专利名称：提高植物非生物胁迫耐受性和/或生物量的方法及用该方法所产生的植物的制作方法
技术领域：
本发明涉及提高植物非生物胁迫耐受性和/或植物生物量的方法，更具体地说， 本发明涉及表达外源非生物胁迫_耐受性基因的植物。
背景技术：
非生物胁迫(也称为“环境胁迫”)条件例如高盐、干旱、洪涝、亚适温度和有毒化 学物质污染，严重损害农作物。大多数植物有保护它们自己不受这些条件影响的进化策略。 然而，如果这些胁迫条件太严重并且持续太久，则对植物的发育、生长和大多数作物的产量 影响巨大。此外，大多数作物对非生物胁迫(ABS)十分敏感，因而为了经济作物的产量就需 要提供最适合的生长条件。连续处于胁迫而引起植物代谢的重大改变，将最终导致细胞死 亡和产量下降。因此，纵有广泛深入研究和采用复杂的和强化的作物保护措施，非生物胁迫 条件造成的损失每年仍然以10亿美元计(1，2)。开发胁迫耐受性植物至少是解决或调解某些这类问题的可能的策略。然而，用于 开发新的耐受ABS的植物品系的传统植物育种策略，因其缓慢、耗时和结果难料，所以效率 相对低下。此外，有限的胁迫耐受性的种质资源和远缘植物种间杂交的不相容性是传统育 种中遇到的重大难题。另外，导致ABS耐受性的细胞过程本质上是复杂的而且包括细胞适 应的多种机制和许多代谢途径(4-7)。旨在使转基因作物具有非生物胁迫耐受性的遗传工程研究，在现有技术中已 有描述。Apse 禾口 Blumwald (Curr Opin Biotechnol. 13 :146_150，2002)、Quesada 等
(Plant Physiol. 130 :951_963，2002)、Holmstrom 等(Nature 379 :683_684，1996)、Xu 等(Plant PhysiolllO :249-257，1996)、Pilon-Smits 和 Ebskamp (Plant Physiol 107 125-130,1995)和 Tarczynski 等(Science 259 :508_510，1993)的许多研究全都试图获得 胁迫耐受性的植物。此外，一些美国专利和专利申请也描述了与胁迫耐受性相关的多核苷酸及其在获 得胁迫耐受性植物中的应用。美国专利号5，296，462和5，356，816描述了用编码参与拟南 芥(Arabidopsis thaliana)冷适应的蛋白的多核苷酸转化植物，因而能促进转化植物的冷 耐受性。美国专利号6，670，528描述了用编码与胁迫效应元件结合的多肽的多核苷酸转 化植物，因而能促进转化植物对非生物胁迫的耐受性。美国专利号6，720，477描述了用编码信号转导胁迫相关蛋白的多核苷酸转化植 物，因而能够提高转化植物对非生物胁迫的耐受性。
美国申请顺序号09/938842和10/342224描述了非生物胁迫相关基因及其在赋予 植物对非生物胁迫的耐受性中的应用。美国申请顺序号10/231035描述了植物过量表达钼辅因子硫化酶，因而提高其对 非生物胁迫的耐受性。虽然上述研究至少部分成功地获得了胁迫耐受性植物，但仍需胁迫耐受性基因以 获得广泛耐受非生物胁迫条件的植物。在将本发明付诸实施时，发明人通过生物信息学和实验室研究业已证实了一些新 的非生物胁迫耐受性基因，这些新基因能提高植物的非生物胁迫耐受性和/或生物量。
发明内容
按照本发明的一方面，提供提高植物对非生物胁迫的耐受性的方法。该方法包括 在植物中表达外源多核苷酸，该外源多核苷酸与选自SEQ ID N0:l-18的多核苷酸至少有 90%同源。按照本发明的另一方面，提供提高植物对非生物胁迫的耐受性的方法。该方法包 括在植物中表达其外源多肽，该外源多肽包括选自SEQ ID NO 39-92的氨基酸序列。按照本发明的又一方面，提供提高植物生物量的方法。该方法包括在植物中表达 外源多核苷酸，该外源多核苷酸与选自SEQ ID NO :1-18的多核苷酸至少有90%同源。按照本发明的再一方面，提供提高植物生物量的方法。该方法包括在植物中表达 外源多肽，该外源多肽包括选自SEQ ID NO 39-92的氨基酸序列。按照本发明的再又一方面，提供包含外源多核苷酸的植物细胞，该多核苷酸与选 自SEQ ID NO 1-18的多核苷酸至少有90%同源。按照本发明的再另一方面，提供包含外源多核苷酸的植物细胞，该外源多核苷酸 编码包括选自SEQ ID NO 39-92的氨基酸序列的多肽。按照本发明的再另一方面，提供核酸构建体，该核酸构建体包含与选自SEQ ID NO 1-18的核苷酸序列至少有90%同源的多核苷酸和能够在宿主细胞内指导所述多核苷 酸转录的启动子。按照本发明的再另一方面，提供核酸构建体，该核酸构建体包括编码包含选自SEQ ID NO :39-92的氨基酸序列的多肽的多核苷酸和能够在宿主细胞内指导所述多核苷酸转录 的启动子。按照本发明的还又一方面，提供分离的多肽，该多肽所含的氨基酸序列与选自SEQ ID NO 1-18的多核苷酸编码的氨基酸序列至少有90%同源。按照本发明的另一方面，提供分离的多肽，该多肽包括选自SEQID NO :39_92的氨
基酸序列。按照下述的本发明优选实施方案的进一步特征，通过下述步骤来实现表达(i) 用外源多核苷酸转化植物的细胞；(ii)从所述细胞产生成熟植株；(iii)在适合所述成熟 植株中表达所述外源多核苷酸的条件下，栽培所述成熟植株。按照所述优选实施方案的再进一步特征，转化是通过将核酸构建体导入植物细胞 中来实现的，该构建体包括外源多核苷酸和至少一个能够在植物细胞内指导外源多核苷酸 转录的启动子。
