专利名称：性传播疾病检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种性传播疾病的检测技术，特别是检测人生殖器分泌物病原体的检 测方法，试剂盒以及相应的引物。
背景技术：
性传播疾病(sexually transmitted disease STD)既是人类最古老的疾病之一， 也是世界上发病最广泛的传染病。STD是一类主要通过已感染者与未感染者之间的性接触 而传播的疾病，它的概念已从过去经典的5种病原体导致的疾病扩展为与性行为接触密切 相关的20余种病原体引起的传染病。近年来，STD发病率呈现上升趋势，由1980年全国仅 报告48例STD感染者到2000年全国报告感染者859040例，STD在我国迅速蔓延。STD可 引起男、女泌尿生殖道感染，造成不孕不育甚至癌变。目前STD的流行已对人群健康构成了 严重威胁。此外，大约有50%的STD患者无症状，若因诊断延误导致治疗不及时不仅会成为 重要传染源进一步加速STD的传播，而且会导致一系列并发症和后遗症的发生，严重危害 人群健康。多种STD病原体混合感染率是目前STD防治工作的新挑战，据估计目前STD病 原体混合感染率高达观.8%。淋球菌(NG)，沙眼衣原体(CT)和解脲支原体(UU)是泌尿生 殖系统STD中的最主要病原体，同时也是最易产生混合感染的3种病原体。快速有效地检 测NG，CT和UU病原体的携带者是积极干预STD传播及治疗STD患者的前提。目前淋球菌(NG)，沙眼衣原体(CT)和解脲支原体(UU)的病原学检测方法包括培 养法和非培养法。培养法敏感、特异，是金标准，但其耗时过长、对标本的采集与运送要求高 使其不能满足临床和疾病控制的需要。非培养法(如检测NG感染常用的涂片革兰氏染色 和CT感染常用的ELISA法)简便但敏感性低，易受干扰。因此开发并普及新的检测方法意 义重大。近年来发展起来的荧光定量PCR(Fluorescence Quantitative PCR，FQ-PCR)技 术已经在基因表达水平分析病原体的定性和定量检测等方面得到广泛运用，并以其特异度 高，灵敏度高，精确，快速的优势成为STD病原体非培养法临床检测的重要方法之一。但是， 目前的NG，CT和UU检测荧光定量PCR试剂盒均为一病一盒，一次只能检测一种病原体，不 利于混合感染的检测，此外，FQ-PCR技术对检测设备要求和操作人员要求高，不利于在中国 广大基层医疗机构中的普及和推广，同时，检测一种性病病原体就需要做一次PCR试验，这 一方面增加了医务人员的工作量，同时加大了标本被污染的可能性，另一方面也极大的增 加了成本。因此，利用PCR技术高效精确的优势，开发更加经济、简便而又拥有高特异度和 灵敏度的淋球菌(NG)，沙眼衣原体(CT)和解脲支原体(UU)快速检测手段，有利于降低检测 费用和检测周期，使之更好的用于临床的普及推广及流行病学调查。近年来产生的多重PCR技术(Multiplex PCR US2002/037238)正在被用于临床检 验令页域，如Multiple PCR primer group for human HNF-Ialpha gene amplification, KR 80909/2001 ；RHD and ABO genotyping by multiplex PCR, W02006/032897 ；检测乳腺 癌易感基因突变的多重PCR试剂盒及其制备方法，CN101200766等。其中，该技术在检测STD感染方面的应用包括:Rapid one step detection of pathofenic bacteria in urine with sexually transmitted disease (STD) and prostatitis patient by multiplex PCR assay (mPCR), Sang Rok Lee, The Journal of Microbiology, 0ctober2007, p. 453-459 ；Multiplex PCR-RLB检测常见性病病原体的实验研究，中国学位论文文摘数 据库；单管多重PCR技术快速检测四种性传播疾病的病原菌，唐文志，现代检验医学杂 志-2008. 23(6).-16-19 等。