估MDA含量=MDA ( μ mol/gFff) = [6. 45x (A532-A600)-O. 56x A450Jx V/M(FW代表鲜重)。以下式评估可溶性糖含量可溶性糖(mmol/g Fff) =11. 71x A450X V/M。遵循如先前由Cao等，Plant Physiol, 143:707-719 (2007)描述的规程通过DDS-IlA电导检测器检查叶的电解质渗漏。将来自三个幼苗的充分清洗的叶盘在去离子水(终体积为12ml)中浸没，进行真空渗入达20分钟，并在水中维持2小时。检查所得溶液的电导率(Cl)。在将去离子水中的叶段煮沸15分钟后，将相应的溶液冷却至室温，并产生其电导率(C2)。Cl除以C2的百分比(C1/C2)表示为电解质渗漏。为了评估与植物响应冷胁迫有关的其它指标，将Col-O和转基因TaWRKY2植物的3周龄幼苗在冷室中于4° C驯化16小时，然后在温度受调节的冰箱中暴露于-4° C达4天。收获来自经冷胁迫的和未处理的对照的莲座丛叶以测量MDA含量、可溶性糖含量和电解质渗漏，如上文所描述的。在用300mM山梨糖醇处理20天后，转基因植物保持绿色，而Col-O植物的大多数叶变黄(见图2b)。随后，将板培养的植物转移入含有蛭石的盆中以在正常条件下恢复。在20天后，转基因植物比Col-O植物显示更好的存活和生长，如从存活率、抽苔率和植物高度(见图2c，d，e和f)判断的。在经干旱胁迫处理的植物中，可溶性糖水平在2-12系中显著上调，但是在其它两个系中仅略微升高(见图2g)。相对电解质渗漏在300mM山梨糖醇处理下在2-12系中显著降低，但是在相同处理的其它系中仅略微降低。在200mM山梨糖醇时，所有三个系都显示相对电解质渗漏的略微降低(见图2h)。在正常条件下，Col-O和转基因植物良好生长，并且没有显示表型和生理学参数的显著差异。在经盐胁迫的条件(consition)中，Col-O植物的莲座丛叶显示严重的偏上性，而大多数转基因植物仅受到适度影响(见图3a)。随后，将经盐处理的植物转移入含有蛭石的盆中，并容许在正常条件下恢复。在恢复10天后，超过79%的转基因植物存活，而小于50%的Col-O植物存活(见图3b，d)。在恢复25天后，经盐处理的转基因系比Col-O植物展现出更高的抽苔率(见图3c，e)。经盐处理的转基因植物的花序也比经胁迫的Col-O植物的花序高(见图3f)。与经胁迫的Col-O植物相比，可溶性糖水平在经盐胁迫的转基因植物中实质性升高(见图3g)。相反，与经盐处理的Col-O植物相比，MDA水平和相对电解质渗漏在盐胁迫后的TaffRKY2过表达植物中降低(见图3h，i)。在正常生长条件下在Col-O与TaWRKY2转基因植物间没有观察到表型或生理学参数的显著差异(见图3a_i)。这些结果指示TaWRKY2增强植物对渗透胁迫(诸如在干旱条件中诱导的渗透胁迫)的耐受性，而且增强植物对盐胁迫的耐受性。实施例5TaffRKY19转基因拟南芥属植物的性能也对过表达TaWRKY19的三种独立转基因系(19_1、19_4和19_5 ;见图4a)检查其在冷、盐和干旱胁迫下的性能，如实施例4中所描述的。在300mM山梨糖醇处理20天后，转基因植物比对照Col-O植物展现出更多绿叶(见图4b)。在将经山梨糖醇处理的幼苗转移入蛭石中并恢复20天后，转基因系比Col-O对照显示更好的生长，如通过更高的存活率、更高的抽苔率和更高的花序表明的(见图4c, d，e和f)。与Col-O植物中的水平相比，相对电解质渗漏在山梨糖醇处理后在TaWRKY19过表达植物中也降低(见图4g)。在正常条件下，在植物生长和电解质渗漏方面在Col-O和TaffRKY19转基因植物间没有观察到显著差异(见图4)。在用150mM NaCl处理15天后，转基因植物比对照植物显示更好的生长(见图5a)。在恢复10天后，超过94%的经盐处理的转基因植物存活，而仅47%的经盐处理的对照植物存活(见图5b，d)。在恢复25天后，转基因系19-1和19-4比对照和转基因系19_5具有显著更高的抽苔率(见图5c，e)。转基因植物的花序也比对照植物的化学高(见图5c, f)。可溶性糖水平在经盐胁迫的转基因植物中比在经盐胁迫的对照植物中显著更高，而MDA和电解质渗漏水平两者更低(见图5g，h, i)。