按照所述优选实施方案的再进一步特征，所述至少一个启动子是组成型启动子。按照所述优选实施方案的再进一步特征，所述组成型启动子是CaMV 35S启动子。按照所述优选实施方案的再进一步特征，所述组成型启动子是At6669启动子。按照所述优选实施方案的再进一步特征，所述至少一个启动子是诱导型启动子。按照所述优选实施方案的再进一步特征，所述诱导型启动子是非生物胁迫诱导型 启动子。按照所述优选实施方案的再进一步特征，所述至少一个启动子是组织特异性启动子。按照所述优选实施方案的再进一步特征，所述表达是通过用包括外源多核苷酸的 病毒感染植物来实现的。按照所述优选实施方案的再进一步特征，所述病毒是无毒病毒。按照所述优选实施方案的再进一步特征，所述非生物胁迫选自高盐、失水、低温、 高温、重金属毒性、无氧生活、营养缺乏、营养过剩、大气污染和UV辐射。按照所达优选实施方案的再进一步特征，所述植物是双子叶植物。按照所述优选实施方案的再进一步特征，所述植物是单子叶植物。按照所述优选实施方案的再进一步特征，所述植物细胞成为植物的一部分。本发明通过提供利用新的非生物胁迫耐受性基因提高植物非生物胁迫耐受性和/ 或生物量的方法，成功地克服了现有技术的缺点。
本文仅通过实施例并参考附图描述本发明，下面具体地参考附图的细节，须强调 的是，所给出的具体细节仅仅作为实例，用于说明性地论述本发明的优选实施方案，并且提 供这些详细资料是为了提供所认为的对本发明的原理和构思最有用最容易理解的描述。在 这方面，并没有试图以比基本理解本发明所必需的更为详细的说明本发明的结构细节，从 附图获取的说明，使得在实践中如何使本发明的所述几种形式具体化对于本领域技术人员 而言显而易见的。图1是说明从核酸序列数据库中鉴定推定植物胁迫耐受性基因的流程图。图2a_b是说明开花期的T2转基因拟南芥成熟植株用At6669启动子表达外源萤 光素酶转基因的照片。相同植物在正常光照条件下(图2a)和在暗处(图2b)。在花组织 和根组织中观察到证明萤光素酶表达的强发光。图3说明在正常条件或胁迫条件下(分别用0或100M NaCl溶液灌溉)生长的转 基因T1拟南芥(A.thaliana)植物的平均鲜重。用推定胁迫耐受性基因，或者用萤光素酶 报道基因(对照)转化植物，所述基因处于At6669启动子的转录控制下。按照单向ANOVA T检验，平均值士SD没有显著性差异。图4a说明在正常条件或胁迫条件下(分别用0或100M NaCl溶液灌溉)生长的 转基因T2拟南芥植物的平均鲜重。用本发明推定胁迫耐受性基因，或者用萤光素酶报道基 因(对照)转化植物，所述基因处于35S启动子的转录控制下。按照单向ANOVA T检验，平 均值士 SD没有显著性差异。图4b说明在正常条件或胁迫条件下(分别用0或100M NaCl溶液灌溉)生长的
6转基因T2拟南芥植物的平均鲜重。用本发明的推定胁迫耐受性基因，或者用萤光素酶报道 基因(对照)转化植物，所述基因处于At6669启动子的转录控制下。按照单向ANOVA T检 验，平均值士SD没有显著性差异。图5说明在盐胁迫条件下(用IOOmM NaCl溶液灌溉)生长的转基因Tl拟南芥植 物与在正常条件下(只用水灌溉)生长的类似植物比较的相对鲜重(％ )。用本发明推定 胁迫耐受性基因，或者用萤光素酶报道基因(对照)转化植物，所述基因处于At6669启动 子的转录控制下。
具体实施例方式本发明是涉及利用新的非生物胁迫耐受性基因提高植物非生物胁迫耐受性和/ 或生物量的方法，并且涉及显示出提高了对胁迫条件的耐受性和/或提高了累积生物量的 植物。参考附图及附加说明可以更好地理解本发明的原理和操作。在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应该理解，本发明不受下述描述或
中成分的构建和安排细节的限制。本发明可以有其他实施方案，或者说可用各种 方法实践或完成本发明。同样，应该理解，本文所用的用语和术语是用来描述而非限制。当将本发明付诸实施时，发明人应用生物信息学技术鉴定了编码推定非生物-胁 迫耐受性(ABST)蛋白的多核苷酸序列(实施例1)。分离所选择的序列(实施例2)，克隆 到表达载体中(实施例3-4)，再导入拟南芥植物中(实施例5)。这些在盐胁迫条件下或者 在正常条件下生长的植物，与没有携带外源ABST基因的类似植物比较，都表现出显著更高 的生物量(实施例6)。因此，按照本发明的一个方面，提供提高植物对非生物胁迫的耐受性和/或植物 生物量的方法。该方法包括在植物中表达外源多核苷酸，该外源多核苷酸与选自SEQ ID NO 1-18的多核苷酸至少有70%同源，优选至少有80%同源，更优选至少有85%同源，最优 选至少有90%同源。或者，本发明的外源多核苷酸编码具有选自SEQ ID N0:39-92的氨基 酸序列的多肽。本文所用的术语“非生物胁迫”是指对植物的代谢、生长、繁殖和/或生存力的任 何负面影响。因此，非生物胁迫能够被诸如以下的亚适环境生长条件所诱导高盐、失水、洪 涝、低温或高温、重金属毒性、无氧生活、营养缺乏、大气污染或UV辐射。本文所用的术语“非生物胁迫耐受性”是指植物承受非生物胁迫时，其代谢、生长、 繁殖力和/或生存力无重大改变的能力。适用本发明方法的植物可以是任何单子叶植物或双子叶植物，包括但不限于玉 米、小麦、大麦(barely)、黑麦、燕麦、水稻、大豆、花生、豌豆、小扁豆和苜蓿、棉花、油菜籽、 双低油菜(canola)、胡椒、向日葵、马铃薯、烟草、番茄、茄子、桉树、树木、观赏植物、多年生 牧草、饲料作物。本文所用的术语“外源多核苷酸”是指在植物中不会自然表达的核酸序列，但是当 将其导入植物中会以稳定或瞬时的方式产生至少一种多肽产物。在植物中表达本发明的外源多核苷酸，可通过下述方法付诸实施首先用外源多 核苷酸转化植物的一种或多种细胞，其次从转化细胞产生成熟植株，最后在适合所述成熟