国内外未见一种检测淋球菌(NG)、沙眼衣原体(CT)和解脲支原体(UU)的银染试 剂盒。同时，未见采用多重PCR技术同时检测淋球菌(NG)、沙眼衣原体(CT)和解脲支原体 (UU)三种病原体DNA并使用银染法进行分离检测的方法。鉴于目前性传播疾病的高发态势，迫切需要开发一种检测效率高，成本低廉，便于 基层卫生部门使用的检测方法和试剂盒。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测人性传播疾病的试剂盒，其含有1 3对引物， 分别特异性扩增来自下列病原体的基因淋球菌、沙眼衣原体和/或解脲支原体；所述的引物选自以下序列
SEQIDNO:15，CCTATCGGGCTGTTATCTGATTATGG 3'
SEQIDNO:25，AAGAAGAGGTCGGGTTGGGTGTAT 3'
SEQIDNO:35，CTTCCCCAGAACAATAAGAACACA 3'
SEQIDNO:45，TAGGGATTCCTGTAACAACAAGTCA 3'
SEQIDNO:55，TAAATGTCGGCTCGAACGAG 3'
SEQIDNO:65，GCAGTATCGCTAGAAAAGCAAC 3，。
更具体地，所述病原体基因为淋球菌Pjdl质粒基因、沙眼衣原体Plgv440隐蔽性
质粒基因和/或解脲支原体16S rRNA编码区V5和V7区域的基因；其核苷酸序列分别如 SEQ ID NO :7、SEQID NO :8 和 / 或 SEQ ID NO 9 所示。优选的，所述试剂盒含有3对引物，序列如SEQ ID NO :1 6所示，更进一步的还 包含银染试剂。本发明的另一个目的是提供一种检测人生殖器分泌物是否含性传播疾病病原体 的方法，包括以下步骤1)提取待检样本中的DNA ；2)用1 3对引物对样本中的DNA进行扩增，所述引物如SEQ ID NO :1 6所示；3)用银染试剂液染色，对DNA扩增结果进行检测。在上述方法的步骤2)中，扩增条件为，循环参数94°C 4min,94°C 30s,62°C 30s, 68 72°C，30s, 36 个循环，最后 72°C IOmin。本发明的再一个目的是提供一种选自如SEQ ID NO :1 6所示寡核苷酸序列的用 途，其用于扩增或检测来自下列病原体的基因淋球菌、沙眼衣原体和/或解脲支原体。更进一步的，是被用于扩增或检测淋球菌Pjdl质粒基因、沙眼衣原体Plgv440隐 蔽性质粒基因和/或解脲支原体16S rRNA编码区V5和V7区域的基因。与最接近的现有技术相比，如单管多重PCR技术快速检测四种性传播疾病的病原菌，唐文志，现代检验医学杂志-2008. 23(6).-16-19 ；盆腔炎、宫外孕、孕妇阴道炎与NUC 感染关系的研究，金春子，中国优生与遗传杂志-2001 (Si)；膜芯片技术检测泌尿生殖道 沙眼衣原体、淋病奈瑟菌和3种支原体的方法学研究，熊礼宽，中华微生物学和免疫学杂 志-2007. 27 (8) ·-758-761 ；以及 Rapid one step detection of pathofenic bacteria in urine with sexually transmitted disease (STD) and prostatitis patient by multiplex PCR assay(mPCR), Sang Rok Lee, The Journal of Microbiology, October 2007，p. 453-459等本发明具有如下特点1.高效准确；2.实现了在同一反应体系中同步检测淋球菌(NG)、沙眼衣原体(CT)和解脲衣原 体(UU) 3种病原体；3.特异性好；4.使用银染方法检测PCR反应结果灵敏度好；5.步骤简单，可重复性高；6.成本低廉，费用上预计比传统单重荧光PCR方法节省70% (检测费用控制在30 元左右)；7.对实验设备和实验人员要求低。下面结合具体实审方式对本发明作进一步说明，但是并非对发明的限制。
