专利名称：一种增强鱼类对低溶氧胁迫耐受能力的重组基因及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及水产动物遗传育种技术领域，更具体涉及一种增强鱼类对低溶氧胁迫
耐受能力的重组基因，还涉及这种能增强鱼类对低溶氧胁迫耐受能力的重组基因在遗传改 良养殖鱼类中的用途。
背景技术：
溶氧是水产养殖业中最重要的环境因子之一。温度、昼夜节律和季节变化以及富 营养化作用等都会影响水体的溶氧，鱼类对水体溶氧条件的变化非常敏感，低溶氧胁迫不 仅降低鱼类生长率，引起鱼类内分泌失调，影响鱼类的代谢和繁殖特性，改变鱼类的行为和 分布，危害严重的甚至导致鱼类的死亡，所以受影响的水域的鱼类丰度、生物多样性和捕获 量均受到严重危害。因此，采用基因工程技术研制具有耐受低溶氧胁迫能力的养殖鱼类新 品种具有重要的实际应用价值。 目前，通过基因工程方法提高鱼类的低氧耐受能力的研究只是停留在设想阶 段。鱼类的低氧耐受能力主要依赖于球蛋白家族的含量和种类以及氧亲和力(Giles M.A(1991). Strain differences in hemoglobin polymorphism, oxygenconsumption， and blood oxygen equilibria in three hatchery broodstocks of Arcticcharr， Salveli皿s alpi皿s. Fish Physiology and Biochemistry 9 :291—301. 2， TerwilligerN. B (1998). Functional adaptations of oxygen-transport proteins. J. Exp. Biol. 201(8): 1085-1098. 3， Skjaeraasen J. E. ， Nilsen T. ， Meager J. J. ， Herbert N. A. ， Moberg 0.， Tronci V. ， Johansen T. ， Salvanes A. G. V(2008). Hypoxic avoidance behaviour in cod(Gadus morhua L) :The effect of temperature and haemoglobin genotype. Journal ofExperimental Marine Biology and Ecology ;358 ;70-77.)。在人和其它脊椎动物中发 现有四种球蛋白血红蛋白(Hb)、肌红蛋白(Mb)、神经球蛋白(neuroglobin)和细胞珠蛋 白(cytoglobin)，它们在结构、组织分布和功能上存在一定的差异(4，Pesce A. ，Bolognesi M. ， Bocedi A. ， Ascenzi P. ， Dewilde S. ， Moens L ， Hankeln T. ， B翻ester T. (2002). Neuroglobin and cytoglobin. Fresh blood for the vertebrateglobin family. EMB0 R印.3(12) :1146-1151.)。哺乳动物中，血红蛋白(Hb)和肌红蛋白(Mb)能够被低氧和缺 血诱导(5，Hoppeler H. ，Vogt M. (2001). Muscle tissueadaptations to hypoxia. J. Exp. Biol. 204 :3133-3139. 6， Vogt M. ， Puntschart A. ， Geiser J. ， Zuleger C. ， Billeter R. ， and Hoppeler H. (2001). Molecular adaptations inhuman skeletal muscle to endurance training under simulated hypoxic conditions. J. Appl. Physiol.91 : 173-182. 7，Nitta T. ，Xundi X. ，Hatano E. ，Yamamoto N. ，Uehara T. ，Yoshida M. ，Harada N. ，Honda K. ，Tanaka A. & Sosnowski D. (2003). Myoglobingene expression attenuates hepatic ischemia reperfusion injury. J. Surg. Res. 110 :322-331.)。