7植株中表达所述外源多核苷酸的条件下，栽培所述成熟植株。优选转化是通过将核酸构建体导入植物细胞中来实现，该构建体包含本发明的外 源多核苷酸和至少一个能在植物细胞内指导外源多核苷酸转录的启动子。下文将提供适合 的转化方法的进一步详细说明。本文所用的术语“启动子”是指基因转录起始位点上游的DNA区，RNA聚合酶与之 结合后启动RNA的转录。启动子控制基因在何处(例如植物的哪一部分、动物的哪一器官 等等)和/或何时(例如生物体一生的哪一阶段或状态)表达。本发明的核酸构建体可采用任何合适的启动子序列。优选启动子是组成型启动 子、组织特异性启动子或非生物胁迫诱导型启动子。合适的组成型启动子包括例如CaMV 35S启动子(SEQ ID NO 19 ；Odell等，Nature 313:810-812,1985)；拟南芥 At6669 启动子(SEQ IDNO 20)；玉米 Ubi 1 (Christensen 等， Plant Sol. Biol. 18 :675-689，1992)；水稻肌动蛋白(McElroy 等，Plant Cell 2:163-171， 1990) ；pEMU(Last 等，Theor. Appl. Genet. 81 :581_588，1991)；合成的 Super MAS(Ni 等， The Plant Journal 7 :661_76，1995)。其它组成型启动子包括在以下美国专利号中的那些 启动子5，659，026,5, 608，149,5, 608，144,5, 604，121,5, 569，597,5, 466，785,5, 399，680、 5，268，463 和 5，608，142。合适的组织特异性启动子包括但不限于由例如以下文献所描述的叶特异性启动 子Yamamoto 等，Plant J. 12 :255_265，1997 ；Kwon 等，Plant Physiol. 105 :357_67，1994 ； Yamamoto等，Plant Cell Physiol 35 :773_778，1994 ;Gotor等，Plant J. 3 :509_18，1993 ； Orozco 等，Plant Mol. Biol. 23 :1129_1138，1993 ；Matsuoka 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 9586-9590,1993。合适的非生物胁迫诱导型启动子包括但不限于盐诱导型启动子，例如 RD29A(Yamaguchi-Shinozalei 等，Mol. Gen. Genet. 236 :331_340，1993)；干旱诱导型启动 子，例如玉米 rabl7 基因启动子(Pla 等，PlantMol. Biol. 21 :259_266，1993)、玉米 rab28 基因启动子(Busk 等，Plant J. 11 1285-1295，1997)和玉米 Ivr2 基因启动子(Pelleschi 等，Plant Mol. Biol. 39 =373-380,1999)；热诱导型启动子，例如番茄的热番茄hsp80_启动 子(美国专利号5，187，267)。本发明的核酸构建体还优选适当的选择标记和/或复制起点。优选所用的核酸构 建体是穿梭载体，它在大肠杆菌(E. coli)能复制(其中构建体包含适当的选择标记和复制 起点)并且与细胞增殖同步。按照本发明的构建体可以是例如质粒、杆粒、噬菌粒、粘粒、 噬菌体、病毒或人工染色体。本发明的核酸构建体可用来稳定地或瞬时地转化植物细胞。在稳定的转化中，本 发明的外源多核苷酸整合到植物基因组中，因此具有稳定遗传的性状。在瞬时转化中，外源 多核苷酸由转化的细胞表达但未整合到基因组中，因此具有瞬时性状。有多种将外源基因导入单子叶植物或双子叶植物中的方法(Potrykus，I.， Annu. Rev. Plant. Physiol. ， Plant. Mol. Biol. (1991)42 205-225 ；Shimamoto 等， Nature (1989) 338 274-276)。使外源DNA稳定整合到植物基因组DNA中的主要方法包括以下两种主要方法(i) 土壤杆菌介导的基因转移Klee 等(1987) Annu. Rev. PlantPhysiol. 38 467-486 ;Klee 禾口 Roger, CellCulture and Somatic CellGenetics of Plants,第 6 卷， Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, Schell, J.禾口 Vasil,L.K.编著，Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989)第 2-25 页；Gatenby, Plant Biotechnology, Kung, S.禾口 Arntzen，C. J.