图1标准菌株多重PCR技术测试结果泳道1，2表示NG，CT, UU三菌混合样本扩增结果；泳道3表示UU，NG两菌混合样 本扩增结果；泳道4表示CT，NG两菌混合样本扩增结果；泳道5表示UU，CT两菌混合样本 扩增结果；泳道6，7，8分别表示NG，UU, CT单菌株样本扩增结果，M泳道为分子量标记。大肠埃希菌干扰试验结果图2大肠埃希菌干扰试验结果泳道1.三重复合体系中大肠埃希菌干扰扩增；泳道2，3，4，二重复合体系中大肠 埃希菌干扰扩增；泳道5，6，7，单一菌体系中大肠埃希菌干扰扩增；泳道8，9，10，11，分别为 标准菌株不加入大肠埃希菌临床标本进行单一和复合扩增结果，M泳道为分子量标记。图3金黄色葡萄球菌干扰试验结果泳道1.三重复合体系中金黄色葡萄球菌干扰扩增；泳道2，3，4，二重复合体系中 金黄色葡萄球菌干扰扩增；泳道5，6，7，单一菌体系中金黄色葡萄球菌干扰扩增；泳道8，9， 10，11，分别为标准菌株不加入金黄色葡萄球菌临床标本进行单一和复合扩增结果，M泳道 为分子量标记。
具体实施例方式本发明试剂盒的原理是根据性传播疾病病原体如淋球菌(NG)，沙眼衣原体(CT) 和解脲支原体(UU)的特征基因设计引物，从人生殖器分泌物样本中扩增相关基因片断，结 合银染试剂液进行电泳检测，于紫外仪上观察，对照阳性分子量标准，若相应位置上出现条 带则为该病原菌阳性，从而诊断患者是否患有相应的性传播疾病。
本发明通过genbank选定了目标基因，并通过实验将靶基因筛选出来，如，病原体 如淋球菌(NG)的检测靶基因为淋球菌Pjdl质粒基因674bp-844bp产物长度171bp，如 SEQ ID NO :7所示；沙眼衣原体(CT)的检测靶基因为沙眼衣原体Plgv440隐蔽性质粒基因 63bp-269bp产物长度207bp，如SEQ IDNO :8所示；解脲支原体(UU)的检测靶基因为解脲支 原体16S rRNA编码区V5和V7区域432bp_732bp产物长度313bp,如SEQ ID NO 9所示。另外，本发明针对上述靶基因进行引物设计并对特异性引物进行了优化(选择)， 这些引物同时存在于同一试剂盒中不会发生相互竞争，可以采用单管多重PCR技术对NG， CT和UU进行同步检测，检测快速，对标本运送条件要求不高，标本采集方便，具有高敏感性 和特异性；银染琼脂电泳分离检测技术是一项成熟的技术，本发明将多重PCR方法和银染 法有机组合，利用银染电泳法检测扩增结果，可以方便地对上述3种病原体单独或混合感 染进行同步检测。本发明中未注明具体实验条件的实验方法，均参照教科书《医学分子生物学》(第 二版)中国协和医科大学出版社出版或参照厂商建议的条件。试验方法1. DNA提取参照厂商建议的条件；2.多重PCR技术；3.银染电泳法实施例一本发明弓丨物设计与合成根据淋球菌(NG)，沙眼衣原体(CT)和解脲支原体(UU)的特征基因，即淋 球菌Pjdl质粒基因674bp-844bp产物长度171bp，序列如SEQ ID N0:7所示(即序 ^lJ cctatcgggctgttatctgattatggttattttgacatagttgtatcatcttaaaaacaagcatacaatc tgcaaatcttagacaaagcaaaacccccgccaaacgccaatctgcacgggggtttcgagatacaacatgagcc aattatacacccaacccgacctcttctt)；沙眼衣原体 Plgv440 隐蔽性质粒基因:63bp-269bp 产物长度 207bp,序列如 SEQ ID NO :8 所示(艮序列 cttccccagaacaataagaacacacac tttgtctcgatgagagacaggaaatacgcatgatttcctca tcttttaatcctatttgctttaaatgaatca aagcgcttgcacgaagtactctgggagtaatttttattttcatagcactatggaactctgcaagcctaaaatt atgcgcaacctgacttgttgttacaggaatcccta)；解脲支原体 16S rRNA 编码区 V5 禾口 V7 区 : :432bp-732bp Zfe ^lJ ix iS 313bp (艮口 )ψ 歹Ij taaatgtcggctcgaacgagtcggtgttgtagctaacg cattaaatgatgtgcctgggtagtacattc gcaagaatgaaactcaaacggaattgacggggacccgcacaagtgg tggagcatgttgcttaatttgacaatacacgtagaaccttacctaggtttgacatctattgcgacgctatagaaata tagttgaggttaacaatatgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgc aacgagcgcaacccctttcgttagttgcttttctagcgatactgc),序列如SEQ ID NO :9所示,设计出如 SEQ ID NO :1 6所示的特异性引物(Primer priemer5. 