透明颤菌属(Vitreoscilla stercoraria)是严格意义上的好氧性生物，但能够适 应低氧环境，它们能够在低氧条件下合成一种可溶性血红蛋白(Vitreoscillahemoglobin，VHb)，该蛋白由2个15,775 Da的相同亚基和2个亚铁血红素分子组成(Wakabayashi S. ， Matsubara H. ， Webster D. A. (1986). Primary sequence of adimeric bacterial hemoglobin from Vitreoscilla. Nature 322:481-483.)。 VHB并不增加细胞内的氧的浓 度，但是，由于VHB与氧气分子之间具有高解离速率常数，故能够在低氧环境中加速氧传 递，从而增强呼吸和能量代谢。因此，通过向鱼类转植VHB基因，有望提高鱼类耐受低溶氧 胁迫的能力，从而培育出具有耐受低溶氧特性的养殖鱼类新品种。 斑马鱼是目前广泛应用于发育生物学、水生生物技术等研究的模式鱼 (Westerfield M. (1993).The Zebrafish Book :A Guide for the Laboratory Use ofZebraf ish (Brachydanio rerio). University of Oregon Press,Eugene, OR.)，以斑马鱼 为模型探索提高受体鱼的低氧胁迫耐受能力的新方法，对于培育具有低溶氧胁迫耐受特性 的经济性养殖鱼类新品种具有重要的指导意义。在培育具有耐受低溶氧胁迫能力转基因斑 马鱼的基础上，进一步将该重组基因应用于我国重要的经济性养殖鱼类团头鲂和鲤鱼，培 育的转VHB基因团头鲂和鲤鱼同样具有耐受低溶氧胁迫的能力。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种增强鱼类对低溶氧胁迫耐受能力的重组基因 (以鲤鱼P-actin基因启动子驱动的透明颤菌血红蛋白的重组基因)，透明颤菌血红蛋 白由2个15， 775 Da的相同亚基和2个亚铁血红素分子组成(WakabayashiS. ， Matsubara H. ， Webster D. A. (1986). Primary sequence of a dimeric bacterialhemoglobin from Vitreoscilla. Nature 322:481-483.)。由于透明颤菌血红蛋白与氧气分子之间具有高解 离速率常数，同时13 -actin基因启动子是一个调控能力很强的启动子，因此，重组基因能 够保证受体动物在低氧环境中加速氧传递，增强呼吸和能量代谢。 本发明的另一个目的是在于提供了一种增强鱼类对低溶氧胁迫耐受能力的重组 基因在鱼类遗传育种中的用途，将鲤鱼P-actin基因启动子驱动的透明颤菌血红蛋白 的重组基因采用显微注射法转入斑马鱼受精卵，筛选得到的7日龄的转基因鱼在低溶氧 (0. 91mg/l)胁迫环境下经过156h的低氧胁迫，其生存率为92%，而其姊妹群对照鱼的生存 率仅为65 % ，两者存在显著差异。重组基因的转入增强了受体鱼对低溶氧胁迫的耐受能力， 为培育具有低溶氧胁迫耐受特性的经济性养殖鱼类新品种提供了具有普遍适用性的方法， 采用该方法培育的转基因团头鲂和转基因鲤鱼具有耐受低溶氧胁迫的特性。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术措施 以鲤鱼肌动蛋白基因启动子(从鲤鱼基因组文库中克隆得到，常规方法，分子克 隆实验指南，第二版，J.萨姆布鲁克等著，科学出版社，1993)作为启动子，以透明颤菌血 红蛋白基因(VHb)为靶位基因(VHb从Vitreoscilla stercoraria中克隆得到，菌株购 自美国ATCC中心。菌株编号15128。 5'上游引物CCATGGTAGA CCAGCAACC;3'下游引物 GGGTAACCTT TATTCAACCG。 PCR条件94"预变性10分钟，94"变性30秒，52。C退火45秒， 72。C延伸45秒，25个循环。然后72。C 7分钟。回收扩增的441bp片段，克隆至pGEM-T-easy 载体(Tiangen公司产品)，构建以鲤鱼P-actin基因启动子驱动的透明颤菌血红蛋白基 因(VHb)的表达载体(常规方法，分子克隆实验指南，第二版，J.萨姆布鲁克等著，科学出 版社，1993)，制备获得具有低溶氧胁迫耐受能力的转基因鱼。