编著，Butterworth Publishers,Boston,Mass. (1989)，第 93—112 页。(ii) ^^ DNAjgA :Paszkowski Cell Culture and Somatic CellGenetics of Plants,第 6 卷，Molecular Biology of Plant Nuclear Genes. Schell, J.禾口 Vasil, L. K.编著，Academic Publishers, San Diego, Calif. , (1989)，第 52-68 页；包括原生质 体直接摄取 DNA 的方法，Toriyama, K.等(1988) Bio/Technology 6:1072-1074。植物细 胞短时电击诱导的 DNA 摄入Zhang 等，Plant Cell Rep. (1988)7:379-384。Fromm 等， Nature (1986) 319 :791_793。通过粒子轰击将DNA注入植物细胞或组织中，Klein等，Bio/ Technology (1988) 6 :559_563 ；McCabe 等，Bio/Technology (1988) 6 :923_926 ；Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79 206-209 ；采用微量加液器系统Neuhaus 等，Theor. Appl. Genet. (1987)75 :30_36 ；Neuhaus 禾口 Spangenberg，Physiol. Plant. (1990)79 :213_217 ； glass fibers or silicon carbide whisker transformation of cell cultures-embryos or callus tissue (玻璃纤维或金刚砂晶须转化细胞培养物、胚或愈伤组织)，美国专利号 5, 464, 765 nJ^by the direct incubation of DNAwith germinating pollen(DNA与萌发花 粉直接f桴育)，DeWet 等，Experimental Manipulation of Ovule Tissue, Chapman,G. P.禾口 Mantel 1, S. H.禾口 Daniels，W.编著，Longman, London, (1985)，第 197—209 页；Ohta, Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1986) 83 :715_719。土壤杆菌系统包括采用质粒载体，其含有整合到植物基因组DNA中的确定DNA片 段。植物组织的接种方法随植物种和土壤杆菌传递系统而变化。广泛应用的方法是叶圆片 法，可用任何组织的外植体来进行，它为启动整株植物分化提供良好来源。Horsch等，Plant MolecularBiology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht(1988),第 1-9 页。一种补充的方法是用土壤杆菌传递系统与真空渗入相结合。土壤杆菌系统在创造转基 因双子叶植物方面特别有前途。有多种直接转移DNA进入植物细胞的方法。电穿孔法，就是将原生质体短时暴露 于强电场。微量注射法，就是用极细的微量加液器将DNA直接机械注入细胞内。微粒轰击 法，就是使DNA吸附在微粒上例如硫酸镁晶体或钨粒子上，然后用物理方法将微粒加速使 其进入细胞或植物组织内。稳定转化后，进行植物繁殖。最常用的方法是用种子进行植物繁殖。然而由于杂 合性，作物缺乏均一性，因此用种子繁殖再生有缺陷，因为植物是按照孟德尔定律控制的遗 传变异产生种子。基本上，每粒种子在遗传上都是不同的，每粒种子的生长都会有其独特的 性状。因此，优选产生转化植物，致使再生的植物有亲本转基因植物的相同性状和特征。因 此，优选用微型繁殖法(micropropagation)再生转化植物，它能快速地、一致地繁殖转化 植物。微型繁殖法是用从所选择的亲本植物或栽培品种切下的一块组织来培育新一代 植物的方法。这个方法能大量繁殖具有表达融合蛋白的优选组织的植物，所产生的新一代 植物在遗传上与原始植物完全相同，且有其全部特征。微型繁殖法能在短期内大量生产优 质的植物材料、快速繁殖所选择的保持原始转基因植物或原始转化植物特征的栽培品种。克隆植物的优点在于植物繁殖的速度，所产生植物的品质一致。微型繁殖法是多阶段方法，各阶段间需要改变培养基或生长条件。因此，微型繁殖 法包括四个基本阶段第一阶段，初始组织培养；第二阶段，组织培养物扩增；第三阶段，分 化和植株形成；第四阶段，温室栽培和锻练。在第一阶段，初始组织培养，建立组织培养物 并保证无污染。在第二阶段，初始组织培养物扩增直至组织样本的数量足以满足生产要求。 在第三阶段，使第二阶段长出的组织样本分裂，直到长成单个小植株。在第四阶段，将转化 小植株转入温室进行锻练，在此植株对光的耐受性逐渐提高，以便它能在自然环境中生长。优选如上所述所产生的成熟转化植物根据非生物胁迫耐受性作进一步选择。因 此，将转化植物和未转化(野生型)植物暴露在非生物胁迫条件下，例如失水、亚适温度、营 养缺乏或优选盐胁迫条件下。盐胁迫可以多种方式实现，例如给植物灌溉高渗溶液、在高渗 生长溶液(例如Hoagland溶液)中水培法栽培植物或者在高渗培养基(例如MS培养基)中 培育植物。