0和oligo 6.0软件评价较好，摸 索条件实验证明有效)，按照公知方法合成如下引物SEQIDNO:15，CCTATCGGGCTGTTATCTGATTATGG
SEQIDNO:25，AAGAAGAGGTCGGGTTGGGTGTAT 3
SEQIDNO:35，CTTCCCCAGAACAATAAGAACACA
SEQIDNO:45，TAGGGATTCCTGTAACAACAAGTCA
SEQIDNO:55，TAAATGTCGGCTCGAACGAG 3'
SEQIDNO:65，GCAGTATCGCTAGAAAAGCAAC 3，上述引物能够特异扩增病原体的基因，并且相互之间不会发生干扰和抑制。实施例二本发明引物的特异性实验
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1.标本来源三种标准菌株淋球菌(NG)，沙眼衣原体(CT)和解脲支原体(UU)均 由四川大学华西医院微生物实验室提供，制成悬液后-20摄氏度暂时保存；2.材料和方法试剂=(I)DNA裂解液又称预反应液，包含50mmol/LNaOH，l(toimol/L Tris-HCL, PH 8.0，体积分数为 1% Triton X-100，体积分数为 1% NP-40,0. 5mmol/L EDTA PH 8. 0。(2)扩增反应管在本发明中，扩增反应管为75ul的反应体系，具体包含=Reaction buffer(10*)7. 5ul ；DNTP(IOmmol) 1.5ul ；Taq 醇[TaKaRa Bio-technology(Dalian) CO. Ltd] (5U/ul) :1. 5ul ；Mg2+(25mmol/ul) :4. 5ul ；弓丨物(20P):淋球菌 NG, Sense Iul， Antisense Iul (引物 SEQ ID NO 1,2)和沙眼衣原体 CT，Sense 0. 5ul, Antisense 0. 5ul (引物 SEQ ID N0:3、4)以及解脲支原体 UU，Sense Iul,Antisense Iul (引物 SEQ ID NO 5,6)；补水441ul ；另外6ul为模板，来源于经上述DNA裂解液处理后的标本。(3)标准阴性质量控制液标准阴性质量控制液为无菌双蒸水。(4)银染试剂液银染试剂液包含30%聚丙烯酰胺、&ΤΒΕ、10%过硫酸胺、TEMED、固定液(100ml 无水乙醇，5ml冰醋酸)、0. 2% AgNO3U. 5% NaOH和37%甲醛单管分装，使用时按下述使用 步骤混合。方法1)使用前述DNA裂解液提取标本中的DNA 标本加入裂解管后，摇勻20s，室 温静置20min，14000rpmX IOmin离心后即可。离心后的标本加入TE缓冲液(pH8. 0) (lOmol/ L Tris-Cl,2mmol/L EDTA)溶解DNA_20°C保存，或直接用于检测；2).取6ul步骤1)的DNA提取液加入前述的扩增反应管中进行扩增，扩增条件如 下，循环参数94°C 4min,94°C 30s, 62°C 30s，68_72°C (注此范围任意温度均可)30s，36 个循环，最后72 °C IOmin ；3).使用前述的银染试剂液进行DNA扩增结果检测，其步骤如下a.配胶30%聚丙烯酰胺09 l)8ml,5xTBE 8ml，定容至40ml，加10%过硫酸胺 200ul ；TEMED 20ul。室温凝固时间> 1小时;b.点样；c.电泳800V，83mA，69mW 电泳时间 30min ；d.银染固定液固定lOmin，然后水洗2-3次，然后0. 2% AgN03100ml+37%甲醛 50ul，混勻，避光染色30 50m，然后水洗20秒x2次，然后1. 