它包括下以下步骤
1.重组基因及其制备方法 构建以鲤鱼13 -actin启动子驱动的透明颤菌血红蛋白基因(VHb)的重组基因。其 步骤是 (1)以鲤鱼肌动蛋白基因启动子作为启动子(从鲤鱼基因组文库中克隆得到， 常规方法，分子克隆实验指南，第二版，J.萨姆布鲁克等著，科学出版社，1993。其核苷酸 序列为SEQ ID No. l，见文末)，以透明颤菌血红蛋白基因为靶位基因，从Vitreoscilla stercoraria中克隆得到，菌株购自美国ATCC中心，菌株编号15128。 5'上游引物 CCATGGTAGACCAGCAACC ;3'下游引物GGGTAACCTT TATTCAACCG。 PCR条件94。C预变性10分 钟，94。C变性30秒，52。C退火45秒，72。C延伸45秒，25个循环。然后72°C 7分钟。回收扩 增的441bp片段，克隆至pGEM-T-easy载体(Tiangen公司产品)上。其核苷酸序列为SEQ ID No. 2，见文末，以猴空泡病毒40的poly A(Clontech公司产品)为终止顺序，其核苷酸 序列为SEQ ID No. 3，见文末。 (2)以巨细胞病毒CMV(Clontech公司产品)启动子驱动的增强型绿色荧光蛋白基 因eGFP(Clontech公司产品)为报告基因，其核苷酸序列为SEQ ID No.4，见文末。
(3)经限制性内切酶(XhoI、Smal、Not I和Hind III)消化后，将上述4个基因片段 (SEQ ID No.l、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4)与质粒载体PUC118 (SABC公司产 品)连接(常规方法，分子克隆实验指南，第二版，J.萨姆布鲁克等著，科学出版社，1993。)， 得到了一种含重组基因的表达载体pCVCG，其核苷酸序列为SEQ ID No.5，该重组基因中， 透明颤菌血红蛋白由2个15， 775Da的相同亚基和2个亚铁血红素分子组成(Wakabayashi S. ， Matsubara H. ， Webster D. A. (1986). Primarysequence of a dimeric bacterial hemoglobin from Vitreoscilla. Nature322 :481-483.)。透明颤菌血红蛋白与氧气分子 之间具有与其它血红蛋白相近的结合速率常数(k。n 78yM—、—"，但具有比其它血红蛋白 高数百倍的解离速率常数(k。ff 5000s—0 (Orii Y. ， Webster D. A. Photodissociation of oxygenatedcytochrome o (s) (Vitreoscilla)and kinetic studies of reassociation. J Biol Cheml986 ;261 :3544-3547.)，故能够在低氧环境中加速氧传递，从而增强呼吸和能量 代谢。 2、 一种增强鱼类低溶氧胁迫耐受能力的重组基因在遗传改良养殖鱼类中的应用， 其应用步骤是 (1)、制备转基因鱼；采用显微注射法(Zhu Z， Li G， He L， et al. Novel genetransfer into the fertilized eggs of goldfish(Carassius auratus L 1758).Z angew Ichthyol， 1985， 1 :31-34)将含重组基因的表达载体pCVCG导入鱼类受精卵中。