由于不同植物对盐的耐受性极其不同，因此灌溉水、生长溶液或生长培养基中的 盐浓度优选按照特定的植物的栽培品种或变种的特殊特征进行调节，以便对植物的生理学 和/或形态学施以温和或适度的影响(关于适当浓度的指南请参见Bernstein和Kafkafi， Root Growth Under Salinity Stress :Plant Roots,The Hidden Half,第三版,Waisel Y, Eshel A 禾口 Kafkafi U.(编著)Marcel Dekker Inc.，NewYork，2002 及其中的参考文献)。 随后，时时监测暴露于胁迫条件下的植物直至野生型植物出现重大的生理学和/或形态学 影响。接着，没有表现出重大生理学和/或形态学影响的转化植物，或者表现出生物量高于 野生型的转化植物则被鉴定为非生物胁迫耐受性植物。虽然现在优选稳定的转化作用，但是叶细胞、分生组织细胞或整株植物的瞬时转 化也受本发明重视。瞬时转化可用上述任何一种直接DNA转移方法，或用修饰植物病毒的病毒感染来 实现。在转化植物宿主中表明有用的病毒包括CaMV、TMV和BV。用植物病毒转化植物 在以下文献中有描述美国专利号4，855，237 (BGV)、EP-A 67，553 (TMV)、日本公开申请号 63-14693 (TMV) ,EPA194, 809 (BV) ,EPA 278, 667 (BV)；和 Gluzman，Y.等，Communicationsin Molecular Biology :Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York,第 172-189页(1988)。在W087/06261中描述了在许多宿主(包括植物)中表达外源DNA所 用的假病毒颗粒。优选本发明的病毒是无毒的因而不能引致严重症状例如降低生长速率、花叶、环 斑、卷叶、黄叶、条纹、长痘、长瘤和陷斑。合适的无毒病毒可以是天然存在的无毒病毒或 人工减毒的病毒。病毒的减毒可用本领域通晓的方法来实施，包括但不限于亚致死加热、 化学处理或定点诱变技术，例如 Kurihara 禾口 Watanabe (Molecular PlantPathology 4 259-269，2003)、Gal-on 等(1992)、Atreya 等(1992)和 Huet 等(1994)所描述的。合适的病毒株可从现有的资源取得，例如美国典型培养物保藏中心(American Type culture Collection，ATCC)或从感染植物中分离。从感染植物组织中分离病 毒可用本领域通晓的技术进行，例如由Foster和Tatlor编著，‘‘Plant Virology Protocols :From Virus Isolation toTransgenic Resistance(Methods in Molecular Biology (Humana卩1~)，第81卷)〃，Humana Press，1998。简而言之，将认为含有高浓度合适病毒的感染植物的组织，优选嫩叶和花瓣，在缓冲液(例如磷酸缓冲液)中研磨获得病毒 感染液，其可在后续接种中使用。植物RNA病毒的构建，将非病毒外源多核苷酸序列导入植物中并使其表达，已为 上述和下述文献所证实Dawson，W. 0.等，Virology (1989) 172 :285_292 ；Takamatsu 等， EMBO J. (1987)6 :307_311 ；French 等，Science (1986) 231 1294-1297 ；Takamatsu 等，FEBS Letters(1990)269 :73_76。当病毒是DNA病毒时，可对病毒本身进行适当修饰，或者，为了便于构建所需的含 有外源DNA的病毒载体，可将病毒首先克隆到细菌质粒上。然后，从质粒切下病毒。如果病 毒是DNA病毒，则可将细菌的复制起点与病毒DNA连接，再由细菌复制。该DNA的转录和翻 译将产生外壳蛋白，将病毒DNA包入其中。如果病毒是RNA病毒，通常进行cDNA克隆，再插 入质粒中。然后用该质粒进行所有的构建。然后，经过转录质粒的病毒序列，翻译病毒基因 产生外壳蛋白，给病毒RNA包衣壳，产生RNA病毒。植物RNA病毒的构建，将非病毒外源多核苷酸序列(例如在本发明构建体中所包 括的那些序列)导入植物中并使其表达，已为上述文献以及美国专利号5，316，931所证实。在一个实施方案中，提供植物病毒多核苷酸，其中在病毒多核苷酸中缺失了天然 外壳蛋白的编码序列，插入了非天然植物病毒外壳蛋白编码序列和非天然启动子、优选非 天然外壳蛋白编码序列的亚基因组启动子，其能在植物宿主内表达，包装重组植物病毒多 核苷酸，确保宿主被重组植物病毒多核苷酸系统感染。另一方面，外壳蛋白基因可以因插入 其中的非天然多核苷酸序列所失活，因此产生蛋白。重组植物病毒多核苷酸可含有一个或 多个另外的非天然亚基因组启动子。每个非天然亚基因组启动子能在植物宿主内转录或表 达相邻基因或多核苷酸序列，但不能彼此重组，也不能与天然亚基因组启动子重组。如果包 括不止一个多核苷酸序列，那么非天然(外源)多核苷酸序列可以邻近在天然植物病毒亚 基因组启动子或天然和非天然植物病毒亚基因组启动子插入。在寄主植物中，非天然多核 苷酸序列在亚基因组启动子的控制下转录或表达，产生所需产物。在第二个实施方案中，提供重组植物病毒多核苷酸，如同在第一个实施方案中一 样，只是将天然外壳蛋白编码序列置于一个非天然外壳蛋白亚基因组启动子邻近位置而不 是置于非天然外壳蛋白编码序列邻近位置。