5% NaOHlOOmlJn 37%甲醛 0. 5ml，混勻，显色3 10m，最后水洗若干次，终止显色。5).观察记录结果。3.实验结果电泳图谱见图1。本发明设计得到的引物从三种单一病原体的裂解样本中分别扩 增得到了 171bp，207bp，313bp的扩增带(见图1的泳道6、7、8)，与预期目标一致，即使用 引物1、2扩增得到了 171bp的产物，与淋球菌NG的特征DNA —致；使用引物3、4扩增得到 了 207bp的产物，与沙眼衣原体CT的特征DNA —致；使用引物5、6扩增得到了 313bp的产物，与解脲支原体UU的特征DNA —致。另外，本发明的引物也可以将混合样本中的特征DNA扩增出来。泳道1、2为三种 病原体的混合样本扩增产物，有清晰的三条带，分别与泳道6、7、8的扩增条带对应；泳道3、 4、5分别为UU与NG，CT与NG，UU与CT的混合样本的扩增产物，均为两条带，分别与6、7、 8泳道的扩增条带相对应，没有出现干扰现象和非特异性条带，说明本发明的引物能特异扩 增病原体NG、CT与UU的特征性DNA，且特异性良好，可以作为检测NG、CT和UU的试剂。实施例三本发明检测试剂盒的制备组成1、引物:SEQ ID NO: 15SEQ ID NO :25SEQ ID NO :35SEQ ID NO :45SEQ ID NO :55SEQ ID NO :652、DNA 裂解液又称预反应液，包含50mmol/LNaOH，l(toimol/L Tris-HCL, PH 8.0，体积分数为 1% Triton X-100，体积分数为 1% NP-40,0. 5mmol/L EDTA PH 8. 0。3.扩增反应管在本发明中，扩增反应管为75ul的反应体系，具体包含=Reaction buffer(10*)7. 5ul ；DNTP(IOmmol) 1. 5ul ；Taq 酶[TaKaRa Bio-technology(Dalian) CO. Ltd] (5U/ul) :1. 5ul ；Mg2+(25mmol/ul) :4. 5ul ；弓丨物(20P):淋球菌 NG, Sense Iul， Antisense Iul (引物 SEQ ID NO 1,2)和沙眼衣原体 CT，Sense 0. 5ul, Antisense 0. 5ul (引物 SEQ ID N0:3、4)以及解脲支原体 UU，Sense Iul,Antisense Iul (引物 SEQ ID NO 5,6)；补水441ul ；另外6ul为模板，来源于经上述DNA裂解液处理后的标本。3.标准阴性质量控制液标准阴性质量控制液为无菌双蒸水。4.银染试剂液银染试剂液包含30%聚丙烯酰胺、&ΤΒΕ、10%过硫酸胺、TEMED、固定液(100ml 无水乙醇，5ml冰醋酸)、0. 2% AgNO3U. 5% NaOH和37%甲醛单管分装，使用时按下述使用 步骤混合。本试剂盒的使用方法1).使用前述DNA裂解液提取待检标本中的DNA 标本加入裂解管后，摇勻20s，室 温静置20min，14000rpmX IOmin离心后即可。离心后的标本加入TE缓冲液(pH8. 0) (lOmol/ L Tris-Cl,2mmol/L EDTA)溶解DNA_20°C保存，或直接用于检测；2).分别取6ul步骤1)中的DNA提取液加入前述的扩增反应管中进行扩增，扩 增条件如下，循环参数94°C 4min,94°C 30s,62°C 30s,68-72°C (注此范围任意温度均 可)30s，36个循环，最后720C IOmin。3).使用前述的银染试剂液进行DNA扩增结果检测，其步骤如下
，CCTATCGGGCTGTTATCTGATTATGG 3， ’ AAGAAGAGGTCGGGTTGGGTGTAT 3' ’ CTTCCCCAGAACAATAAGAACACA 3' ’ TAGGGATTCCTGTAACAACAAGTCA 3’ ’ TAAATGTCGGCTCGAACGAG 3' ，GCAGTATCGCTAGAAAAGCAAC 3'