(2)筛选具有低溶氧胁迫耐受能力的转基因鱼。通过荧光解剖镜(Olympus SZX12 型)观察绿色荧光蛋白基因的表达、PCR检测重组基因和低溶氧胁迫试验筛选获得具有耐 受低溶氧胁迫能力的转基因鱼。 本发明具有以下优点和效果提供了一种新的增强鱼类对低溶氧胁迫耐受能力的 遗传改良育种技术，采用该方法培育的7日龄的转基因斑马鱼在低溶氧(0.91mg/l)胁迫环 境下经过156h的低氧胁迫，其生存率为92%，而其姊妹群对照鱼的生存率仅为65%，两者 存在显著差异。采用该方法培育的转基因团头鲂和转基因鲤鱼都具有耐受低溶氧胁迫的能力。这种遗传改良育种技术能广泛应用于培育具有耐受低溶氧胁迫能力的优良养殖鱼类新 品种。
图1为颤菌血红蛋白基因的表达载体pCVCG示意图 注鲤鱼肌动蛋白基因的启动子，长1213bp ;透明颤菌血红蛋白基因基因，长
441bp ;猴空泡病毒40的PolyA，长51bp ;CMV启动子驱动的eGFP，长1331bp 图2颤菌血红蛋白基因的表达载体pCVCG阳性克隆筛选 注M :DNAMarker DL2000 ;1-8 :pCVCG阳性克隆 图3颤菌血红蛋白基因的表达载体pCVCG质粒酶切电泳图 注M :GeneRuler 1 kb DNA Ladder ;1 :HindIII单酶切；2 :XhoI+Hind111双酶 切 图4转VHb基因斑马鱼的筛选和验证 A转基因鱼的GFP的表达；B通过PCR检测转基因鱼的构建体在转基因鱼基因组中 整合情况；C通过RT-PCR检测转基因鱼的VHb基因表达情况。N， GFP阴性鱼；l-8，转基因 鱼家系1-8中的GFP阳性鱼；M， DNA MarkerDL2000。 图5在低氧条件下(2. 5% 02)VHb转基因鱼和姊妹群对照鱼生存率的比较 注卡方检验比较两者的生存率，*表示两组之间具有统计学上的显著性差异(P
< 0. 05) ， **表示两组之间具有统计学上的极显著性差异(P < 0. 01)。
具体实施例方式
实施例1 :含颤菌血红蛋白基因的表达载体pCVCG的构建 在含颤菌血红蛋白基因的表达载体中，鲤鱼肌动蛋白基因的启动子1213bp片段 为启动子(SEQ ID No. l，从鲤鱼基因组文库中筛选获得，常规方法，分子克隆实验指南，第 二版，J.萨姆布鲁克等著，科学出版社，1993)，441bp的颤菌血红蛋白基因(SEQ ID No. 2， 从Vitreoscilla stercoraria中克隆得到，菌株购自美国ATCC中心，菌株编号15128,5' 上游引物CCATGGTAGACCAGCAACC ; 3'下游引物GGGTAACCTT TATTCAACCG 。 PCR条件94 °C预 变性10分钟，94°C变性30秒，52°C退火45秒，72 °C延伸45秒，25个循环。然后72°C 7分 钟。回收扩增的441bp的片段，克隆至pGEM-T-easy载体上)为靶位基因插入启动子下游， 随后的猴空泡病毒40的PolyA(Clontech公司产品)为终止顺序，CMV启动子(Clontech公 司产品)驱动的增强型绿色荧光蛋白基因eGFP(Clontech公司产品)为报告基因。载体骨 架为PUC118(SABC公司产品)
1)具体构建过程如下 鲤鱼肌动蛋白基因的启动子用Xhol和Smal酶完全酶切，颤菌血红蛋白基因用 SmaI和Not I酶完全酶切，猴空泡病毒40的Poly A用Not I和Hind III酶切，CMV启动子 驱动的增强型绿色荧光蛋白基因eGFP用Hind III和Xbal完全酶切；PUC118质粒用Xhol 和Xbal酶完全酶切；将上述片段分别在16t:条件下，用T4连接酶连接4小时。上述内切 酶和连接酶均购于Takara公司。 将上述连接液转化大肠杆菌(菌株E. coli T0P10菌株购置Invitrogen公司；E. coli T0P10基因型F-mcrAA (mrr-hsdRMS-mcrBC)①801acZ AM15 A lacX74deoRrecAl araD139 A (ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endAl皿pG) ， 37。C恒温培养，接种到LB 液体培养基中培养，以备下一步鉴定。 上述PCR反应、酶切反应、连接反应、DNA转化、细菌培养及所用培养基等均为常规 分子生物学操作，依"分子克隆实验指南，第二版，J.萨姆布鲁克等著，科学出版社，1993"所 述方法进行，从而得到含颤菌血红蛋白基因表达载体pCVCG。