将蛭石中生长的3周龄幼苗暴露于冷冻温度，然后容许在正常生长条件下恢复。在处理后，所有TaWRKY19转基因植物是活的且抽苔的(见图6a，b, c)。相反，小于一半的对照植物存活，而且仅约35%的存活对照植物抽苔(见图6a，b, c)。在抽苔的植物中，转基因植物的均值植物高度大于对照植物的均值植物高度(见图6d)。与经冷冻处理的对照植物相比，经冷处理的转基因植物也具有更高的可溶性糖水平，但是更低的MDA和相对电解质渗漏水平(见图6e，f，g)。在正常生长条件下，所有转基因和对照植物良好生长，并且在表型和生理学参数上没有显示显著差异(见图6)。这些结果指示TaWRKY19增强植物对干旱、盐和冷胁迫的耐受性。实施例6TaffRKY蛋白的亚细胞定位对于TaWRKY蛋白的亚细胞定位，用特异性引物通过PCR获得TaWRKY2和TaWRKY19的完整编码序列，将其用限制酶BamHI/Sall和Xhol/Spel消化，然后与瞬时表达载体中的绿色荧光蛋白(GFP)基因的5’或3’端融合以生成在组成性CaMV 35S启动子控制下的pUC-pUC-TaffRKY2-GFP和pUC_GFP_TaWRKY19构建体。将两种构建体和阳性对照pUC_GFP质粒分开转染入自悬浮细胞制备的拟南芥属原生质体中。在共聚焦显微镜下观察到GFP荧光。所有TaWRKY-GFP融合蛋白限于细胞核，而在胞质中观察到对照GFP蛋白(见图7a)。这些结果指示两种TaWRKY都是核蛋白。实施例7TaffRKY蛋白的转录激活还对TaWRKY2和TaWRKY19调查其在酵母和拟南芥属原生质体测定系统两者中的转录激活能力。在酵母测定系统中，将每种TaWRKY基因与质粒GAL4DBD中编码GAL4DNA结合域的DNA序列融合。将所得的pBD-TaWRKY融合质粒转染入YRG-2酵母细胞中，所述YRG-2酵母细胞含有在GAL4上游激活序列(UAS)控制下的整合的报告基因IacZ和HIS3。如图8a中显示的，含有pBD_TaWRKY2、pBD_TaWRKY19或阴性对照质粒pBD的酵母细胞不能生长，并且在存在X-Gal的情况中不显示蓝色。所有这些转化体在正常YPAD培养基上良好生长。这些结果指示TaWRKY2和TaWRKY19不拥有转录激活活性(至少在此酵母系统中)。使用双重萤光素酶报告测定系统(Promega，USA)来检查TaWRKY蛋白在拟南芥属原生质体中的转录激活活性。将效应质粒PBD-TaWRKY和表达萤火虫萤光素酶(LUC)的报告基因共转染入拟南芥属原生质体中，并测定相对LUC活性。如图8b中显示的，TaWRKY2和TaffRKY19比GAL4DBD阴性对照具有更小的LUC活性。这些结果指示TaWRKY2和TaWRKY19在原生质体测定法中似乎没有转录激活能力。实施例8TaffRKY蛋白的DNA结合特异性还调查TaWRKY2和TaWRKY19结合W框(TTGACC/T)的能力。使用含有BamHI和SalI位点及EcoRI和SalI位点的特异性引物PCR扩增含有两个完整的WRKY域的TaWRKY2和TaWRKY19的截短的编码序列，然后融合入pMAL_c2X载体(New England Biolabs, USA)(其包含麦芽糖结合蛋白(MBP)编码基因)中。TaWRKY2和19截短物具有两个WRKY域，并且范围分别为氨基酸位置181至468和193至468。这两种表达的蛋白质分别具有预期分子量74和73KD (见图7b)。在大肠杆菌菌株TBl中表达融合有MBP的TaWRKY截短蛋白，并通过使用直链淀粉树脂亲和柱纯化。通过于25。C以180rpm摇动细胞8小时通过O. 15mM异丙基-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导融合蛋白的表达。将TaWRKY蛋白通过在10%聚丙烯酰胺凝胶上的SDS-PAGE分开，并用考马斯亮蓝R-250染色。还纯化MBP作为对照。为了分析TaWRKY蛋白对W框的结合特异性，通过于70° C加热5分钟，接着缓慢冷却至室温将2对合成的单链寡核苷酸Wb和mWb (各含有三个串联的TTGAC重复和突变的TTGAA序列)在50mM NaCl中退火以生成双链寡核苷酸。