在第三个实施方案中，提供重组植物病毒多核苷酸，其中天然外壳蛋白基因邻近 其亚基因组启动子，在所述病毒多核苷酸中插入了一个或多个非天然亚基因组启动子。所 插入的非天然亚基因组启动子能够在植物宿主内转录或表达相邻基因，但不能彼此重组， 也不能与天然亚基因组启动子重组。非天然多核苷酸序列可以邻近在非天然亚基因组植物 病毒启动子插入，以便在寄主植物中，所述序列在亚基因组启动子的控制下转录或表达，产 生所需产物。在第四个实施方案中，提供重组植物病毒多核苷酸，如同在第三个实施方案中一 样，只是天然外壳蛋白编码序列被非天然外壳蛋白编码序列所置换。病毒载体被由重组植物病毒多核苷酸编码的外壳蛋白包入衣壳内，产生重组植物 病毒。重组植物病毒多核苷酸或重组植物病毒常常用来感染合适的寄主植物。重组植物病 毒多核苷酸能在宿主内复制、在宿主内系统分布、在宿主内转录或表达外源基因(外源多 核苷酸)，产生所需的蛋白质。
11
给植物接种病毒的技术可在以下文献中找到Foster和Taylor编著，"Plant Virology Protocols :From Virus Isolation to TransgenicResistance(Methods in Molecular Biology(Humana Pr),第 81 卷) “,Humana Press,1998 ；Maramorosh 禾口 Koprowski 编著，“Methods inVirology“,第 7 卷,Academic Press,New Yorkl967_1984 ； Hill, S Α. “ Methods in Plant Virology “ , Blackwell, Oxford,1984 ；ffalkey, D.G. Α. “ Applied Plant Virology “ , Wiley, New York,1985 ；Kado 禾口 Agrawa 编 著，“Principles and Techniques in Plant Virology" , Van Nostrand-Reinhold, New York。除上所述，也可以将本发明的多核苷酸引入叶绿体基因组中，从而能使叶绿体表达。将外源多核苷酸序列引入叶绿体基因组中的技术是已知的。该技术包括下述程 序。首先，化学处理植物细胞以减少每个细胞叶绿体的数目至大约一个。然后，用粒子轰击 将外源多核苷酸导入细胞中，旨在将至少一个外源多核苷酸分子导入叶绿体中。选择外源 多核苷酸以便通过同源重组整合到叶绿体基因组，这由叶绿体所固有的酶容易实现。最后， 除了目标基因外，外源多核苷酸还包括至少一段源自叶绿体基因组的多核苷酸序列。此外， 外源多核苷酸包括选择标记，其用作通过序贯选择程序确保选择后全部或几乎全部的叶绿 体基因组拷贝包括外源多核苷酸。有关该技术更详细的内容参见美国专利号4，945，050和 5，693，507，所述专利通过引用结合到本文中。因此，多肽可由叶绿体的蛋白质表达系统产 生并且可以整合到叶绿体内膜中。由于植物非生物胁迫耐受性可以包括多个起相加作用或协同作用的基因(参见 例如Quesda等，Plant Physiol. 130 :951_063，2002)，本发明也提出在一种寄主植物中表 达多种外源多核苷酸，从而获得优良的非生物胁迫耐受性。在一种寄主植物中表达多种外源多核苷酸，可通过将多个核酸构建体共同导入一 个植物细胞中来实现，每个核酸构建体都包括不同的外源多核苷酸。可用本文上述方法将 转化细胞再生成为成熟植株。或者，在一种寄主植物中表达多种外源多核苷酸，也可通过将一个包括多个不同 的外源多核苷酸的核酸构建体共同导入一个植物细胞中来实现。可以设计具有一个启动子 序列的构建体，该启动子序列能够转录包括所有不同外源多核苷酸序列的多顺反子信使。 为了能共同翻译由多顺反子信使编码的不同多肽，多核苷酸序列可以通过内部核糖体进入 位点(IRES)序列相互连接，该核糖体进入位点序列促进位于IRES序列下游的多核苷酸序 列的翻译。在这种情况下，所转录的编码上述不同多肽的多顺反子RNA分子，自加帽的5’ 端起开始翻译，而且自多顺反子RNA分子的两个内部IRES序列开始翻译，从而在细胞内产 生所有不同的多肽。或者，构建体可以包括几个启动子序列，每个启动子序列都与不同的外 源多核苷酸序列连接。使用上文所述方法，可以将用包括多种不同的外源多核苷酸的构建体转化的植物 细胞再生成为成熟植株。或者，在一种寄主植物中表达多种外源多核苷酸，可以通过将不同的核酸构建体 导入多种植物中来实现，其中所述不同的核酸构建体包括不同的外源多核苷酸。然后，可以 采用常规植物育种技术，让再生的转化植物杂交，从所产生的子代中选出具有优良的非生