2)含颤菌血红蛋白基因表达载体pCVCG的鉴定
(l)PCR鉴定 含颤菌血红蛋白基因的表达载体pCVCG(本发明构建)通过PCR扩增确认。以37°C 培养5小时的LB液体培养基中的菌液2ii L为模板，25y L体系中PCR扩增，扩增引物为 VCG-U1 (GCCGCAACCGATGACA)和VCG—D1 (GCCAAGTGGGCAGTTTACC)，目标片段约563bp (图2)， 上述PCR扩增反应为常规的PCR扩增，反应条件为94t:预变性5min，扩增35个循环(94°C， 30s ;58。C，30s ;72。C，30s)，最后72。C延伸5min。目标片段约563bp (图2)
(2)酶切鉴定 取上述确认的阳性克隆，经质粒小量(约40 ii g)制备试剂盒(Axygen公司)提 取质粒pCVCG，经Hindi 11单酶(目标片段6627bp)和Xhol+Hindlll双酶消化(目标片段 1952bp和4675bp)进一步确认获得的质粒为pCVCG(图3)。
实施例2: —种增强鱼类低溶氧胁迫耐受能力的重组基因在模式生物斑马鱼中的应用，其步 骤是 (1)转基因斑马鱼的制备 将含透明颤菌血红蛋白基因的表达载体pCVCG经质粒小量制备试剂盒(Axygen 公司)提取质粒DNA后，溶于ST溶液(88mmo1/1 NaCl， 10mmol/lTris-HCl， pH7. 5)中， 调节其终浓度为85ng/iU，采用显微注射的方法(Zhu Z， Li G， He L， et al. Novel gene transfer into the fertilized eggs of goldfish(Carassius auratus L 1758). Zangew Ichthyol， 1985， 1 :31-34)，在第一次卵裂前将DNA溶液导入斑马鱼受精卵动物极，DNA注射 剂量l-2nl/卵，完成显微操作后的受精卵置于28. 5t:水温孵化和养殖。
(2)稳定遗传与表达VHb基因的转基因斑马鱼家系培育及筛选
将pCVCG载体通过显微操作转入斑马鱼受精卵后，在荧光显微镜下筛选表达绿色 荧光的胚胎(P。代)如图4A所示，在循环水养殖系统中养殖至性成熟后，与野生型斑马鱼杂 交，筛选通体表达GFP的胚胎(巳代)并继续养殖至性成熟，获得不同转基因鱼家系。斑马 鱼的养殖及繁殖等均按常规操作进行(Westerfield， 1993， The Zebrafish Book :A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio). University of Oregon Press, Eugene, OR). 取约0. 1-0. 2cm2上述^代不同家系的转基因斑马鱼尾鳍组织，参考常规酚/氯 仿法提取DNA。常规酚/氯仿法在1. 5ml管中加入0. 4ml DNA抽提掖(10mmol/LEDTA， 10,1/LTris HC1， 300,1/LNaCl， 2 % (重量体积比g/L) SDS) ， 55 °C水浴l_2h后， 于37t:水浴消化过夜；消化的组织液分别用酚、酚/氯仿、氯仿个抽提一次；加入2. 5倍 体积酒精，将沉淀立即放入另一离心管中；然后加入70% (体积比)乙醇洗涤一次，高速离心lmin ;倒尽乙醇，37。C恒温培养箱放置15min，加入适当体积含RNase的TE(含 RNase，20mg/ml)溶解DNA。采用PCR技术验证pCVCG在转基因鱼中的整合情况，正向检 测引物(5' -ATCTGCCTGTAACCCATTCT-3')位于鲤鱼的P-actin启动子上，反向检测引物 (5' -AATACTTCTTTAATCGCACCC-3')位于耙位基因颤菌血红蛋白基因上，PCR反应条件如下 94"C预变性5min，扩增35个循环(94。C，30s ;58。C，30s ;72。C ， 30s)，最后72。C延伸5min，目 的片段为383bp如图4B所示，进一步证实pCVCG整合到斑马鱼基因组中。发现GFP阳性个 体基因组中都有鲤鱼|3 -actin启动子驱动VHb基因的构建体整合，GFP阴性个体基因组中 均没有鲤鱼P -actin启动子驱动VHb基因的构建体整合(图4B)。 