遵循制造商的手册通过[Y -32P] -dATP (Amersham Pharmacia)和T4多核苷酸激酶(Promega)末端标记双链寡核苷酸，并通过使用旋转柱层析(G_25Sephadex柱，Amersham Pharmacia)纯化经32P标记的寡核苷酸。将结合反应于室温在含有2-4μ g纯化的蛋白质、I μ I经[Y-32P]标记的DNA片段和2 μ I凝胶移位结合5χ缓冲液[20%甘油、5mM MgCl、5mM ZnSO4,2. 5mM乙二胺四乙酸(EDTA)、2. 5mM 二硫苏糖醇(DTT)、250mM NaCl、50mM 三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)-HCl、
O.25mg/mL 聚(dl-dC)聚(dl-dC)，ρΗ 7· 5]的 5 μ I 混合物中温育 20 分钟。在 O. 5x TBE 缓冲液(O. IM Tris、90mM硼酸、ImM EDTA)中用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶以200V将蛋白质/DNA复合物分离35分钟，直至溴酚蓝染料行进凝胶长度的3/5。随后，将凝胶转移至滤纸上，于室温干燥，并于-70° C在增感屏(intensifyingscreen)的情况中暴露于X-射线胶片。使用Typhoon Trio扫描仪(Amersham Biosciences/GE Healthcare, USA)显现特定条带。通过具有等同的标记突变体探针的延迟条带的衰减和在结合反应中使用多至10倍过量的未标记探针通过竞争测定法评估探针结合特异性。这两种蛋白质都与经标记的Wb元件形成复合物(见图7c)。延迟条带的强度在包括非标记竞争物探针时显著降低，指示这两种TaWRKY蛋白都可以特异性结合W框序列。还对这两种蛋白质测试其结合突变体元件mWb的能力。两种蛋白质都不展现出对突变体的显著结合(图7c)。MBP没有显示结合Wb或mWb元件。这些结果指示这两种TaffRKY蛋白都特异性结合Wb元件。实施例9TaWRKY转基因植物中改变的基因表达自Col-O和转基因植物的12天龄幼苗分离总RNA，并通过RT-PCR在TaWRKY转基因植物中调查胁迫相关基因DREB2A、RD29A、RD29、C0R15A、STZ和C0R6. 6的表达，并通过Northern印迹分析进一步确认。各种胁迫相关基因的特异性引物基于自www.arabidopsis. org下载的拟南芥属基因序列。为了测试TaWRKY蛋白对调节基因的启动子区的结合特异性，在TaWRKY调节基因的I. 5kb启动子区中进一步调查推定的WRKY结合W框元件的存在。1.5kb启动子序列获自拟南芥生物资源中心(Arabidopsis Biological Resource Center, ABRC)。在这些启动子序列后，将与特定DNA片段对应的正向和反向单链寡核苷酸合成，退火，然后通过[Y -32P]-dATP (Amersham Pharmacia)作为探针末端标记。RD29B和STZ基因的表达在TaWRKY2转基因植物中增强，指示TaWRKY2可以至少经由调节两种基因在胁迫耐受性中发挥功能(见图9a)。在了&1腿￥19转基因植物中，01 82八、RD29B、Cor6. 6和RD29A基因比在Col-O植物中以更高的水平表达(见图％)。这些结果提示了这两种TaWRKY基因都经由调节不同下游基因改善胁迫耐受性。每种元件的分布频率在不同基因间是不同的，并且注意到具有不同侧翼序列的预测元件(见图10a)。认为WRKY蛋白SUSBIBA2可以结合大麦isol启动子中非典型的W框序列GTGACT，合成STZ、Cor6. 6、RD29A、和CorlSA基因的I. 5kb启动子区中的典型的W框TTGAC(T/C)和非典型的W框GTGAC两者以进行凝胶移位测定法(见图IOb)。RD29B和DREB2A基因的1.5kb启动子区中缺乏这两个W框(见图11a)。然而，因为互补链中推定的TTGACA元件和CTGACT元件以5bp的间隔存在于RD29B的_898bp至_882bp区中，所以还合成相应的DNA片段以进一步分析(见图Ilb)。