12物胁迫耐受性和/生物量性状的子代。因此，本申请提供利用新的非生物胁迫耐受性基因安全、经济有效地提高各种经 济作物的非生物胁迫耐受性和/或生物量的方法。对本领域普通技术人员来说，通过以下非限制性的实施例，本发明的其它目的、优 势和新的特征，是显而易见的。另外，本文上述的和在所附权利要求部分中要求保护的本发 明的各个不同的实施方案和各个不同的方面，都可以在以下实施例中找到实验支持。实施例下面参考以下实施例以及上文的描述，以非限制性的方式说明本发明。一般而言，本文所用的命名法和本发明中所用的实验室程序包括分子技术、生 物化学技术、微生物学技术和重组DNA技术。这些技术在文献中都有详细的解释。参见 例如‘‘Molecular Cloning :Alaboratory Manual ‘‘ Sambrook 等(1989) ； ‘‘ Current Protocols in MolecularBiology “第 I-III 卷 Ausubel，R. M.编著(1994) ；Ausubel 等，“CurrentProtocoIs in Molecular Biology“ , John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989) ；Perbal, " A Practical Guide to Molecular Cloning ", Johnffiley&Sons, New York(1988) ；Watson 等， “Recombinant DNA “，Scientific American Books, New York ；Birren 等(编著) "GenomeAnalysis :A Laboratory Manual Series “,第 1-4 卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)； 美国专利号 4，666，828,4, 683，202,4, 801，531,5, 192，659 和 5，272，057 中所述的 方法；“Cell Biology =ALaboratory Handbook “，第 I-III 卷 Cellis, J. E.编著 (1994) ；〃 CurrentProtocols in Immunology"，第 I-III 卷，Coligan J. Ε.编著(1994)； Stites 等(编著)，“Basic and Clinical Immunology “(第 8 版)，Appleton&Lange, Norwalk, CT (1994) ；Mishell 和 Shiigi (编著)，“Selected Methods inCellular Immunology “ , W. H. Freeman and Co. , New York(1980)；通用的免疫测定在专利文献 和科学文献中有全面的描述，参见例如美国专利号3，791,932,3,839, 153,3,850, 752、 3，850，578,3，853，987,3，867，517,3，879，262,3，901，654,3，935，074,3，984，533, 3，996，345,4, 034，074,4, 098，876,4, 879，219,5, 011，771 和 5，281，521 ； “ Oligonucleo tideSynthesis “ Gait, Μ. J. Hlr (1984) ； “ Nucleic Acid Hybridization " Hames, B. D.禾口 Higgins S. J.编著，(1985) ； “ Transcription and Translation “ Hames, B. D.和 Higgins S.J.编著，(1984) ； “ Animal Cell Culture “ Freshney, R. I.编著 (1986) ；〃 Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986) ；〃 APractical Guide to Molecular Cloning" Perbal，B.，(1984)；禾口" Methodsin Enzymology“，第 1-317卷， Academic Press ； “ PCR Protocols :A GuideTo Methods And Applications" ,Academic Press,San Diego,CA(1990) ；Marshak " Strategies for Protein Purification and Characterization-ALaboratory Course Manual" CSHL Press (1996) ；IjfWSiSilK^iS 过引用全部结合到本文中。通过本文件还可以提供其他的一般性参考文献。相信其中这些 程序是本领域众所周知的，只是为方便读者而提供。除非另有定义，否则本文所用的所有科技术语的含义与本发明所属领域普通技术 人员所理解的含义相同。虽然在本发明的实践或检验中可应用与本文描述的类似或等同的 方法与材料，但是下文还是说明了合适的方法与材料。
实施例1鉴定推定非生物胁迫耐受性基因推定非生物胁迫耐受性(ABST)基因选自番茄表达序列标签(EST)和cDNA的NCBI 数据库。数据库序列是用LEADS 软件(Compugen)聚类和装配的。聚类导致超过20，000 个聚类，每一聚类都代表不同的基因。通过汇集包括在含每个聚类的序列记录中的全部关 键词，汇编了每个聚类的表达概况。然后筛选包括来源于文库的多核苷酸的聚类，该文库用 与ABST有关的关键词确认。将所选聚类进一步过滤，排除任何每个聚类包括超过100EST 的聚类和/或任何少于50%序列用ABST相关关键词注释的聚类。现有技术ABST植物基因可从下述出版物确认=Quesada等(PlantPhysiol. 130 951-963,2002) ；Apse禾口Blumwald(Curr Opin Biotechnol. 