取不同家系的斑马鱼的巳代的GFP阳性鱼苗和姊妹群对照鱼苗提取总 RNA (TRIzol法)，具体方法如下:(1)取一尾斑马鱼鱼苗加入lml Trizol (Invitrogen)，采 用电动匀浆器充分匀浆。(2)加入约1/5体积的氯仿，上下颠倒充分混匀lmin左右，室温 (20-25t:以下相同)静置5min，4。C，12，000rpm离心15min。 (4)小心取出上清液，避免触 及中间层，将上清夜转入新的1. 5ml离心管，加等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置 5min。 (5)4。C，12000rpm离心10min。 (6)弃上清，保留沉淀，并向沉淀中加入2/5体积的 70% (体积比)乙醇，4t:，12000g离心15min洗涤沉淀。(7)弃上清，沉淀室温自然晾干 后加入适量RNase-free的水，用枪头吹充分溶解沉淀。(8)取l-2yL稀释到100ul，用分 光光度计(Beckman公司DU-70)测定OD26。、OD28。值和RNA浓度，-8(TC冰冻保存待用。然后 利用ReverTra Ace (TOYOBO)试剂盒将lug总RNA以Random 9mers反转录合成cDNA(反 应体系为lug总謹、Random primer、2ul 5XBuffer、lul 10mM d證s、0. 5ul ReverTra Ace (lOOU/ul) 、 10U RNase Inhibitor,加DEPC水至10ul) ， cDNA样品在PCR前按1 :4稀释， 取l-2ul用于RT-PCR。验证VHb基因表达的引物为(5' -CGTTACCATTACCACGACTTT-3')和 (5， -GCATCGCCCAATACTTCTT-3')，目的片段为276bp。通过RT-PCR证实VHb mRNA在斑马 鱼体内高效表达，也发现GFP阳性个体能够表达VHb mRNA，而GFP阴性个体不能表达VHb mRNA(图4C)。 将巳代不同家系的转基因斑马鱼经过PCR验证后，与野生型杂交，用绿色荧光标 记来筛选阳性鱼，产生的F2代转基因斑马鱼。F2代胚胎饲养至性成熟后，与野生型鱼杂交 所产生后代(F3代)，通过PCR和RT-PCR方法验证获得稳定遗传与表达VHb基因的转基因 鱼家系。 (3)耐低溶氧胁迫转VHb基因斑马鱼筛选 将稳定表达VHb的转基因斑马鱼家系雄鱼与野生型斑马鱼雌鱼杂交，受精24h后 在荧光显微镜下将子代胚胎分开为GFP阳性胚胎和无GFP表达胚胎。两组斑马鱼按照标准 方法在同样条件下单独饲养，其中无GFP表达胚胎作对照鱼。7日龄的转基因鱼和对照鱼 各取100尾，同时放入培养箱(3131/Thermo ;FormaScientific， Inc. ，Marietta, OH)中，共 同暴露在2. 5% 02 (体积比)、97. 5% (体积比)N2和28. 5"环境下(0. 91mg/L，水体溶氧浓 度)，同时另外各取40尾转基因鱼和对照鱼在含氧量正常(7.6mg/L)的条件下常规饲养。 实验期间，每12小时观察一次，同时记录死亡情况，并取走死鱼。 经低溶氧胁迫试验，发现在正常溶氧条件(7. 6mg/L，水体溶氧浓度)下，转VHb斑 马鱼及其对照鱼在156h内生存率均为100%。但是在2. 5% (体积比)02(0. 91mg/l，水体 溶氧浓度)条件下经过156h的低氧胁迫后，转VHb斑马鱼的生存率为92%，而对照鱼的生存率为65%，转VHb基因斑马鱼的生存率明显高于对照鱼(图5)，从而筛选得到具有耐受 低溶氧胁迫特性的转VHb基因斑马鱼家系。