TaffRKY2显示了对来自RD29B和STZ-I的元件的适度特异性结合，而且对来自STZ-2的元件具有非特异性结合(见图IOc)。TaWRKY19展现出对来自Cor6. 6基因的元件的强烈的特异性结合，但是对来自RD29A和RD29B基因的元件仅非常弱的特异性结合(见图IOc)。这些结果提示了 TaWRKY2和TaWRKY19经由对其启动子中元件的直接结合完全调节六种下游基因中的至少四种。在此通过提及而将本文中应用的每篇专利、专利申请和出版物的公开内容完整收入本文。虽然已经参考具体实施方案公开了本发明，但是显而易见的是，本领域技术人员可以在不偏离本发明的真实精神和范围的前提下设计本发明的其它实施方案和变型。所附权利要求书包括所有此类实施方案和等同变型。
权利要求
1.一种分离的WRKY多核苷酸，其选自下组 (a)包含SEQID NO: I和3中任一项的核苷酸序列的核酸； (b)包含与(a)至少70%相同的核苷酸序列的核酸； (c)包含在严格杂交条件下与(a)的互补物特异性杂交的核苷酸序列的核酸； (d)包含编码WRKY蛋白的可读框的核酸，所述WRKY蛋白包含SEQIDNO:2和4中任一项的多肽序列； (e)包含编码WRKY蛋白的可读框的核酸，所述WRKY蛋白包含与⑷至少70%相同，并且进一步包含至少一个WRKY域的多肽序列；及 (f)包含作为(a)-(e)中任一项的互补物的核苷酸序列的核酸。
2.—种载体,其包含权利要求I的分离的WRKY多核苷酸。
3.—种宿主细胞，其表达权利要求2的载体。
4.权利要求3的宿主细胞，其中所述细胞选自下组动物细胞、植物细胞和微生物细胞。
5.一种转基因植物或种子，其包含权利要求4的宿主细胞。
6.权利要求5的转基因植物或种子，其中所述植物是单子叶植物。
7.权利要求5的转基因植物或种子，其中所述植物是双子叶植物。
8.权利要求5的转基因植物或种子，其中所述转基因植物选自下组玉米、小麦、大麦、黑麦、甘薯、豆、豌豆、菊苣、莴苣、甘蓝、花椰菜、花茎甘蓝、芜菁、萝卜、菠菜、石刁柏、洋葱、大蒜、胡椒、芹菜、西葫芦、南瓜、大麻、小胡瓜、苹果、梨、榲梓、甜瓜、李、樱桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、树莓、黑莓、凤梨、鳄梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、番茄、高粱、甘蔗、甜菜、向日葵、油菜籽、三叶草、烟草、胡萝卜、棉花、苜蓿、稻、马铃薯、茄子、黄瓜和拟南芥属。
9.一种分离的WRKY多肽，其包含选自下组的氨基酸序列 (a)SEQ ID NO:2和4中任一项的多肽序列；和 (b)与(a)/(d)至少70%相同，并且进一步包含至少一个WRKY域的多肽序列。
10.一种用于生成转基因植物的方法，包括自依照权利要求3的宿主细胞再生转基因植物。
11.一种用于生成转基因植物的方法，包括将依照权利要求5的转基因植物与非转基因植物杂交。
12.通过依照权利要求10或11的方法生成的植物或自其衍生的转基因种子。
13.—种改变植物中的性状的方法，包括在植物中表达权利要求I的分离的多核苷酸。
14.权利要求13的方法，其中所述性状选自下组:干旱耐受性、盐耐受性和低温耐受性。
15.权利要求14的方法，其中所述分离的WRKY多核苷酸包含SEQID NO: 1，且所述性状是干旱耐受性。
16.权利要求14的方法，其中所述分离的WRKY多核苷酸包含SEQID NO: 1，且所述性状是盐耐受性。
17.权利要求14的方法，其中所述分离的WRKY多核苷酸包含SEQID NO:3。
18.通过依照权利要求13至17中任一项的方法生成的植物或自其衍生的转基因种子。
19.一种用于生成转基因植物的方法，包括将依照权利要求18的植物与非转基因植物杂交。
全文摘要
使用WRKY核酸和多肽对植物赋予胁迫耐受性的组合物和方法。
文档编号C07K14/415GK102939384SQ201080066415
公开日2013年2月20日 申请日期2010年2月24日 优先权日2010年2月24日
发明者张劲松, 陈受宜, 牛灿芳, 马彪, 张万科, 林晴, 何锶洁 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所