a.配胶30%聚丙烯酰胺09 l)8ml,5xTBE 8ml，定容至40ml，加10%过硫酸胺 200ul ；TEMED 20ul。室温凝固时间> 1小时;b.点样；c.电泳800V，83mA，69mW 电泳时间 30min ；d.银染固定液固定lOmin，然后水洗2-3次，然后0. 2% AgN03100ml+37%甲醛 50ul，混勻，避光染色30 50m，然后水洗20秒x2次，然后1. 5% NaOHlOOmlJn 37%甲醛 0. 5ml，混勻，显色3 10m，最后水洗若干次，终止显色。5).观察记录结果。根据常识，本领域技术人员还可以根据需要，将本发明试剂盒的组成进行调整，如 含有1对引物、2对引物或3对引物，用于检测一种病原体，或者同时检测两种或三种病原 体。实施例四对本发明的试剂盒的有效性进行评价干扰试验随机各种组合的淋球菌(NG)，沙眼衣原体(CT)和解脲支原体(UU)标准菌株分别 添加临床来源的含大肠埃希菌的宫颈分泌物和男性尿道拭子标本(经荧光定量PCR检测无 NG, UU, CT)以及含金黄色葡萄球菌的宫颈分泌物和男性尿道拭子标本(经荧光定量PCR检 测10无NG，UU, CT)的混合物进行扩增检测，看结果与理论扩增带是否相符，多重体系内是 否出现相互强抑制现象。1.标本来源标准菌株和临床标本均由四川大学华西医院微生物实验室提供2.实施例2制备的试剂盒实验步骤1)分别用实施例三提取DNA方法提取淋球菌，沙眼衣原体，解脲支原体，金黄色葡 萄球菌和大肠埃希菌5种标准菌株的DNA，控制提取DNA浓度为10_8fg/Ul ；2)配置反应体系按照前述体系配置PCR反应体系，并改变扩增模板的种类A.淋球菌、沙眼衣原体与解脲支原体的单一样本、二重混合样本或三重混合样本 +大肠埃希菌DNA各2ul ；B.淋球菌、沙眼衣原体与解脲支原体的单一样本、二重混合样本或三重混合样本 +金黄色葡萄球菌DNA各2ul ；C. 6ul经临床金标准检测无淋球菌，沙眼衣原体或解脲支原体的精液和白带混合 物3)按前述的扩增条件进行扩增；4)使用前述的银染试剂液进行DNA扩增结果检测。3.实验结果干扰试验结果与理论扩增带相符，多重体系内没有出现相互强抑制现象。大肠埃 希菌干扰试验结果如图2所示，泳道8、9、10、11分别是标准菌株NG、CT、UU单菌株及三种标 准菌混合标本的扩增条带，泳道1为NG+CT+UU+大肠埃希菌的混合标本的扩增图谱，图谱上 仅出现了三条标准菌株的扩增条带，大肠埃希菌没有扩增产物；泳道2、3、4分别为NG+CT+ 大肠埃希菌混合样本；CT+UU+大肠埃希菌混合样本；NG+UU+大肠埃希菌混合样本的扩增电 泳图谱；图谱上也是仅有与标准菌株扩增条带一致的扩增产物，未见大肠埃希菌的扩增产物；泳道5、6、7分别为NG+大肠埃希菌混合样本的扩增图谱；CT+大肠埃希菌混合样本的扩 增图谱；UU+大肠埃希菌混合样本的扩增图谱，图谱上仅有与三种标准菌扩增条带一致的 产物，未见大肠埃希菌的扩增产物。说明本发明的试剂盒既能特异检测单一 STD病原体，也能同时特异检测待测样本 中是否含有两种或三种STD病原体。金黄色葡萄球菌干扰试验如图3所示泳道8、9、10、11分别是标准菌株NG、CT、UU单菌株及三种标准菌混合标本的扩增 条带，泳道1为NG+CT+UU+金黄色葡萄球菌的混合标本的扩增图谱，图谱上仅出现了三条标 准菌株的扩增条带，金黄色葡萄球菌没有扩增产物；泳道2、3、4分别为NG+CT+金黄色葡萄 球菌混合样本；CT+UU+金黄色葡萄球菌混合样本；NG+UU+金黄色葡萄球菌混合样本的扩增 电泳图谱；图谱上也是仅有与标准菌株扩增条带一致的扩增产物，未见金黄色葡萄球菌的 扩增产物；泳道5、6、7分别为NG+金黄色葡萄球菌混合样本的扩增图谱；CT+金黄色葡萄球 菌混合样本的扩增图谱；UU+金黄色葡萄球菌混合样本的扩增图谱，图谱上仅有与三种标 准菌扩增条带一致的产物，未见金黄色葡萄球菌的扩增产物。说明本发明的引物对三种STD病原体具有极好的特异性，本发明试剂盒可以有效 检测待测样本中是否含有NG、CT、UU的单一病原体或混合病原体感染。实施例五本发明试剂盒特异性和灵敏度检测1.建立模板浓度梯度分别使用实施例三提取DNA方法提取淋球菌，沙眼衣原体， 解脲支原体，金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌5种标准菌株的DNA，控制提取DNA浓度分别为 10"10fg/ul ； l(T9fg/ul，l(T8fg/ul ；2.