13 146-150，2002) ；Rontein等 (Metab Eng 4 =49-56,2002)；及其中的参考文献。运用BLAST程序，将已知的植物ABST基因 与聚类的番茄核酸序列进行比对。e-分值小于5的番茄序列被鉴定为ABST直向同源物。通 过使用关键词“root (根)”、“crown gall (冠瘿)'V'nutrient (营养物)”、“callus (愈伤组 织)”、“disease (病害)”、“pathogen (病原体)”、“elicitor (激发子)”和“pseudomonas (假 单胞杆菌)”，可搜索聚类的番茄序列记录，鉴定出另外的现有技术番茄ABST基因。最后，将所有经鉴定的现有技术ABST基因与如上所述选择的番茄基因聚类输出 组匹配(运用BLAST软件进行序列比对)。结果，在与现有技术ABST基因匹配的聚类输出 组中所选出的基因的大约40%被证实是已知的ABST基因，表明所选聚类的其余基因能够 潜在提高植物的非生物胁迫耐受性。运用Vector NTI 程序组(suite) (InforMax, U. K.)第 6 版(HastingSoftware, Inc :www. Renerunner. com/)，根据ORF (可读框)的存在，对所选出的多核苷酸序列(表la) 进行分析。使用Blast (www, ncbi. nlm. nih. rov/BLAST/)，将每个这样的多核苷酸序列中所 鉴定的ORF与Genbank数据库序列进行比较；将表现出与一个或多个Genbank序列有最高 同源性的ORF作图，以鉴定ATG起始密码子。然后，将该ORF的ATG起始密码子位置与经鉴 定的多核苷酸序列的ATG起始密码子位置进行比较，以证实本文所述的18个序列中的每个 序列都包括全长ORF和ATG起始密码子(因而鉴定为“推定ABST基因”)。表 Ia推定ABST基因
ABST No.SEQ ID No.1132536410511612719822924102611
1权利要求
一种提高植物对非生物胁迫的耐受性的方法，该方法包括在植物中表达外源多核苷酸，该外源多核苷酸编码的多肽与选自SEQ IDNO1 17或18编码的氨基酸序列至少有80％同源，因而能提高植物对非生物胁迫的耐受性。
2.一种提高植物生物量的方法，该方法包括在植物中表达外源多核苷酸，该外源多核 苷酸编码的多肽与选自SEQ ID NO :1-17或18编码的氨基酸序列至少有80%同源，因而能 提高植物的生物量。
3.权利要求1的方法，其中所述表达通过下述步骤来实现(a)用所述外源多核苷酸转化所述植物的细胞；(b)从所述细胞产生成熟植株；(c)在适合所述成熟植株中表达所述外源多核苷酸的条件下，栽培所述成熟植株。
4.一种核酸构建体，该核酸构建体包括编码与选自SEQ ID N0:l-17或18编码的氨基 酸序列至少有80%同源的多肽的多核苷酸和能够在宿主细胞中指导所述多核苷酸转录的 启动子。
5.一种分离的多肽，所述多肽包含与选自SEQ ID N0:l-17或18编码的氨基酸序列至 少有80%同源的氨基酸序列。
6.一种植物细胞，所述植物细胞包含编码与选自SEQ ID N0:l-17或18编码的氨基酸 序列至少有80%同源的多肽的外源多核苷酸。
7.权利要求1或2的方法，其中所述表达通过下述步骤来实现(a)用所述外源多核苷酸转化所述植物的细胞；(b)从所述细胞产生成熟植株；和(c)在适合所述成熟植株中表达所述外源多核苷酸的条件下，栽培所述成熟植株。
8.权利要求6的方法，其中所述转化是通过将核酸构建体导入所述植物细胞中来实 现，该核酸构建体包括所述外源多核苷酸和至少一个能够在所述植物细胞中指导所述外 源多核苷酸转录的启动子。
9.权利要求7的方法或权利要求3的核酸构建体，其中所述至少一个启动子是组成型 启动子。
10.权利要求7的方法或权利要求3的核酸构建体，其中所述组成型启动子是CaMV 35S启动子。
11.权利要求7的方法或权利要求3的核酸构建体，其中所述组成型启动子是At6669启动子。
12.权利要求7的方法或权利要求3的核酸构建体，其中所述至少一个启动子是诱导型 启动了。
13.权利要求7的方法或权利要求3的核酸构建体，其中所述诱导型启动子是非生物胁 迫诱导型启动子。
14.权利要求1或2的方法，其中所述表达是通过用包括所述外源多核苷酸的病毒感染 所述植物来实现。
15.权利要求13的方法，其中所述病毒是无毒病毒。
16.权利要求1的方法，其中所述非生物胁迫选自高盐、失水、低温、高温、重金属毒性、 无氧生活、营养缺乏、营养过剩、大气污染和紫外辐射。
17.权利要求1或2的方法，其中所述植物是双子叶植物。
18.权利要求1或2的方法，其中所述植物是单子叶植物。
19.权利要求3的核酸构建体，其中所述宿主细胞是植物细胞。
20.权利要求1或2的方法、权利要求3的核酸构建体、权利要求4的分离的多肽或权 利要求5的植物细胞，其中所述氨基酸序列选自SEQ ID N0:39-92。
全文摘要
本发明提供了提高植物非生物胁迫耐受性和/或生物量的方法及用该方法所产生的植物。本发明提供了提高植物对非生物胁迫的耐受性和/或增加植物的生物量的多核苷酸序列及其使用方法。
文档编号C12N15/82GK101942449SQ20091021713
公开日2011年1月12日 申请日期2004年5月20日 优先权日2003年5月22日
发明者E·戈兰, G·罗南, H·卡奇, R·梅斯纳 申请人:伊沃基因有限公司