实施例3 : —种增强鱼类低溶氧胁迫耐受能力的重组基因在遗传改良经济性养殖鱼类中的 应用，其步骤是 (1)转基因团头鲂(鲤鱼)的制备 以我国重要的经济性养殖鱼类团头鲂和鲤鱼为对象，制备转VHb基因团头鲂和 转VHb基因鲤鱼。将含透明颤菌血红蛋白基因的表达载体pCVCG经质粒小量制备试剂盒 (Axygen公司)提取质粒DNA后，溶于ST溶液(88mmol/l NaCl， 10mmol/l Tris_HCl，pH7. 5) 中，调节其终浓度为85ng/iil，采用显微注射的方法(Zhu Z，Li G，He L，et al. Novel gene transfer into the fertilized eggs of goldfish(Carassiusauratus L 1758).Z angew Ichthyol， 1985， 1 :31-34)，在第一次卵裂前将DNA溶液导入团头鲂(鲤鱼)受精卵动物极， DNA注射剂量l-2nl/卵，完成显微操作后的受精卵按常规方法进行孵化和养殖(申玉春， 2008，鱼类增养殖学，中国农业出版社)。 [OO57] (2)具有耐受低溶氧胁迫能力的转基因鱼筛选 将pCVCG载体通过显微操作转入团头鲂(鲤鱼)受精卵后，在荧光显微镜下筛 选表达绿色荧光的胚胎(如图4A所示)，上述胚胎孵化后置于鱼塘中养殖。在鱼塘中养 殖2个月后，取约0. 1-0. 2cm2上述转基因鱼尾鳍组织，参考常规酚/氯仿法提取DNA，进 行转基因检测。常规酚/氯仿法在1. 5ml管中加入0. 4ml DNA抽提掖(10mmol/L EDTA， 10mmol/L Tris HC1， 300mmol/L NaCl，2% (重量体积比g/L) SDS) ， 55 °C水浴l_2h后， 于37t:水浴消化过夜；消化的组织液分别用酚、酚/氯仿、氯仿个抽提一次；加入2. 5倍 体积酒精，将沉淀立即放入另一离心管中；然后加入70% (体积比)乙醇洗涤一次，高 速离心lmin ;倒尽乙醇，37。C恒温培养箱放置15min，加入适当体积含RNase的TE(含 RNase，20mg/ml)溶解DNA。采用PCR技术验证pCVCG在转基因鱼中的整合情况，正向检 测引物(5' -ATCTGCCTGTAACCCATTCT-3')位于鲤鱼的P-actin启动子上，反向检测引物 (5' -AATACTTCTTTAATCGCACCC-3')位于耙位基因颤菌血红蛋白基因上，PCR反应条件如下 94"C预变性5min，扩增35个循环(94。C，30s ;58。C，30s ;72。C ， 30s)，最后72。C延伸5min，目 的片段为383bp (如图4B所示)，进一步证实pCVCG整合到转基因鱼基因组中。
将经荧光观察和PCR检测获得的P。代转VHb基因团头鲂(鲤鱼)及其对照团头鲂 (鲤鱼)分别在池塘中按常规方法养殖(申玉春，2008，鱼类增养殖学，中国农业出版社)， 但养殖池塘中均不设置充氧设施。在池塘中经过1年的养殖后，由于养殖池塘中均没有充 氧设施进行充氧，对照团头鲂和对照鲤鱼均因缺氧而死亡，约10%的转VHb基因团头鲂和 转VHb基因鲤鱼因具有耐受低溶氧胁迫能力而存活。 将上述存活的转VHb基因团头鲂和转VHb基因鲤鱼进一步在池塘养殖至性成熟 后，与对照鱼杂交，筛选通体表达GFP的F工代转基因鱼并继续养殖，从而获得具有耐受低溶 氧胁迫特性的转基因鱼家系。团头鲂和鲤鱼的养殖及繁殖等均按常规操作进行(申玉春， 2008，鱼类增养殖学，中国农业出版社)。
SEQUENCE LISTING 〈110〉中国科学院水生生物研究所北京大学
〈120〉 一种增强鱼类对低溶氧胁迫耐受能力的重组基因及用途〈130〉 一种增强鱼类对低溶氧胁迫耐受能力的重组基因及用途〈160>5〈170>PatentIn version 3. 5〈210>1〈211>1213〈212>DNA〈213>Cyprinus carpio〈220〉〈221>Carp P —actin promoter〈222〉 (1) . (1213)〈400>1cttttegacc ttcttecttttggggattetateagtettt tctcaateaa tetctcatet60cttectgtgg ttteactgctg朋tcte朋atttteateca aaagtegtte tatttgttgt120acattgte朋cteteactteacttcagtttC3g3ga朋ct catgtgctca 3朋tgtea朋180aaagtttcct gtteaatettttgteaatgtattg朋gac3朋3t朋g朋3 a朋朋朋tet240aagccactea atcacactgtccttggtetc3gc朋g3gat tctgacate3 tcagctgttt300ttgtttette ctgccattgaaggccatgtgcattegtccc