配置反应体系按照实施例三体系配置PCR反应体系，3.按实施例三的扩增条件进行扩增；4.使用实施例三的银染试剂液进行DNA扩增结果检测。经多次标准菌株、临床标本以及干扰试验，单管多重PCR反应无非特异性条带出 现，体系特异性为100%。多重PCR体系可测DNA浓度为10_9fg/ul。证明本发明试剂盒特异性和灵敏度良好。实施例六临床检测男/女生殖器分泌物样本材料1、待测样本选取50例经华西医院试验医学科临床分子诊断试验室使用单 重实时荧光PCR方法确诊存在淋球菌，沙眼衣原体，解脲支原体或其中2者合并感染的标 本。2、实施例三的试剂盒根据实施例三试剂盒的使用方法，对待测样本进行检测，结果如下表1.经单重实时荧光PCR方法确诊的样本信息
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权利要求
1. 一种检测人性传播疾病的试剂盒，其特征在于，其含有1 3对引物，分别特异性扩 增来自下列病原体的基因淋球菌、沙眼衣原体和/或解脲支原体；所述的引物选自以下序列SEQIDNO:15，CCTATCGGGCTGTTATCTGATTATGGSEQIDNO:25，AAGAAGAGGTCGGGTTGGGTGTAT SEQIDNO:35，CTTCCCCAGAACAATAAGAACACA SEQIDNO:45，TAGGGATTCCTGTAACAACAAGTCASEQIDNO:55，TAAATGTCGGCTCGAACGAG 3'SEQIDNO:65，GCAGTATCGCTAGAAAAGCAAC 3，
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是所述病原体基因为淋球菌Pjdl质粒基 因、沙眼衣原体Plgv440隐蔽性质粒基因和/或解脲支原体16S rRNA编码区V5和V7区域 的基因。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述病原体基因核苷酸序列如SEQID NO :7、SEQ ID NO :8 禾口 / 或 SEQ ID NO 9 所示。
4.根据权利要求1至3任一一项所述的试剂盒，其特征是所述试剂盒含有3对引物， 序列如SEQ ID NO :1 6所示。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，其还含有银染试剂。
6.一种检测人生殖器分泌物是否含性传播疾病病原体的方法，包括以下步骤1)提取待检样本中的DNA;2)用1 3对引物对样本中的DNA进行扩增，所述引物如SEQID NO :1 6所示；3)用银染试剂液染色，对DNA扩增结果进行检测。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征是步骤幻的扩增条件为，循环参数: 940C 4min, 94°C 30s, 62°C 30s, 68 72°C，30s, 36 个循环，最后 72°C IOmin0
8.一种选自如SEQ ID NO :1 6所示寡核苷酸序列的用途，其特征是其用于扩增或 检测来自下列病原体的基因淋球菌、沙眼衣原体和/或解脲支原体。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征是所述病原体基因为淋球菌Pjdl质粒基因、 沙眼衣原体Plgv440隐蔽性质粒基因和/或解脲支原体16S rRNA编码区V5和V7区域的 基因。
全文摘要
本发明公开了一种检测性传播疾病的试剂盒，包含1～3对引物，可以分别特异性扩增来自下列病原体的基因淋球菌、沙眼衣原体和/或解脲支原体；所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO1～6所示。本发明试剂盒特异性和灵敏度良好，既可检测单一病原体，也可以同时检测多种病原体，使用方便，结果准确，具有极好的临床应用前景。
文档编号C12N15/11GK102080123SQ20091021646
公开日2011年6月1日 申请日期2009年12月1日 优先权日2009年12月1日
发明者刘嘉铭, 应斌武, 王兰兰, 邹秀和, 黄进 申请人:四川大学华西医院