aagttecaca tteaaaagtc360acatgtegct taccaacatcagtgctgttcaagcacagcc tcatctecte ttcaaactgt420ggcaccatct aaaatetgccagaatttttttetttaatga atttgaccct gaaatetgta■ttaatetcac tcctgtgatttttttgteatcagcttec朋ttecagg朋t gc朋gcctga540ttcattecaa gtttcactecactttctctgacaacatcac ctectgaact cagaccagct600agttgctcct taagtetecaatcatgtcacteatcctcat ttcaatgaaa aateccccta660ttgtecttgg tacttggteg3t朋CC3C3gagcagtette tgccattett gtg朋tec朋720teagaggtea atgacctecagagctgctgctgctgttgtg ttegattgte aacacagcac780aggatcaagg aggtgtccatcactetgaccaatectegca ctttgcacag gctctttgaa840aggctg朋朋gagccttettggcgttatcac朋c朋朋te cgc朋atecg g朋朋c朋cg■tettg朋ctt cgc朋3C3朋朋3C3gCg3ttttgatgaaa atcgcttegg gatcccccct960tgctcttcaa acaatccagcttctccttctttcactctca 3gttgc朋ga agc朋gtgte1020gcaatgtgca cgcgacagccgggtgtgtg3cgctggacca atcagagcgc agagctccga1080aagtttecct tttetggctegagccgggcatctgccgtca teteaaagag cgcgcccagc1140gtctcagcct cactttgagctcctccacacgcagctegtg cggaatetca tctgcctgta1200acccattctc taa1213〈210>2〈211>441〈212>DNA〈213>Vitreoscilla stercoraria〈220〉〈221>VHb CDS
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662权利要求
一种分离的重组基因表达载体，其序列为SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。
2. 根据权利要求l所述的一种分离的重组基因表达载体，其特征是表达载体为pCVCG。
3. 权利要求1所述的一种重组基因在遗传改良养殖鱼类中的应用。
4. 权利要求1所述的一种重组基因在模式生物斑马鱼中的应用。
5. 权利要求1所述的一种重组基因在遗传改良经济性养殖鱼类团头鲂中的应用。
6. 权利要求1所述的一种重组基因在遗传改良经济性养殖鱼类鲤鱼中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种增强鱼类对低溶氧胁迫耐受能力的重组基因及用途。以鲤鱼肌动蛋白基因启动子作为启动子，以透明颤菌血红蛋白基因为靶位基因，构建以鲤鱼β-actin启动子驱动的透明颤菌血红蛋白基因的重组基因，以模式生物斑马鱼为研究对象，采用显微注射法将重组基因导入斑马鱼受精卵，经过聚合链式酶反应筛选及156h低溶氧胁迫试验，获得的转基因鱼的生存率为92％，对照鱼的生存率仅为65％，两者存在显著差异，转基因鱼具有耐受低溶氧胁迫能力。该重组基因应用于经济性养殖鱼类团头鲂和鲤鱼时，也同样增强了团头鲂和鲤鱼对低溶氧胁迫的耐受能力。这种遗传改良育种技术能广泛应用于培育具有耐受低溶氧胁迫能力的优良养殖鱼类新品种。
文档编号C12N15/85GK101696421SQ200910272539
公开日2010年4月21日 申请日期2009年10月27日 优先权日2009年10月27日
发明者朱作言, 林忠平, 管波, 胡炜, 胡鸢雷, 麻洪 申请人:中国科学院水生生物研究所;北京大学;